孫殿欽,呂晨艷

(首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,北京 100069)

食源性鈣結合多肽的研究進展

孫殿欽,呂晨艷*

(首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,北京 100069)

鈣是維持人體生命活動所必需的常量元素。然而,我國居民膳食中鈣的攝入量僅為推薦攝入量的一半,傳統(tǒng)補鈣制劑存在生物利用率低等缺點,因此開發(fā)安全高效的補鈣制劑勢在必行。食源性鈣結合多肽因其天然性更為安全可靠,越來越成為研究的熱點。本文對常見的食源性鈣結合多肽及其分離純化、鑒定方法進行綜述,以尋找食源性鈣結合多肽的新路徑,以期為食源性鈣結合多肽的制備和開發(fā)提供參考。

鈣,營養(yǎng)制劑,分離純化,多肽,食源性

流行病學調查表明,在中國大陸,骨質疏松的患病率在6.6%～19.3%之間[1]。隨著我國人口老齡化程度加深,骨質疏松癥帶來的社會負擔也愈來愈沉重。骨質疏松癥重在預防,充足的鈣吸收是骨骼發(fā)育良好的重要條件。然而,2015年國家衛(wèi)生計生委發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告(2015)》指出:我國人群中鈣、鐵等營養(yǎng)素缺乏的問題依然存在[2]。因此,缺鈣仍然是我國居民中普遍存在的問題。

目前,市場上鈣制劑主要分為無機鈣、有機酸鈣制劑和氨基酸螯合鈣制劑等,然而這些鈣制劑都存在一定的缺陷,如無機鈣制劑易刺激胃腸道且生物效價低,有機酸鈣溶解度大易流失且成本高,氨基酸螯合鈣存在潛在的安全問題,長期服用可能會引起人體的負氮平衡[3-4]。因此,開發(fā)一類安全高效的補鈣制劑是目前亟待解決的問題。近年來,隨著研究的深入,從食品中提取出的一些生物活性肽和蛋白質已引起研究者的普遍關注。食源性鈣結合多肽是一類具有鈣結合特性的活性肽,其可通過酶解食品中的蛋白質得到,可應用于功能食品以補充人體鈣質。此外,有毒性評價實驗表明活性肽為實際無毒類物質[5],安全可靠。

1 常見的食源性鈣結合多肽

1.1 酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPPs)

CPPs是牛乳酪蛋白經酶水解得到的生物活性多肽。CPPs分布于β,αs1,αs2酪蛋白的不同區(qū)域,不同的酶作用于酪蛋白則生成不同的CPPs,CPPs的相對分子質量和磷酸解離常數(shù)也不同。然而,這些CPPs都含有一段特殊序列即-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-,構成一個酸性區(qū)域(圖1)[6]。這個酸性區(qū)域是金屬離子尤其是Ca2+結合的主要區(qū)域,也是其發(fā)揮生物活性必不可少的部分。在小腸后段pH為7～8的條件下,酸性區(qū)域中的磷酸基團參與構成的β折疊帶有高密度負電荷,CPPs以離子鍵與Ca2+結合形成可溶物,從而有效阻止磷酸鈣沉淀的形成。據(jù)報道,pH為7.40時,每摩爾CPP可以結合(2.44±0.01) mol Ca2+[7]。

圖1 酪蛋白中磷酸化多肽的氨基酸序列[6]Fig.1 Amino acid sequence of the casein derived phosphopeptides[6]

大量的體內體外實驗證明CPPs具有促進鈣吸收的功效[8],但是,目前CPPs促進鈣吸收的機制仍不清楚。一些研究學者認為CPPs主要是與鈣結合成可溶性復合物,從而促進鈣在小腸下段通過細胞旁途徑被動擴散吸收[9]。此外,也有研究表明CPPs可以作用于細胞膜上的離子通道而影響鈣離子的轉運[10]。然而,在體內實驗中,Teucher等人通過15位成年人參與的隨機交叉實驗得出:在排除CPPs-Ca提供的鈣源影響后,CPPs對人體鈣的吸收并無幫助[11]。這可能是由于CPPs來源、劑量、制備純化工藝的差異,體內一些螯合劑,如草酸、單寧酸對鈣吸收的影響以及實驗對象體質健康情況的不同造成的。例如,CPPs對全麥粥中鈣的吸收沒有促進作用可能是因為食物中植酸的影響[12]。同時,CPPs與Ca的比例以及CPPs磷酸絲氨酸殘基的數(shù)量和位置也會影響CPPs促進鈣吸收的效果[13-14]。由此可見,CPPs對鈣吸收的促進作用會受到多種因素的影響,只有進一步闡明其作用機理,才能充分利用CPPs促進鈣吸收的功效。

