黃佳佳,江東文,楊 昭,李燕杰,徐振林

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510520;2.廣州市食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心,廣東廣州 510410;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

黃佳佳1,江東文2,楊 昭1,李燕杰1,徐振林3,*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510520;2.廣州市食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心,廣東廣州 510410;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

本文建立多壁碳納米管分散型固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定降糖類(lèi)保健食品中非法添加物羅格列酮的檢測(cè)方法,重點(diǎn)考察了樣品提取溶劑和提取時(shí)間、凈化劑類(lèi)型、組成、使用量和凈化時(shí)間對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明,樣品前處理最優(yōu)條件為:采用無(wú)水甲醇超聲提取20 min,經(jīng)多壁碳納米管(MWCNTs)和N-丙基乙二胺(PSA)凈化1 min。所建立的高效液相色譜法測(cè)定降糖類(lèi)保健食品中羅格列酮的線(xiàn)性范圍為1.0～50.0 μg/mL,相關(guān)系數(shù)為0.9997,檢出限和定量限分別是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為77.3%～93.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%。該樣品前處理方法簡(jiǎn)便、快速且成本較低,適用于批量保健食品中羅格列酮的快速檢測(cè)。

多壁碳納米管,分散型固相萃取,保健食品,羅格列酮,高效液相色譜

我國(guó)有數(shù)量較多的糖尿病、糖耐量異常人群,降糖藥物和相應(yīng)保健食品需求量大,一些不法商販在利益驅(qū)動(dòng)下,為增強(qiáng)產(chǎn)品功效,在降糖類(lèi)保健食品中非法摻入療效確切、價(jià)格低廉的降糖類(lèi)藥物。羅格列酮是一種口服抗高血糖藥物,能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性,控制血糖的生成、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用[1]。由于降糖效果明顯,作用強(qiáng)度大,也是目前市面上聲稱(chēng)輔助降糖類(lèi)保健食品中常見(jiàn)的違法添加的降糖西藥之一[2-3]。消費(fèi)者不知情而長(zhǎng)期服用非法摻入羅格列酮的保健食品,會(huì)引起一些毒副作用,如心血管系統(tǒng)和肝臟的不良反應(yīng),嚴(yán)重者危及生命[4-5]。因此建立快速、準(zhǔn)確、可靠的降糖類(lèi)保健食品中非法添加藥物羅格列酮的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前測(cè)定降糖保健食品中羅格列酮的方法主要有高效液相色譜法[6-9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]。降糖類(lèi)保健食品如膠囊、茶劑成分復(fù)雜,既有中藥成分,部分也含茶葉,其中一些雜質(zhì)(如色素)不僅會(huì)對(duì)色譜設(shè)備造成損害,而且會(huì)造成基質(zhì)效應(yīng),干擾目標(biāo)對(duì)象分析,導(dǎo)致樣品回收率低,影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度[13-14]。因此盡可能完全提取分析對(duì)象,同時(shí)除去共存的雜質(zhì),減少干擾物質(zhì),實(shí)現(xiàn)分析對(duì)象分離富集和基質(zhì)凈化,是檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中羅格列酮樣品前處理方法的關(guān)鍵。

