楊 靖,呂 瑞,鄧俊華

(1.中科院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所,四川成都 610041;2.綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,四川綿陽 621000)

雙水相萃取法分離魚腥草總黃酮的研究

楊 靖1,呂 瑞2,*,鄧俊華2

(1.中科院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所,四川成都 610041;2.綿陽師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,四川綿陽 621000)

利用聚乙二醇(PEG)-硫酸銨雙水相體系對魚腥草總黃酮進行萃取分離。通過單因素實驗分別考察了PEG分子量、兩相質(zhì)量比、萃取溫度、萃取pH對分離提取魚腥草中總黃酮的影響,并用正交實驗優(yōu)化了萃取工藝。經(jīng)優(yōu)化后,魚腥草總黃酮在以mPEG800∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0為雙水相體系,萃取pH為3.0,水浴溫度為50 ℃時,萃取率可高達98.96%。本方法簡單高效,綠色環(huán)保,可為魚腥草總黃酮的高效利用提供參考。

雙水相萃取,魚腥草,總黃酮,正交實驗法

魚腥草(HouttuyniacordataThunb)又名側(cè)耳根、臭草、蕺菜,是三白草科蕺菜屬多年生草本植物,是一種集營養(yǎng)、保健、藥用功能于一體的藥食兩用植物,具有抗氧化,抗炎,抗病毒,抗癌等功效[1]。文獻記載,魚腥草中含有大量的黃酮類化合物,如蘆丁,槲皮苷,金絲桃苷等[2],魚腥草的抗癌作用也主要源于其富含的黃酮類化合物[3]。由于黃酮類化合物在人體無法直接合成,因此,如何從植物中提取分離得到黃酮類化合物,成為研究者們關(guān)注的問題。

目前,對于魚腥草中黃酮類化合物分離方法主要有大孔樹脂吸附法、聚酰胺吸附法、固相萃取法等[4],其中大孔樹脂吸附法因其吸附容量大,速度快,分離效果好而被廣泛使用[5-7],但此方法操作繁瑣,工業(yè)化成本較高。雙水相萃取法是利用組分在兩個互不相溶的水相中溶解度不同而進行分離的一種新興萃取技術(shù),其不僅操作簡便,萃取條件溫和,而且易于工業(yè)放大。在天然產(chǎn)物提取分離領(lǐng)域,雙水相萃取法已經(jīng)應(yīng)用于蒲公英總黃酮[8]、蘑菇多糖[9]、甘草酸[10]、生物堿[11]等活性成分的提取與分離中。但至今尚未見其應(yīng)用于魚腥草中黃酮類化合物萃取分離的報道。因此,筆者利用經(jīng)典的聚乙二醇(PEG)-硫酸銨雙水相體系對魚腥草總黃酮進行萃取分離,并通過正交實驗對萃取方案進行了優(yōu)化篩選,為雙水相萃取體系的推廣應(yīng)用以及魚腥草總黃酮資源的高效開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草 鮮草于2015年3月購于四川綿陽本地市場,經(jīng)綿陽師范學(xué)院天然產(chǎn)物研究中心邊清泉教授鑒定為三白草科蕺菜屬植物魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)的地上部分;蘆丁標準品 中國食品藥品檢定所,批號:100080-201409,純度:92.6%;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、硫酸銨、聚乙二醇(PEG)平均相對分子質(zhì)量分別為400,600,800,1000,8000 均購自成都科龍化工試劑廠分析純試劑;實驗用水 為二次蒸餾水。

EL-104電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司,精度:0.1 mg;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市岸頭良友實驗儀器廠;T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器責(zé)任有限公司;SB4200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司;雷磁PHSJ-4F pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚腥草提取液的制備 將魚腥草莖葉用二次蒸餾水洗凈,于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥烘干12 h,粉碎后過80目篩。準確稱取4.0000 g過篩后樣品于錐形瓶中,按料液比1∶25加入100 mL 60%乙醇,充分振蕩后于60 ℃下超聲萃取45 min,減壓抽濾,濾液以60%乙醇定容至100 mL,得魚腥草提取液。

1.2.2 魚腥草總黃酮的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制 將20.00 mg蘆丁溶解并定容于25.00 mL 60%乙醇溶液中,搖勻得0.8000 mg/mL的蘆丁標液。分別準確移取蘆丁標液 0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00 mL,置于25.00 mL比色管中,加5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL,搖勻,在室溫下放置6 min后再加10%硝酸鋁溶液1.00 mL,搖勻并放置6 min,再加入4%氫氧化鈉10.00 mL,搖勻,用60%乙醇定容,放置15 min后于510 nm處分別測定各樣品的吸光度,以60%乙醇代替蘆丁標液做空白對照。以吸光度-濃度作圖,得標準曲線。

