王 芳,廖 亮,黃 瑜,趙曉敏,侯俊楠,曹文利,李 丹,李學(xué)文

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

雙水相法提取油菜籽粕中原花青素

王 芳,廖 亮,黃 瑜,趙曉敏,侯俊楠,曹文利,李 丹,李學(xué)文*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

采用雙水相法對(duì)油菜籽粕中原花青素進(jìn)行提取。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和提取溫度為自變量,以原花青素得率為響應(yīng)值,利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法,研究各自變量的交互作用對(duì)原花青素得率的影響,建立油菜籽粕原花青素提取得率的二次回歸方程。結(jié)果表明,雙水相法提取油菜籽粕原花青素的最佳工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)26%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%,pH2.40,提取溫度39 ℃,在此最優(yōu)條件下原花青素得率為7.78 mg/g。該研究為油菜籽粕中原花青素合理開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

油菜籽粕,原花青素,雙水相,提取,響應(yīng)面

油菜是十字花科植物中一種重要的油料作物,截止至2014年底,僅我國(guó)油菜籽的種植面積已達(dá)到7587.92千公頃,年產(chǎn)量達(dá)到1477.22萬噸[1]。油菜籽加工成菜籽油后可得到55%左右的菜籽粕[2],然而,菜籽粕利用率低,大部分用于飼料、肥料或者垃圾處理,尚未得到合理開發(fā)利用,但其潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[3],研究表明,十字花科的油菜,其種皮與仁均含有一定量的原花青素[4]。劉建平等[5]用超聲輔助法從油菜籽皮中提取了原花青素;于京等[6]通過加速溶劑萃取法從油菜籽粕中得到較高含量的原花青素。

原花青素(Proanthocyanidins)是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮[7],廣泛存在于植物的種子、核、花、果實(shí)和皮等部位[8],具有清除自由基[9]、抗癌[10]、遏制糖化終產(chǎn)物形成[11]、改善視力[12]等多重功效,在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域備受青睞。當(dāng)前,原花青素的主要提取方法包括溶劑浸提法[13]、超臨界萃取法[14],酶輔助法[15]、微波輔助法[16]、超聲輔助法[17]等。

雙水相(aqueous two-phase system,ATPS)提取法因其含水量高,過程易于放大,生物親和性好,高效節(jié)約和安全環(huán)保等特點(diǎn),已成功運(yùn)用于生物制品、食品工業(yè)、化工等方面[18],但在提取原花青素方面研究較少。目前尚未見雙水相法在提取油菜籽粕中原花青素方面的應(yīng)用,本研究以油菜籽粕為原材料,采用乙醇-硫酸銨雙水相法提取原花青素,既能增加油菜籽的附加值,又能促進(jìn)天然活性物質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用,同時(shí)在提高食品安全性方面起到積極作用,為油菜籽粕的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜籽粕 購(gòu)于新疆伊寧市榨油廠;無水乙醇、硫酸銨、氯化鉀、鹽酸 均為分析純。

UV-1200型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;FA2004型電子分析天平 上海天平儀器廠;DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;GL-20G-Ⅱ高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;FW-100型高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原花青素的提取工藝流程 油菜籽粕→挑選、除雜→恒溫干燥(40 ℃、2 d)→超微粉碎→稱取1 g放入乙醇硫酸銨雙水相[19]→離心(8000 r/min,10 min)→取上相液→定容至50 mL→待測(cè)樣品。

1.2.2 原花青素的測(cè)定 取待測(cè)樣品各1 mL于25 mL容量瓶,用pH=4.50醋酸鈉緩沖溶液和pH=1.00氯化鉀緩沖溶液定容,混勻后靜置2 h,過濾后所得濾液用紫外-可見分光光度計(jì)分別在520 nm和700 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算公式如下:

原花青素得率(mg/g)=(A×Mr×DF×V)/(P×m)

式(1)