多壁碳納米管分散型固相萃取(MWCNTs-dSPE)是近幾年發(fā)展的樣品前處理方法。其中多壁碳納米管(MWCNTs)是一種新型吸附材料,具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、萃取效率高、成本低和可重復(fù)利用等方面優(yōu)點(diǎn)[15]。因其比表面積大,具有快速吸附色素等雜質(zhì)的能力[16-17],目前已有研究將其作為凈化劑應(yīng)用于蔬菜、水果及茶葉農(nóng)藥殘留檢測(cè)的樣品前處理中[18-21]。相比較傳統(tǒng)固相萃取SPE,分散型固相萃取(dSPE)無(wú)需填充柱子和嚴(yán)格控制上樣及洗脫過(guò)程,而是直接將吸附材料加入含有目標(biāo)分析對(duì)象的樣品提取液中,在雜質(zhì)吸附模式下,吸附材料保留樣品中的雜質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)樣品基質(zhì)的凈化[22]。采用MWCNTs-dSPE快速簡(jiǎn)便,其作為樣品前處理方法應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的研究正迅速開(kāi)展[23-25]。本實(shí)驗(yàn)建立了基于MWCNTs-dSPE的高效液相色譜測(cè)定保健食品中非法添加藥物羅格列酮的方法,對(duì)于快速篩查保健食品中羅格列酮的殘留及保障保健食品質(zhì)量安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多壁碳納米管吸附劑(MWCNTs外徑10～20、20～40、40～60 nm) 購(gòu)于深圳納米港公司;N-丙基乙二胺(PSA) 購(gòu)于博納艾杰爾有限公司;鹽酸羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所;無(wú)水甲醇、乙腈 均為色譜純;乙酸銨 分析純;苦蕎茶、降糖茶、降糖膠囊 均為市售。

LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器,DGU-20A5R在線(xiàn)脫氣機(jī),LC-solution工作站) 日本島津公司;MX-S 渦旋混合器 上海大龍醫(yī)療器械有限公司;SY-800 數(shù)控超聲波清洗器 上海寧商超聲儀器有限公司;AUY 120電子天平 日本島津公司;GL-21M高速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器公司;S220酸度計(jì) 瑞士梅特勒托利多公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg置于10 mL的棕色容量瓶中,用無(wú)水甲醇定容,配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,4 ℃避光保存。使用時(shí),準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋,配制1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定,以各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo),溶液以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱:島津InterSustain C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.01 mol/L(pH5.5)的乙酸銨溶液(體積比56∶44);檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。

本實(shí)驗(yàn)比較流動(dòng)相乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液和甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液對(duì)目標(biāo)色譜峰形和響應(yīng)值的影響,同時(shí)考察pH5.5和pH6.0的乙酸銨溶液對(duì)改善色譜峰拖尾現(xiàn)象的效果。

1.2.3 羅格列酮的提取 以苦蕎茶進(jìn)行前期檢測(cè)方法的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),之后再將優(yōu)化方法運(yùn)用于其它樣品的檢測(cè)。具體過(guò)程如下:取羅格列酮添加濃度為50 μg/g的苦蕎茶樣品1.00 g于50 mL塑料離心管中,加入無(wú)水甲醇5 mL,渦旋混勻,室溫下超聲20 min(功率800 W,頻率40 kHz),以6000 r/min離心10 min,移取上清液于干凈的離心管中,待凈化后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.2.3.1 提取溶劑的選擇 按1.2.3提取過(guò)程,考察不同提取溶劑對(duì)樣品中羅格列酮回收率的影響。提取溶劑為無(wú)水甲醇和乙腈,其它提取條件不變。提取溶液待凈化后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.2.3.2 提取時(shí)間的選擇 按1.2.3提取過(guò)程,考察不同超聲時(shí)間對(duì)樣品中羅格列酮回收率的影響。超聲功率800 W,頻率40 kHz,時(shí)間分別為10、20和30 min,其它提取條件不變。提取溶液待凈化后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.2.4 樣品提取液凈化 對(duì)樣品提取液凈化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。分別考察凈化劑外徑、組成、用量及凈化時(shí)間對(duì)樣品中羅格列酮回收率的影響。具體過(guò)程如下:取上述提取液體3 mL于裝有組合凈化劑MWCNTs(10～20 nm,60 mg)和PSA(45 mg)的離心管中,渦旋混勻,振蕩1 min。將離心管置于離心機(jī)內(nèi),10000 r/min離心10 min。移取上清液,經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾,進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.2.4.1 凈化劑的選擇 考察單一凈化劑和組合凈化劑對(duì)樣品基質(zhì)凈化效果。按1.2.4凈化過(guò)程,3 mL樣品提取液分別使用MWCNTs(10～20 nm,60 mg)、PSA(45 mg)及MWCNTs(60 mg)和PSA(45 mg)進(jìn)行凈化處理,其它凈化條件不變。