1.2.2.2 魚腥草總黃酮的測定 將一定質(zhì)量的PEG與硫酸銨加入10.0 mL離心管中,加水至8.0 mL,再加入2.0 mL魚腥草提取液,用橡膠塞塞住管口,充分振蕩搖勻后放入恒溫水浴鍋中,水浴30 min后取出,記下上、下兩相體積。分別吸取上、下相溶液于25.00 mL比色管中,按照1.2.2.1項下方法顯色后用紫外分光光度計測定各樣品的吸光度,以標準曲線得到上、下相濃度。根據(jù)下述公式計算黃酮化合物的萃取率:

R=Vup/Vlow

K=Cup/Clow

Y=CupVup/(CupVup+ClowVlow)

式中：R為相體積比,Vup,Vlow分別為上下相體積,K為黃酮類化合物的分配系數(shù),Cup,Clow分別為黃酮類化合物在上下相的濃度,Y為黃酮類化合物的萃取率。

1.2.3 方法可行性 為考察雙水相萃取法分離魚腥草總黃酮的可行性,將2.0 mL魚腥草提取液和萃取后的上、下相溶液分別置于三支25.00 mL比色管中,按照1.2.2.1項下方法顯色后進行紫外光譜掃描。

1.2.4 精密度實驗 取2.0 mL魚腥草提取液,于mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0雙水相體系中,按照1.2.2項下方法平行實驗6次,測定上相溶液中總黃酮濃度,計算RSD。

1.2.5 準確度實驗 取9份魚腥草提取液各2.0 mL,加入不同量的蘆丁對照品溶液,于mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0雙水相體系中,按1.2.2項下方法進行實驗,測定上相溶液中總黃酮濃度,并計算方法的加標回收率。

1.2.6 單因素實驗設(shè)計

1.2.6.1 PEG種類對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.2項下方法,分別以PEG400,PEG600,PEG800,PEG1000,PEG8000和硫酸銨組成雙水相體系,mPEG∶m(NH4)2SO4為2.0∶2.0,于40 ℃,pH為4.0下進行實驗,測定魚腥草總黃酮在不同條件下的萃取率。

1.2.6.2 溫度對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.2項下方法,以mPEG400∶m(NH4)2SO4為2.0∶2.0作為雙水相體系,控制pH為4.0,分別于30,40,50,60,70 ℃溫度下進行實驗,測定魚腥草總黃酮在不同條件下的萃取率。

1.2.6.3 mPEG∶m(NH4)2SO4質(zhì)量比對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.2項下方法,以PEG400和硫酸銨作為雙水相體系,分別以mPEG∶m(NH4)2SO4為2.0∶1.8,2.0∶2.0,2.0∶2.2,2.0∶2.4,2.0∶2.6,于40 ℃,pH為4.0下進行實驗,測定魚腥草總黃酮在不同條件下的萃取率。

1.2.6.4 pH對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.2項下方法,以mPEG400∶m(NH4)2SO4為2.0∶2.0作為雙水相體系,用HCl或NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH,分別在pH為2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,溫度為40 ℃的條件下進行實驗,并測定魚腥草總黃酮在不同條件下的萃取率。

1.2.7 正交實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上選擇較優(yōu)條件進行四因素三水平L9(34)的正交實驗,優(yōu)化萃取工藝,因素水平表如表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.8 驗證實驗 準確稱取烘干并粉碎后的魚腥草150 g于圓底燒瓶中,按料液比1∶25加入60%乙醇,充分振蕩后于60 ℃下超聲萃取45 min,減壓抽濾得魚腥草提取液。按照1.2.2項下方法分別在正交優(yōu)化條件和正交表中最優(yōu)條件下進行驗證實驗,每個條件下平行實驗三次,得平均萃取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法可行性分析

表2 加標回收實驗結(jié)果

由圖1中可知,魚腥草總黃酮經(jīng)雙水相萃取后,在上相中吸光度明顯提高,說明本方法可用于魚腥草總黃酮的分離。

圖1 萃取前后魚腥草總黃酮的紫外吸收光譜比較Fig.1 The comparison of total flavonoids UV spectrogram before and after extraction

2.2 標準曲線的繪制

掃描紫外光譜得試樣的最大吸收波長為510 nm,將1.2.2.1項下溶液依次用紫外分光光度計測其吸光度,以吸光度-濃度作圖得標準曲線回歸方程為A=3.4215C-0.0007(R2=0.9993),說明在濃度0.03200～0.1600 mg/mL范圍內(nèi),該標準曲線線性關(guān)系良好,可以作為含量測定的標準參照。