式中:A-最終吸光度,A=(A520 nm,pH1.0-A700 nm,pH1.0)-(A520 nm,pH4.5-A700 nm,pH4.5);Mr-相對(duì)分子質(zhì)量443.2u;DF-稀釋倍數(shù);V-定容體積(mL);P-標(biāo)品矢車菊色素-3-葡萄糖苷摩爾吸光系數(shù)26900(L/(cm·g));m-樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%硫酸銨溶液和體積分?jǐn)?shù)分別為22%、24%、26%、28%、30%乙醇溶液,調(diào)pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.3.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16%、17%、18%、19%、20%硫酸銨溶液,調(diào)pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.3.3 pH確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%硫酸銨溶液,調(diào)pH為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.3.4 提取時(shí)間的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%硫酸銨溶液,調(diào)pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中分別提取30、40、50、60、70 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.3.5 提取溫度的確定 以料液比1∶35 g/mL,加入30%乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%硫酸銨溶液,調(diào)pH為2.00,分別置于30、35、40、45、50 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.3.6 料液比的確定 以料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL,分別加入30%乙醇溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的硫酸銨溶液,調(diào)pH為2.00,置于35 ℃恒溫水浴鍋中提取60 min,每組三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定原花青素得率。

1.2.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用Box-Benhnken模型,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和提取溫度為自變量,以原花青素的得率(Y)為響應(yīng)指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,4個(gè)自變量的實(shí)驗(yàn)水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2007處理,利用Spss19.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響 由圖1可知,當(dāng)體系中乙醇濃度由22%增加到26%時(shí),原花青素的得率也隨之升高,當(dāng)乙醇濃度為28%時(shí),原花青素得率最高,達(dá)到6.54 mg/g,當(dāng)乙醇濃度超過28%后,原花青素的得率隨著乙醇濃度的增加而減小。這是由于乙醇濃度過低不利于雙水相體系分相,并且原花青素在上相中溶解度較小,而乙醇濃度過高易使雙水相穩(wěn)定性降低,易使下相硫酸銨鹽析晶[14]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.1 Effects of ethanol content on the proanthocyanidins yield

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響 由圖2可知,隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,原花青素的得率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì),分析原因可能是隨著硫酸銨質(zhì)量濃度增大,其爭(zhēng)奪水分子的能力越強(qiáng),導(dǎo)致上相中水分子減少,乙醇濃度相對(duì)增加,根據(jù)相似相容原理,不同濃度的乙醇由于極性不同對(duì)溶質(zhì)的溶解程度不同,在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過18%后,原花青素得率明顯下降,可能由于上相與原花青素極性的相似程度降低所致。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率的影響Fig.2 Effects of ammonium sulfate concentration on the proanthocyanidins yield

2.1.3 料液比對(duì)原花青素得率的影響 由圖3可知,在一定范圍內(nèi),原花青素得率隨著料液比的增大而升高,在料液比為1∶30時(shí),原花青素得率高達(dá)7.35 mg/g。料液比過小油菜籽粕不能完全被浸透,不利于溶劑破壞植物細(xì)胞內(nèi)疏水鍵,并且原花青素易達(dá)到飽和狀態(tài),從而影響其擴(kuò)散與傳質(zhì)。繼續(xù)增大料液比原花青素得率變化很小,同時(shí)料液比過大不利于濃縮回收。因此,確定1∶30為最佳料液比。

圖3 料液比對(duì)原花青素得率的影響Fig.3 Effects of solid liquid ratio on proanthocyanidins yield

2.1.4 pH對(duì)原花青素得率的影響 由圖4可知,在pH=2.5時(shí),原花青素得率達(dá)到了7.43 mg/g,在此酸度下,油菜籽粕的細(xì)胞壁和纖維素結(jié)構(gòu)易被破壞,使得更多活性成分與溶劑成分接觸。隨著提取液pH上升,雙水相酸性降低,原花青素得率逐漸下降,可能是由于隨著pH升高,原花青素分子構(gòu)象發(fā)生改變[16]。

圖4 pH對(duì)原花青素得率的影響Fig.4 Effects of pH on the proanthocyanidins yield

2.1.5 溫度對(duì)原花青素得率的影響 由圖5可知,提取溫度不斷升高時(shí),原花青素得率也逐漸升高,當(dāng)提取溫度達(dá)到45 ℃之后,原花青素得率隨之增大而略有降低。提取是一種擴(kuò)散過程,溫度升高,會(huì)加快細(xì)胞內(nèi)活性分子運(yùn)動(dòng)速度,從而有利于原花青素?cái)U(kuò)散到溶劑中,溫度高于45 ℃,原花青素結(jié)構(gòu)被破壞,所以得率反而降低。因此提取的最佳溫度為45 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)原花青素得率的影響Fig.5 Effects of temperature on the proanthocyanidins yield