此外,CPPs對鐵、鋅等礦物元素的吸收利用也有促進作用,這也是其優(yōu)于其他補鈣制劑的特性之一[15]。最重要的是,CPPs通過了毒理學評價,被認為是可以安全食用的實際無毒物質[16]。因此,CPPs作為補鈣制劑在食品領域擁有廣闊的發(fā)展前景。

1.2 卵黃高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptides,PPPs)

卵黃高磷蛋白(Phosvitin,PV)是禽類卵黃中一類磷酸化糖蛋白,是已知蛋白中磷酸化程度最高的蛋白質。PV的氨基酸序列如圖2所示,PV中大約55%的氨基酸為絲氨酸,其中近80%的絲氨酸被磷酸化[17]。磷酸化絲氨酸以成串形式存在,最多串聯(lián)可達14個,形成的多聚磷酸化絲氨酸區(qū)域即為卵黃高磷蛋白的核心(圖2)。Ishikawa等研究發(fā)現(xiàn)PV使雞蛋中Fe、Ca、Mg等金屬離子的生物利用度明顯降低,這可能是由金屬離子與PV結合形成不溶物而引起的[18]。然而,研究發(fā)現(xiàn)其酶解產物卵黃高磷蛋白磷酸肽(PPPs)有促進金屬離子吸收的作用[19]。PPPs的分子大小會影響其與Ca2+結合的能力,相比CPPs,分子質量為1～3 ku的PPPs結合鈣的能力更強[20]。由此可見,PPPs作為補鈣制劑有很大的開發(fā)潛力。然而,PPPs在體內外的吸收情況及其安全性還有待進一步研究。

圖2 卵黃高磷蛋白一級結構示意圖[21]Fig.2 Schematic of phosvitin primary structure[21]

1.3 大豆肽(soybean protein hydrolysates,SPHs)

除了磷酸化的絲氨酸殘基可以與鈣結合外,蛋白質或多肽也可以通過谷氨酸、天冬氨酸殘基的羧酸基團結合鈣而發(fā)揮促進鈣吸收的作用[22]。占大豆蛋白質組成34%的11S大豆球蛋白(Glycinin)含有大量谷氨酸和天冬氨酸(圖3)。前期研究表明,SPHs具有結合鈣形成可溶復合物的能力,SPHs相對分子質量越大可以結合的鈣越多[23]。此外,在Caco-2細胞模型上,SPHs-Ca復合物可以促進鈣的吸收[23]。在大鼠模型上,SPHs也可以促進鈣在大鼠腸道中的吸收[24]。與此同時,研究還發(fā)現(xiàn)SPHs-Ca復合物對快速生長的大鼠的骨質積累有著積極影響[25]。

目前,Lv等人利用固定金屬離子親和色譜法(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)證明SPHs的鈣結合能力與氨基酸組成有關:在SPHs與鈣結合時谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和脯氨酸可能扮演了重要角色[26]。并且,Liu等人的研究表明大豆肽的聚合對其鈣結合能力也有重要影響[27]。然而,SPHs-Ca復合物在人體的吸收機制還不清楚,有待深入研究。

1.4 其他

我國蘊藏著豐富的漁業(yè)資源,連續(xù)十幾年水產品總量位居世界第一。然而我國水產加工比例仍然較低,無法直接食用的魚卵、魚鱗、魚骨等被廢棄,造成資源的極大浪費。前期學者對水產品的加工進行了大量的研究,其中便有研究者從水產品中分離純化出鈣離子結合肽,為天然肽鈣制劑的制備提供了更多的選擇,表1進行了部分列舉。并且,研究人員通過大鼠實驗證實來自羅非魚魚鱗、長尾鱈骨干、鯉魚卵的蛋白水解產物都具有和CPPs相當?shù)拇兮}吸收的能力[28-30],具備開發(fā)成補鈣制劑的潛能。