2.3 精密度實驗

按照1.2.4項下方法進行實驗,得上相溶液濃度的RSD為0.22%,說明本方法精密度良好。

2.4 準確度實驗

按照1.2.5項下方法進行實驗,所得結(jié)果見表2。由結(jié)果可知,平均回收率為97.48%,RSD均小于1.50%,說明本方法準確度較高。

2.5 單因素實驗

2.5.1 PEG種類對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.6.1項下方法進行實驗,考察PEG種類對萃取率的影響,結(jié)果如圖2。

圖2 不同平均分子量PEG對萃取率的影響曲線圖Fig.2 Effect of extraction ratio on average molecular mass of PEG

由圖2可知,隨著PEG平均分子量的增大,黃酮類化合物的萃取率逐漸減小。研究表明,魚腥草中的黃酮類化合物主要為黃酮醇類[12],具有一定極性,而隨著PEG分子量的增大,其端基數(shù)目減小,疏水性增強,因此PEG分子量越大,越不利于魚腥草中黃酮類化合物的萃取。此外,實驗發(fā)現(xiàn)隨著PEG分子量增大,溶液的黏度也隨之增大,導(dǎo)致溶液分相變得困難。因此,在其他條件不變的情況下,PEG平均分子量越小,親水性越強,魚腥草總黃酮的萃取率越高,PEG分子量為400時萃取率最高,故選取PEG分子量分別為400,600,800作為正交實驗三水平。

2.5.2 溫度對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.6.2項下方法考察溫度對萃取率的影響,結(jié)果如圖3。

圖3 溫度對萃取率的影響曲線圖Fig.3 Effect of extraction ratio on temperature

由圖3可知,當(dāng)溫度由30 ℃遞增到70 ℃時,萃取率先升高后降低,在40 ℃時萃取率達到最大,繼續(xù)升高溫度,萃取率反而降低。由于溫度對雙水相體系的熱力學(xué)平衡有顯著的影響,溫度升高會加速相分離的速度,有利于雙水相的形成,但升高溫度又會增大PEG的溶解度,使得萃取率反而降低[13]。水浴溫度為40 ℃時魚腥草總黃酮的萃取率最高,故選擇溫度為30,40,50 ℃作為正交實驗三水平。

2.5.3 mPEG∶m(NH4)2SO4質(zhì)量比對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.6.3項下方法考察質(zhì)量比對萃取率的影響,結(jié)果如圖4。

圖4 質(zhì)量比對萃取率的影響曲線圖Fig.4 Effect of extraction ratio on mass ratio of the two phase

在雙水相體系中,無機鹽的正、負離子在兩相間分配系數(shù)不同,使得兩相間形成電位差,從而影響化合物在兩相之間的分配[14]。在本研究中,隨著硫酸銨質(zhì)量的增大,萃取率先增大后減小,這是由于鹽濃度的增加,其奪取水分子的能力增強,導(dǎo)致下相體積增大,相比減小,從而影響目標化合物在上相中的分配,且實驗發(fā)現(xiàn),硫酸銨質(zhì)量過大,其在下相中會趨于飽和而進一步析出,不利于確定雙水相體系的組分比,兩相質(zhì)量比為2.0∶2.0時魚腥草總黃酮的萃取率最高。因此,選擇2.0∶2.0,2.0∶2.2,2.0∶2.4的質(zhì)量比作為正交實驗三水平。

表4 各因素顯著性分析

注:**表示有顯著影響,*表示有一定的影響。2.5.4 pH對魚腥草總黃酮萃取率的影響 按照1.2.6.4項下方法考察pH對萃取率的影響,結(jié)果如圖5。

圖5 pH對萃取率的影響曲線圖Fig.5 Effect of extraction ratio on pH value

pH是萃取魚腥草總黃酮的一個至關(guān)重要的參數(shù)。pH不同,使得雙水相體系中兩相的電位差不同,不僅影響上下兩相的體積比,也影響各種待分離成分在上下相的分配[15]。本實驗發(fā)現(xiàn),整個萃取分離體系應(yīng)保持弱酸性環(huán)境。這是由于,一方面硫酸銨在堿性條件下容易水解,影響雙水相體系的穩(wěn)定性;另一方面,從黃酮類化合物的活性考慮,堿性環(huán)境易破壞黃酮的母核結(jié)構(gòu),使黃酮化合物活性喪失[16]。加之酸性太強體系不易分層。因此,選擇pH在2.0到7.0的范圍內(nèi)考察pH對魚腥草總黃酮萃取率的影響。由圖4可以看出,當(dāng)pH由2.0遞增到7.0時,萃取率先升高后降低,在pH為4.0時萃取率達到最大。選擇pH為3.0,4.0,5.0作為正交實驗三水平。