對(duì)比不同外徑MWCNTs對(duì)樣品基質(zhì)凈化效果。按1.2.4凈化過(guò)程,分別考察外徑為10～20、20～40、40～60 nm的MWCNTs和PSA組合的凈化效果,其它凈化條件不變。

1.2.4.2 凈化劑使用量的確定 考察不同用量的MWCNTs和PSA對(duì)樣品基質(zhì)凈化效果和羅格列酮回收率的影響。按1.2.4凈化過(guò)程,MWCNTs和PSA的使用量如表1所示,其它凈化條件不變。

表1 MWCNTs和PSA用量

1.2.4.3 樣品凈化時(shí)間的選擇 在凈化劑使用量?jī)?yōu)化的條件下,考察凈化劑作用時(shí)間對(duì)羅格列酮回收率的影響。按1.2.4凈化過(guò)程,渦旋振蕩時(shí)間分別為1、2、3和4 min,其它凈化條件不變。

1.2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 苦蕎茶、降糖茶、降糖膠囊三種空白樣品(經(jīng)HPLC確認(rèn))分別平行取18份,每份1.00 g,分別添加25、50、75 μg/g三種標(biāo)準(zhǔn)品濃度,每個(gè)濃度平行6次實(shí)驗(yàn)。按1.2.3節(jié)和1.2.4節(jié)步驟進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

1.3 回收率計(jì)算

采用高效液相色譜檢測(cè),樣品提取條件優(yōu)化和加標(biāo)回收分別采用平行3次和6次實(shí)驗(yàn),使用excel軟件計(jì)算樣品中羅格列酮回收率,公式如下:

式(1)

式(2)

式中,C為經(jīng)高效液相色譜測(cè)定所得羅格列酮樣品提取液質(zhì)量濃度,單位為μg/mL;V為提取液體積,單位為mL;M為樣品質(zhì)量,單位為g;C1為經(jīng)高效液相色譜測(cè)定并計(jì)算所得樣品中羅格列酮質(zhì)量濃度,單位為μg/g;C2為羅格列酮理論添加質(zhì)量濃度,單位為μg/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相的組成、配比和pH會(huì)影響羅格列酮的色譜行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,使用流動(dòng)相體系為乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液時(shí)目標(biāo)對(duì)象峰形好,響應(yīng)值較甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液高,pH5.5的乙酸銨溶液對(duì)改善色譜峰拖尾現(xiàn)象效果更好。因此,本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液(pH5.5)作為流動(dòng)相,以體積比56∶44 混合,總流速為0.8 mL/min,在檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm條件下測(cè)定羅格列酮。

2.2 線(xiàn)性方程與檢出限

按1.2.2的色譜條件進(jìn)行分析,以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),如圖1所示,羅格列酮在1.0～50.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9997,以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限和定量限分別是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL。

圖1 羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard calibration curve of Rosiglitazone

2.3 羅格列酮的提取

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對(duì)比無(wú)水甲醇和乙腈對(duì)樣品中羅格列酮回收率的影響。如圖2所示,無(wú)水甲醇更有利于樣品中羅格列酮的提取。由于無(wú)水甲醇極性較乙腈大,對(duì)羅格列酮溶解性更好,所得樣品回收率較乙腈高。故本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)水甲醇溶液提取保健食品中的羅格列酮。

圖2 提取溶劑的選擇(n=3)Fig.2 The effect of extraction solvent(n=3)

2.3.2 提取時(shí)間的選擇 提取時(shí)間影響檢測(cè)對(duì)象的提取效率。用時(shí)較短無(wú)法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的充分提取,用時(shí)過(guò)長(zhǎng)不僅會(huì)導(dǎo)致溶劑的損失,同時(shí)樣品中的雜質(zhì)溶出量增加,影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同的超聲時(shí)間對(duì)羅格列酮回收率的影響,結(jié)果表明,超聲10 min以上樣品回收率均可達(dá)到80%左右,如圖3所示,為使得提取更充分,減小實(shí)驗(yàn)偏差,本實(shí)驗(yàn)選用20 min作為提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間的選擇(n=3)Fig.3 The effect of extraction time(n=3)