最近,研究人員還在乳清蛋白、牛血清蛋白和大麥的蛋白水解產物中分離提取到了鈣結合多肽[31-33]。然而,它們對生物體鈣吸收的影響還有待進一步的研究。除此之外,研究人員還從植物中分離純化了天然高鈣結合蛋白:石榴種子III型幾丁質酶和水溶性葡萄籽11S球蛋白[34-35],這拓寬了天然植源性補鈣劑的來源,為不同飲食習慣的人提供了更多的選擇。

2 食源性鈣結合多肽的分離純化

蛋白水解酶和酶解條件的選擇是影響活性肽生理功能和產率的重要因素。

表1 來源于水產品的鈣結合多肽

表2 食源性鈣結合多肽分離純化常用色譜及其特點

目前,在篩選蛋白水解酶時,主要通過利用不同性質的水解酶進行酶解,跟蹤測定水解度以及目標活性,最終確定所用酶。但此法存在一定的盲目性,需要花費大量時間,不適用于大規(guī)模篩選食源性蛋白質和所需酶。一些研究者利用生物信息學技術對蛋白水解酶的篩選進行了優(yōu)化,如彭等利用模擬酶切軟件peptidecutter,對已知序列的酪蛋白進行模擬酶切并建立酶解肽庫,以生成的寡肽數(shù)量為指標初步選出適用酶,節(jié)約了成本和時間[41]。Raus等利用模擬酶切軟件protein cutter對蛋白質進行酶切,并對所獲得的肽段相對分子質量、等電點、氨基酸組成以及疏水性進行了分析[42]。這提示模擬酶切數(shù)據(jù)庫在活性肽來源蛋白質的篩選和食源性鈣結合多肽的酶解優(yōu)化中可發(fā)揮更大作用。

從水解產物中得到鈣結合多肽需要通過一系列的色譜分離方法進行純化。這些色譜分離方法主要包括固定化金屬親和色譜法(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)、凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography,GPC)、離子交換色譜法(ion exchange chromatography,IEC)、反相高效液相色譜法(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)和羥基磷灰石色譜法(hydroxyapatite affinity,HA),這些方法的原理、優(yōu)點和局限性如表2所示。

實際應用中,單一的分離方法很難達到預期分離效果,往往需要充分利用樣品分子的各種理化特性,通過多種不同的色譜分離機制,在每一個分離維度上都盡量達到較好的分離效果,從而有效降低樣品的復雜程度。如Chen等人聯(lián)用HA、GPC以及RP-HPLC從羅非魚魚鱗蛋白的水解產物中提取到較純的鈣結合多肽[29]。由于目標多肽是具有鈣結合特性的活性肽,研究人員多選用IMAC和HA作為色譜分離的第一步[26,37,40],同時,IMAC和HA都是溫和、非變性的色譜分離方法。Zhang等運用磁性硫酸軟骨素鈉取代IMAC的固體基質部分,得到與傳統(tǒng)提純方法相比更高純度的PPPs,并且避免了有機溶劑的使用[43]。而IEC和GPC作為傳統(tǒng)可靠的色譜分離方法,在食源性鈣結合多肽的分離純化中被廣泛運用,其往往被用于IMAC和HA之后,依據(jù)帶電性質和相對分子質量大小對樣本進行分離[44]。

近年來,液相色譜-串聯(lián)質譜以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜也開始逐漸應用到食源性鈣結合多肽的結構鑒定,并輔以質譜數(shù)據(jù)解析軟件protein pilot極大的提高了結構鑒定效率[26,29]。該技術將高效液相色譜的強分離性能與質譜的強定性優(yōu)勢相結合,適用于復雜食源性蛋白酶解產物的分離和鑒定。Sabine L等驗證了液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術分離復雜樣品中較小相對分子質量多肽的可行性[45]。Ren等也運用液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用和質譜多反應監(jiān)測技術高效鑒定出卵黃高磷蛋白酶解產物中32個含十個以上磷酸基團的鈣結合多肽[46]。

由于食源性蛋白酶解產物組分復雜,而且相對分子質量相近或帶電性質相似的肽段難以進行分離純化,給后續(xù)的結構鑒定帶來了巨大的難題。現(xiàn)有方法存在工作量大,純化過程會影響活性肽的性能等缺點。因此,食源性鈣結合多肽的高效純化與結構鑒定是獲得高活性目標肽的研究瓶頸之一。