2.6 正交實驗

選取各單因素實驗中較優(yōu)條件進行L9(34)正交實驗,正交實驗結(jié)果見表3,方差分析見表4。

表3 正交實驗結(jié)果表

從結(jié)果可知,9組數(shù)據(jù)中,A1B1C1D1的萃取率最高,達到99.66%。由正交實驗極差(R)可得,影響魚腥草中黃酮萃取率因素的主次順序為:質(zhì)量比(B)>pH(C)>PEG分子量(A)>溫度(D)。由此,得到最佳萃取條件為A3B1C1D3,即PEG平均分子量為800,PEG與硫酸銨的質(zhì)量比為2.0∶2.0,pH為3.0,水浴溫度為50 ℃。

在方差分析中,由于溫度因素的均方差遠小于其他三種因素的均方差,則在該因素影響可以忽略不計時,當(dāng)作為誤差。分析結(jié)果表明,PEG與硫酸銨的質(zhì)量比和pH對魚腥草總黃酮的萃取率有顯著影響,PEG種類對魚腥草總黃酮萃取率有一定的影響。根據(jù)F值可得影響魚腥草總黃酮萃取率的因素按從大到小的順序依次為:PEG與硫酸銨的質(zhì)量比,pH,PEG種類,溫度。這與極差分析結(jié)果一致。

2.7 驗證實驗

按1.2.8項方法進行驗證實驗,得平均萃取率,見表5。

表5 驗證實驗結(jié)果表

由表5可知,在優(yōu)化后的最佳條件下,魚腥草提取液中總黃酮的萃取率為98.96%,RSD為0.67%(n=3)。由于該條件下的萃取率略高于實際條件下魚腥草提取液中總黃酮的萃取率,證明所選條件的合理性,達到了優(yōu)化的目的。

3 結(jié)論與討論

本研究以PEG-硫酸銨作為雙水相體系萃取魚腥草提取液中的黃酮類化合物,通過單因素實驗考察了PEG分子量、兩相質(zhì)量比、萃取溫度、萃取pH對萃取率的影響,后采用正交實驗優(yōu)化得到了最佳萃取方案,即以mPEG800∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0作為雙水相體系,調(diào)節(jié)pH為3.0,于50 ℃下水浴30 min,該條件下黃酮類化合物的萃取率能高達98.96%,本方法精密度良好,準確度較高,為魚腥草總黃酮的提取分離提供了新的參考。

有研究表明[12],魚腥草中的黃酮類化合物主要為黃酮醇類化合物,包含槲皮素、蘆丁、金絲桃苷等,這些化合物中存在共軛體系且為平面型分子,分子間作用力大,在水中的溶解度較小,而PEG作為一種高分子化合物,不僅無毒環(huán)保,且與這類化合物具有較好的相容性,因此,本研究選取PEG-硫酸銨作為雙水相體系,將魚腥草中黃酮類化合物富集于PEG相,實現(xiàn)了分離提取。富集后的黃酮類化合物可通過離子交換柱交換、吸附、洗脫后得到,也可使用分子篩,將較低分子量的目標物質(zhì)留在分子篩內(nèi)部,而高分子聚合物則隨著流動相被洗脫除去,從而得到目標化合物[17]。本方法具有操作簡單,條件溫和,易于工業(yè)放大等優(yōu)勢,可為魚腥草中黃酮類化合物的提取分離提供新的途徑。但本研究在應(yīng)用過程中,仍存在易乳化,水溶性高聚物粘度較大,回收較為困難等問題。因此,下一步可嘗試改用粘度較低、易于揮發(fā)的極性有機溶劑-鹽體系進行萃取,以解決后期溶劑回收的問題。

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Optimization of aqueous two-phase extraction of total flavonoids fromhouttuyniaecordatathunb.

YANG Jing1,LV Rui2,*,DENG Jun-hua2

(1.Institute of Mountain Hazards and Environment,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China; 2.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Mianyang Teacher’s College,Mianyang 621000,China)

To separate the total flavonoids fromHouttuyniaecordataThunb by aueous two-phase systems composed of polyethylene glycol(PEG)and phosphate salts,an orthogonal experimental design method was applied to evaluate the influence of the average molecular mass of PEG,mass ratio of the two phases,temperature and pH value on total flavonoids extraction. The extraction rate was achieved 98.96% under the optimal conditions:mPEG400∶m(NH4)2SO4=2.0∶2.0,temperature was 50 ℃,pH was 3.0. The result indicated that,the aqueous two-phase extraction was simple,high quality and environment friendly,and also can apply some useful information for the efficient use of the total flavonoids inHouttuyniaecordataThunb.

aqueous two-phase extraction;HouttuyniaecordataThunb.;total flavonoids;orthogonal experimental method

2016-07-07

楊靖(1985-)女，碩士，實驗師，研究方向：化學(xué)分析，E-mail:yangjing@imde.ac.cn。

*通訊作者:呂瑞(1986-)女，碩士，講師，研究方向：中藥分離分析，E-mail：renny8160@163.com。

TS201.1

B

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000