2.4 樣品提取液凈化

2.4.1 凈化劑的選擇 保健食品基質(zhì)復(fù)雜,既含中藥成分,茶劑中還含部分茶葉,使得樣品中不僅色素含量相對(duì)較高,同時(shí)還含有生物堿和多酚類(lèi)成分。相關(guān)研究表明,MWCNTs主要是去除基質(zhì)中的色素,PSA 有兩個(gè)氨基,能去除茶葉基質(zhì)中的有機(jī)酸、金屬離子、多酚類(lèi)物質(zhì)和一部分極性較大的色素等[26]。針對(duì)基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的樣品,兩種或兩種以上的凈化劑凈化效果較單一吸附劑凈化效果理想[27-28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)比無(wú)凈化處理的樣品,單獨(dú)使用MWCNTs或PSA凈化的樣品顏色變淺,而使用MWCNTs和PSA結(jié)合凈化樣品的顏色最淺(圖4所示)。色譜圖(圖5)中顯示使用MWCNTs和PSA結(jié)合凈化的樣品較未經(jīng)凈化和單獨(dú)使用MWCNTs凈化的樣品在雜質(zhì)峰數(shù)量均減少,響應(yīng)值下降,而對(duì)檢測(cè)對(duì)象羅格列酮影響小。

圖4 不同凈化劑處理的降糖茶提取液Fig.4 Hypoglycemic tea extract with different purifying agent注:A：未凈化;B：MWCNTs和PSA凈化;C：僅MWCNTs凈化;D：僅PSA凈化。

圖5 無(wú)凈化和經(jīng)凈化處理加標(biāo)苦蕎茶色譜圖Fig.5 The chromatogram of buckwheat tea with standard before and after purification 注:A：無(wú)凈化;B：經(jīng)MWCNTs凈化;C：經(jīng)MWCNTs和PSA凈化。

此外,不同MWCNTs外徑具有不同的比表面積,對(duì)樣品的凈化效果也有所差異[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比不同外徑MWCNTs凈化樣品基質(zhì)的效果,結(jié)果見(jiàn)圖6,外徑為10～20 nm(比表面積100～160 m2/g)的MWCNTs與PSA混合凈化效果最好,雜質(zhì)峰響應(yīng)值最小,而目標(biāo)對(duì)象羅格列酮不受影響。因此,本實(shí)驗(yàn)使用外徑為10～20 nm 的MWCNTs和PSA混合作為樣品凈化劑。

表2 不同凈化劑使用量的樣品回收率

2.4.2 凈化劑使用量的確定 凈化劑的使用量影響樣品回收率和基質(zhì)消除效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,MWCNTs使用量不斷增加將導(dǎo)致羅格列酮回收率下降,在MWCNTs使用量一定的條件下,增加PSA使用量對(duì)回收率影響較小。綜合考慮樣品回收率和基質(zhì)消除效果(圖7所示),實(shí)驗(yàn)5得到樣品凈化效果最好,凈化劑使用量相對(duì)較少,回收率較高,故本實(shí)驗(yàn)使用MWCNTs 20 mg和PSA 15 mg對(duì)1 mL樣品提取液進(jìn)行凈化處理。

2.4.3 凈化劑作用時(shí)間的確定 如圖8所示,凈化劑與樣品提取液作用時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)羅格列酮回收率影響不大,凈化效果良好,為提高樣品提取效率,本實(shí)驗(yàn)選用1 min作為樣品凈化時(shí)間。

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)3種不同的樣品中進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),分析加標(biāo)樣品計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見(jiàn)表3)。方法回收率范圍為77.3%～93.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為1.3%～6.4%,方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

