張 靜,陳浩然,王笑穎,成毓凇,潘 磊,李 良

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

花蕓豆多肽提取工藝的研究

張 靜,陳浩然,王笑穎,成毓凇,潘 磊,李 良*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

研究以花蕓豆為原料,用堿性蛋白酶水解制備花蕓豆多肽,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,通過正交實(shí)驗(yàn)對酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、加酶量等酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:制備花蕓豆多肽的最佳工藝條件:酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間4 h、加酶量2000 U/g、pH為7.5,此條件下花蕓豆多肽濃度為0.915 mg/mL。本文提供了一種花蕓豆多肽的提取方法,旨在為今后花蕓豆多肽的深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

花蕓豆,堿性蛋白酶,多肽濃度

花蕓豆(PhaseolusVulgarisLinn. sp)屬豆科菜豆屬一年生草本植物,其生物學(xué)名叫菜豆。蕓豆品種多,營養(yǎng)也較豐富,據(jù)測定,每百克蕓豆含蛋白質(zhì)23.1 g、脂肪1.3 g、碳水化合物56.9 g、鈣76 mg及豐富的B族維生素,可作為糧豆配合開發(fā)新營養(yǎng)主食品種的原料[1-2]。蕓豆中含有大量對人體有益的生物活性物質(zhì),其中多肽具有降血壓、降血脂、活化細(xì)胞免疫機(jī)能、改善心血管功能和抗氧化等生理活性,是現(xiàn)代食品和醫(yī)藥領(lǐng)域最熱門的研究方向和極具發(fā)展前景的功能因子[3-6]。目前對于大豆、花生、大麥、魔芋、核桃等原料多肽的制備工藝和功能性進(jìn)行了研究研究較多,余勃[7]等人對微生物法生產(chǎn)大豆多肽的工藝進(jìn)行了研究,確定了微生物法生產(chǎn)大豆多肽的工藝條件;趙珮[8]等人對大麥多肽的提取工藝及抗氧化活性進(jìn)行了研究;王端[9]等人以核桃脫脂粉為原料,利用酶解法提取制備核桃多肽,確定了酶解法提取核桃多肽的最佳工藝條件;呂婧[10]等人研究了利用米曲霉和枯草芽孢桿菌共生發(fā)酵魔芋飛粉制備魔芋多肽的方法;周婷婷[11]等人篩選制備抗氧化大豆多肽的水解酶及水解條件,從而得到高效的抗氧化大豆多肽制品;劉英麗[12]等人研究確定了酶解花生粕制備抗氧化肽的最佳工藝參數(shù)。目前國內(nèi)對于花蕓豆的研究主要集中在花蕓豆的開發(fā)應(yīng)用,而對花蕓豆中蛋白質(zhì)的研究較少,特別是花蕓豆多肽的研究仍處于空白階段,故有很大的研究空間。本文建立了一種花蕓豆多肽的提取方法,以花蕓豆為原料,用堿性蛋白酶水解,研究酶解溫度、酶解時(shí)間、pH、加酶量對花蕓豆多肽提取影響,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),確定了花蕓豆多肽制備的最佳酶解工藝條件,旨在為花蕓豆多肽制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為花蕓豆多肽的深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花蕓豆 購自北大荒集團(tuán);鹽酸 哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司;石油醚 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;CuSO4·5H2O 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶(180000 U/mL) 諾維信生物科技有限公司;Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

上海萬能粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司;TU-1800型紫外可見光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;高速離心機(jī) 北京恒奧生物科技有限公司;pH劑 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州國華電器有限公司;漩渦混合儀 德國IKA公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6個(gè)5 mL的容量瓶,用5%的TCA(三氯乙酸)依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后從容量瓶中分別取4.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,并加入3.0 mL雙縮脲試劑,在漩渦混合儀上混合均勻,靜止放置10 min,2000 r/min離心10 min,取上清液于540 nm下測定OD值(以第一管做空白對照)。以肽的濃度為橫坐標(biāo)X(mg/mL),OD值為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

1.2.2 原料預(yù)處理 蕓豆用粉碎機(jī)進(jìn)行充分碾磨,然后將磨好的蕓豆粉末過40目篩,過篩后的蕓豆再經(jīng)過30～60 ℃石油醚脫脂過程,將脫脂后的蕓豆干燥密封保存。

1.2.3 蛋白酶解液的制取 取脫脂后的蕓豆粉,將蕓豆粉與水1∶1比例用組織勻漿機(jī)勻漿1 min,配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蕓豆懸浮液,在溫度50 ℃、pH8.0、加酶量2000 U/g的條件下酶解2 h,酶解完畢后90 ℃水浴滅酶10 min,4000 r/min離心15 min,去除蕓豆渣與懸浮物即為酶解液。

1.2.4 蕓豆蛋白沉淀工藝 取2.5 mL酶解液,加入2.5 mL 10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液,于漩渦混合儀上混合均勻,靜止放置10 min,然后在4000 r/min下離心15 min,將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中,并用5%的TCA定容至刻度,搖勻。