3 食源性鈣結合多肽的鑒定

食源性鈣結合多肽的鑒定方法主要是酶解、超濾、多維色譜、串聯(lián)質譜等,過程復雜,并且存在一定的盲目性。近年來隨著生物信息學的發(fā)展,其研究工具在多個領域逐漸被廣泛地運用。在生物活性肽領域,研究者們借鑒定量構效關系(quantitative structure activity relationship,QSAR)、模擬酶切軟件和肽數(shù)據(jù)庫等生物信息學工具進行了有益的探索[47]。鄒等人運用模擬酶切軟件對菜籽蛋白進行酶切后得到樣品肽集,通過QSAR模型預測肽的IC50值進行初篩,結合NANO-Q-TOF質譜技術尋找出6條目標多肽,并將目標多肽與血管緊張素轉化酶的Zn2+活性中心進行水合分子對接,篩選出一條未報道過的高活性血管緊張素轉化酶抑制肽[48]。這為食源性鈣結合多肽的開發(fā)提供了新思路:研究者可運用計算機模擬酶切軟件得到肽集,結合分子對接以及QSAR模型對多肽活性進行預測和篩選,并通過質譜技術對水解液中的多肽進行鑒定,尋找篩選出的目標多肽。這一方法將大大提高篩選食源性鈣結合多肽的效率,降低技術成本。

到目前為止,雖已有大量食源性鈣結合多肽的序列被闡明,但食源性鈣結合多肽沒有固定結構,其QSAR模型仍未建立。目前認為,鈣結合多肽的鈣結合位點主要有磷酸基團-鈣和羧基-鈣兩種模式。磷酸基團-鈣結合模式的代表肽為酪蛋白磷酸肽和卵黃高磷蛋白磷酸肽,磷酸絲氨酸殘基占二者氨基酸組成的較大比重。當對CPPs和PPPs進行脫磷處理,其結合鈣活性基本喪失,充分說明磷酸絲氨酸殘基在肽鈣結合中發(fā)揮的重要作用[49]。大豆肽是羧基-鈣結合模型的代表肽,11S大豆球蛋白(Glycinin)含有大量谷氨酸和天冬氨酸。Bao認為谷氨酸和天冬氨酸的羧基是大豆肽與鈣的結合位點[50],而Lv的研究表明,在SPHs與鈣結合時谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和脯氨酸可能扮演了重要角色[26]。除氨基酸組成外,多肽相對分子質量的大小也會影響其鈣結合能力[20]。然而,到目前為止,關于鈣結合多肽的構效關系還沒有公認的結論,有待進一步研究。

4 展望

近年來,關于食源性鈣結合肽的研究有了較大進展。越來越多食源性鈣結合多肽被發(fā)現(xiàn),這為闡明其構效關系奠定了基礎,也預示著鈣結合多肽在營養(yǎng)食品領域擁有廣闊的發(fā)展前景。然而,食源性鈣結合多肽作為補鈣制劑推廣仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前,雖已在動物身上進行多次實驗以驗證食源性鈣結合多肽的補鈣效果[24-25,28-30],其對人體鈣吸收的影響仍缺乏大規(guī)模的臨床證據(jù)。此外,生物信息學技術的發(fā)展為高效尋找高活性食源性鈣結合多肽開辟一條新途徑,也為食源性鈣結合多肽的純化和鑒定提供工具支持。因此,開展臨床實驗以驗證食源性鈣結合多肽補鈣效果,借鑒先進工具以推動鈣結合多肽構效關系的闡明和工業(yè)化生產,是未來研究發(fā)展的方向。

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Research progress of calcium-binding peptides from foodstuffs

SUN Dian-qin,LV Chen-yan*

(School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

Calcium is an essential element of the human body,and plays a significant role in health. However,the dietary intake of calcium in China is only half of the recommended intakes. Considering the low bioavailability of traditional calcium supplements,developing the safe and efficient calcium supplements is imperative. Calcium-binding peptides from foodstuffs are safer and more reliable,which have caused the extensive concern of researchers. In this review,several typical calcium-binding peptides from foodstuffs,and methods of purification,identification and structural analysis had been summarized,which would provide reference for the application of calcium-binding peptides in functional food.

calcium;supplement;isolation and purification;peptide;from foodstuffs

2016-07-08

孫殿欽(1996-)，男，本科生，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail:mr_sped@126.com。

*通訊作者:呂晨艷(1988-)，女，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail:lvchenyan1010@163.com。

首都醫(yī)科大學優(yōu)秀青年教師國內交流項目。

TS201.4

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000