圖6 不同外徑MWCNTs與PSA凈化加標(biāo)苦蕎茶樣品色譜圖Fig.6 The chromatogram of buckwheat tea with standard pretreated by different diameter of MWCNTs and PSA 注:A：外徑10～20 nm MWCNTs;B：外徑20～40 nm MWCNTs;C：外徑40～60 nm MWCNTs。

圖7 不同組合凈化劑作用的加標(biāo)苦蕎茶樣品色譜圖Fig.7 The chromatogram of buckwheat tea with standard pretreated by different purifying agent dosage注:A:MWCNTs 15 mg,B:MWCNTs 15 mg和PSA 30 mg,C:MWCNTs 20 mg和PSA 15 mg。

圖8 凈化時(shí)間的確定(n=3)Fig.8 The effect of cleaning time(n=3)

3 結(jié)論

降糖類(lèi)保健食品種類(lèi)多,成分復(fù)雜,樣品中基質(zhì)不僅會(huì)污染進(jìn)樣口、色譜柱和檢測(cè)器,而且會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)保健食品樣品前處理方法進(jìn)行改進(jìn)。樣品前處理采用無(wú)水甲醇超聲提取20 min,使用MWCNTs和PSA對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化。所建立的羅格列酮HPLC檢測(cè)方法流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L(pH5.5)的乙酸銨溶液,總流速為0.8 mL/min,羅格列酮檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm,方法的線(xiàn)性范圍為1.0～50.0 μg/mL,相關(guān)系數(shù)為0.9997,檢出限和定量限分別是0.02 μg/mL和0.06 μg/mL,樣品加標(biāo)平均回收率為77.3%～93.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%。實(shí)驗(yàn)所使用新型吸附材料MWCNTs具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,吸附能力強(qiáng)和成本低廉等方面特點(diǎn),應(yīng)用于樣品前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)便,凈化過(guò)程只需1步,樣品前處理40 min內(nèi)可完成。本方法快速、準(zhǔn)確,可滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)的需求,適用于基層大量樣品的快速篩查。

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Determination of illegal added rosiglitazone in dietary supplement by multi-walled carbon nanotubes dispersive solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography

HUANG Jia-jia1,JIANG Dong-wen2,YANG Zhao1,LI Yan-jie1,XU Zhen-lin3,*

(1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,China; 2.Guangzhou Technical Service Center for Drug Inspection and Review & Licensing,Guangzhou 510410,China; 3.College of Food,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

With the aim of developing an optimal sample pretreatment for the determination of illegal added rosiglitazone in dietary supplement,a method was developed using carbon nanotubes dispersive solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography(HPLC). Key parameters that affect impurity removal and recovery of samples were optimized including the sample extraction solvent and extraction time,the type,composition,amount of purifying agent and sample purifying time. The optimal sample pretreatment conditions were achieved as follows:samples were ultrasonically extracted for 20 min using absolute methanol,and. then cleaned up for 1 min with multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs)and N-propyl ethylenediamine(PSA)before analysis. The HPLC method established based on the optimized sample pretreatment conditions exhibited a good linear relationship from 1.0 to 50.0 μg/mL,with the correlation coefficient of 0.9997. The limit of detection and quantification was 0.02 and 0.06 μg/mL,respectively. The mean spike recovery rates for rosiglitazone in dietary supplement were in the range of 77.3%～93.2%,with relative standard deviations(RSD)less than 10%. This method was simple,rapid,low-cost and applicable for the determination of illegal added drug rosiglitazone in dietary supplement.

multi-walled carbon nanotubes;dispersive solid-phase extraction;dietary supplement;rosiglitazone;high performance liquid chromatography

2016-04-06

黃佳佳(1985-)，女，工程師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：ybhuang13@126.com。

*通訊作者:徐振林(1982-)，男，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：jallent@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401591)；廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院院級(jí)科研項(xiàng)目(2013YZ004)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000