1.2.5 多肽含量的測定 取經(jīng)過稀釋到適宜濃度的上清液2.5 mL,加入同樣體積的10%的TCA試劑(稱取10 g的三氯乙酸,用適宜的蒸餾水溶解后定容到100 mL),靜置10 min后,4000 r/min離心15 min,取1 mL上清液,并加入4 mL的雙縮脲試劑(稱取1.5 g硫酸銅、6.0 g酒石酸鈉和1.0 g碘化鉀溶于適量的蒸餾水中,并一邊攪拌一邊加入300 mL氫氧化鈉溶液,最后用蒸餾水定容到1000 mL),混勻后靜置10 min,2000 r/min離心10 min,540 nm測定溶液的吸光值,根據(jù)Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)時(shí)在540 nm下測量的吸光度值,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的多肽濃度C(mg/mL)[13]。

1.2.6 酶解反應(yīng)影響多肽含量測定的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 酶解時(shí)間 取6支試管,于每一支試管中均加入4.0 mL上述蕓豆懸浮液,將1～5號試管分別于室溫下放置1、2、3、4、5 h,0號試管設(shè)置為0 h,作為空白對照,相同pH下加相同酶量,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟,依次按標(biāo)準(zhǔn)程序測定OD值,平行測定一次。

1.2.6.2 酶解溫度 取6支試管,于每一支試管中均加入4.0 mL上述蕓豆懸浮液,將1～5號試管pH相同情況下分別于30、40、50、60、70 ℃下進(jìn)行加熱處理,0號試管不進(jìn)行加熱處理,在相同的時(shí)間下加相同酶量,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟,依次按標(biāo)準(zhǔn)程序測定OD值,平行測定一次。

1.2.6.3 酶解pH 取6支試管,于每一支試管中均加入4.0 mL上述蕓豆懸浮液,將1～5號試管分別于室溫下pH按7、7.5、8、8.5、9配制,0號試管不進(jìn)行處理,在相同時(shí)間下加相同酶量,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟,依次按標(biāo)準(zhǔn)程序測定OD值,平行測定一次。

1.2.6.4 加酶量 取6支試管,于每一支試管中均加入4.0 mL上述蕓豆懸浮液,將1～5號試管于室溫下加入酶量分別為1000、2000、3000、4000、5000 U/g,0號試管不加酶,pH相同的條件下加相同酶量,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟,依次按標(biāo)準(zhǔn)程序測定OD值,平行測定一次。

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)方案及酶解時(shí)間、酶解溫度、pH、加酶量對花蕓豆多肽提取的影響見表1。

表1 L16(44)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

以 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽的濃度作為橫坐標(biāo)X(mg/mL),OD值作為縱坐標(biāo)Y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從而得到回歸方程y=0.1277x-0.0015,R2=0.9979。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Gly-Gly-Tyr-Arg

2.2 酶解反應(yīng)因素對多肽含量測定的影響

2.2.1 酶解時(shí)間對花蕓豆多肽含量測定的影響 由圖2可知,酶解時(shí)間在1～4 h內(nèi),隨著酶解時(shí)間的增加,花蕓豆多肽的提取率逐步增加,這是由于在反應(yīng)的初始階段底物濃度大,堿性蛋白酶的活力最強(qiáng),能夠充分結(jié)合底物蛋白,酶的作用位點(diǎn)多,所以隨著酶解時(shí)間的增加,花蕓豆多肽的濃度逐步增加[14];當(dāng)酶解時(shí)間超過4 h時(shí),可能是隨著酶解時(shí)間的延長,蛋白底物的濃度逐漸下降,酶和底物的結(jié)合位點(diǎn)也隨之減少,同時(shí)酶活力也隨之降低,反應(yīng)越來越慢[15],而且由于水解時(shí)間過長,制備的多肽開始被堿性蛋白酶酶解成單個(gè)的氨基酸,造成多肽含量有所下降[16]。所以在其他因素不變的條件下,酶解時(shí)間在4 h時(shí)提取效果最佳。

圖2 酶解時(shí)間對花蕓豆多肽含量的影響Fig.2 Effect of Enzymolysis Time on peptide yield of Phaseolus vulgaris Linn

2.2.2 酶解溫度對花蕓豆多肽含量測定的影響 由圖3可知,酶解溫度在30～40 ℃時(shí),由于溫度過低,堿性蛋白酶活性受到抑制,酶解速率較慢,多肽生成曲線較緩;當(dāng)溫度繼續(xù)升高,溫度逐漸接近堿性蛋白酶作用的最適溫度,所以酶解速率加快,多肽的提取率也逐漸升高;酶解溫度在60 ℃時(shí),體系溫度達(dá)到堿性蛋白酶的最適溫度,蛋白質(zhì)的酶解率達(dá)到最大值;60 ℃之后隨著溫度的升高,多肽的提取率逐漸下降,這是因?yàn)檩^高的酶解溫度破壞了維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵,使蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致酶變性,從而使蛋白酶的活性減弱或喪失,使多肽的提取率降低[17-18]。所以在其他因素不變的條件下,溫度在60 ℃時(shí)提取效果最佳。

圖3 酶解溫度對花蕓豆多肽含量的影響Fig.3 Effect of Enzymolysis Temperature on peptide yield of Phaseolus vulgaris Linn

2.2.3 酶解pH對花蕓豆多肽含量測定的影響 由圖4可知,在pH在7.0～8.0內(nèi),隨著pH的遞增,花蕓豆多肽的提取率不斷增加,這是由于在初始階段,隨著pH的增大,體系pH越來越接近蛋白質(zhì)酶的最適pH,所以多肽濃度不斷增大;當(dāng)酶解pH達(dá)到8.0時(shí),體系pH達(dá)到堿性蛋白酶的最適pH,蛋白質(zhì)的酶解率達(dá)到最大值;隨著pH繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)的酶解程度逐漸下降,這是由于pH會影響酶與底物的結(jié)合情況,pH較高時(shí)會影響酶蛋白的構(gòu)象和酶分子的解離狀態(tài),使蛋白酶的活性降低,從而影響蛋白酶的催化效果,造成花蕓豆多肽的提取率不斷下降[19-20]。所以在其他因素不變的條件下,pH為8.0時(shí)提取效果最佳。

圖4 酶解pH對花蕓豆多肽含量的影響Fig.4 Effect of pH on peptide yield of Phaseolus vulgaris Linn

2.2.4 加酶量對花蕓豆多肽含量測定的影響 由圖5可知,體系加酶量在1000～2000 U/g內(nèi),在隨著加酶量的遞增,蛋白質(zhì)酶解率增大,這是因?yàn)榉磻?yīng)初始階段酶濃度較低,底物過量,酶與底物完全結(jié)合,隨著加酶量的增大,反應(yīng)速率隨之加快,水解程度增大[14];當(dāng)加酶量達(dá)到2000 U/g時(shí),蛋白質(zhì)的酶解率達(dá)到最大值;隨著酶量的繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)的酶解程度逐漸下降。這是因?yàn)楫?dāng)酶濃度較高時(shí),蛋白質(zhì)相對濃度較低,底物分子能與酶分子完全結(jié)合,酶分子處于過飽和狀態(tài),有一部分沒機(jī)會與蛋白質(zhì)結(jié)合,因而繼續(xù)增加蛋白酶的用量也不會加快水解速率[21]。所以水解程度變化不大。所以在其他因素不變的條件下,加酶量為2000 U/g時(shí)提取效果最佳。

圖5 加酶量對花蕓豆多肽含量的影響Fig.5 Effect of Alcalase dosage on peptide yield of Phaseolus vulgaris Linn

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

表2 L16(44)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果極差分析

由表2、表3可以看出酶解時(shí)間和酶解溫度對花蕓豆多肽提取的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05),各因素對多肽提取量的影響主次順序?yàn)槊附鉁囟?酶解時(shí)間>加酶量>pH,最佳組合為A3B3C2D2,按A3B3C2D2條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),花蕓豆多肽濃度平均值為0.954 mg/mL,高于表2中的正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果,故A3B3C2D2為最佳提取條件。即酶解時(shí)間為4 h,酶解溫度為60 ℃,加酶量為2000 U/g,pH7.5,多肽含量為0.915 mg/mL。

3 結(jié)論

本文研究了酶解溫度、酶解時(shí)間、pH和加酶量對花蕓豆提取多肽的影響。通過顯著性實(shí)驗(yàn),各因素的影響順序?yàn)?酶解溫度>酶解時(shí)間>加酶量>pH。通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定花蕓豆多肽的最佳提取條件為:酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間4 h、加酶量為2000 U/g、酶解pH7.5。在此條件下酶解蛋白質(zhì)的效果最好,產(chǎn)生的多肽量最多,多肽濃度為0.915 mg/mL。本文提供了一種花蕓豆多肽的提取方法,旨在為花蕓豆多肽制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為花蕓豆多肽的深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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Study on extraction technology of Polypeptide fromPhaseolusVulgaris

ZHANG Jing,CHEN Hao-ran,WANG Xiao-ying,CHENG Yu-song,PAN Lei,LI Liang*

(College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this paper,takingPhaseolusVulgarisas row material,alkaline protease hydrolysis was used to prepare coloured kidney bean polypeptide. Enzymolysis conditions such as enzymolysis temperature,enzymolysis time,pH value and enzyme dosage were optimized by means of designing orthogonal experiments. The results showed that the optimum conditions are as follows:temperature 60 ℃,enzymolysis time 4 h,pH7.5,enzyme dosage 2000 U/g. Under this condition,the concentration of polypeptides inPhaseolusVulgariswas 0.915 mg/mL. This paper proposes a method for extracting polypeptides fromPhaseolusVulgaris,and aims to lay a foundation for further exploration and utilization of polypeptides fromPhaseolusVulgarisin future.

PhaseolusVulgaris;alkaline protease;concentration of polypeptides

2016-05-24

張靜(1995-)，女，本科生，研究方向：糧食工程，E-mail:1318767115@qq.com。

*通訊作者:李良(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工，E-mail：liliangneau@163.com。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生SIPT創(chuàng)新訓(xùn)練資助項(xiàng)目(2015)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000