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響 由圖6可以看出,在30～50 min之間,原花青素得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增大,當(dāng)提取時(shí)間超過50 min后,繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間原花青素得率趨于穩(wěn)定。原料顆粒內(nèi)部溶質(zhì)的溶解及擴(kuò)散需要一定的時(shí)間,提取時(shí)間過短原花青素不能及時(shí)溶出,在50 min時(shí)原花青素和提取劑之間已經(jīng)達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡,提取時(shí)間過長(zhǎng)反而易導(dǎo)致原花青素發(fā)生氧化和聚合反應(yīng)[17]。因此,原花青素的最佳提取時(shí)間為50 min。

圖6 提取時(shí)間對(duì)原花青素得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on the proanthocyanidins yield

2.1.7 Plackett-Burman結(jié)果分析 采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選,通過表2可以得出料液比和提取時(shí)間對(duì)雙水相提取原花青素影響不顯著(p>0.05),考慮到生產(chǎn)成本和經(jīng)濟(jì)效益,料液比選擇為1∶30 g/mL,提取時(shí)間為50 min。乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和提取溫度對(duì)原花青素得率(Y)的影響顯著(p<0.05),因此通過響應(yīng)面對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

注:**表示差異高度顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析 采用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到響應(yīng)值Y對(duì)影響因子乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、pH(C)和提取溫度(D)的二次多項(xiàng)式回歸模型,如式2所示:

Y=7.87+0.15A+0.24B-0.054C-0.036D-0.17AB-0.13AC-0.45AD+0.019BC-0.096BD+0.066CD-0.34A2-0.22B2-0.23C2-0.62D2

式(2)

2.2.2 各因素交互作用分析 響應(yīng)面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對(duì)響應(yīng)值原花青素得率的影響,由圖7～圖12可知,開始時(shí)原花青素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和提取溫度的增大而增大,達(dá)到中心值以后,得率隨著各因素增大而減小;兩兩因素間均有交互作用,其中乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用最強(qiáng),如圖9對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面曲線變化較為陡峭,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為27%原花青素得率達(dá)到最大值;乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH的交互作用最弱,如圖10對(duì)應(yīng)的曲線較為平緩。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of ethanol concentration and ammonium sulphate concentration on the proanthocyanidins yield

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of ethanol concentration and pH on the proanthocyanidins yield

表3 原花青素得率實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of ethanol concentration and extraction temperature on the proanthocyanidins yield

圖10 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of ammonium sulphate concentration and pH on the proanthocyanidins yield

圖12 pH和提取溫度對(duì)原花青素得率影響的響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface of pH and temperature on the proanthocyanidins yield

注:***表示差異極顯著(p<0.0001),**表示差異高度顯著(p<0.01),*表示差異顯著(p<0.05)。2.2.3 提取工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)回歸模型得到最佳提取工藝條件是乙醇體積分?jǐn)?shù)為26.00%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.07%,pH為2.44,提取溫度為39.00 ℃,原花青素得率最大預(yù)測(cè)值為7.89 mg/g?？紤]到實(shí)際生產(chǎn),將提取工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)為26%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%,pH為2.40,提取溫度為39 ℃,為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,采用上述工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)得的原花青素的平均得率得率為(7.78±0.49) mg/g,與理論值相比,其相對(duì)誤差約為1.41%,說明采用響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝可行性強(qiáng),優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 討論

如何使油菜籽粕變廢為寶、使其所含活性物質(zhì)充分利用,是綜合開發(fā)油菜籽粕附加值的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用雙水相法提取油菜籽粕中的原花青素,和傳統(tǒng)提取方法相比,避免了有機(jī)溶劑萃取對(duì)原花青素結(jié)構(gòu)的破壞作用;盡管響應(yīng)面分析方法因其實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、分析全面等優(yōu)點(diǎn)被眾多領(lǐng)域應(yīng)用,但在油菜籽粕原花青素雙水相法提取工藝參數(shù)的優(yōu)化方面尚未有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面尋找出最佳工藝條件,解決了以往正交實(shí)驗(yàn)無法在全部區(qū)域上獲取最佳因素和最優(yōu)值的問題。

為了驗(yàn)證雙水相法提取油菜籽粕原花青素的高效實(shí)用性,選用水提法和于京等[6]采用的加速溶劑萃取法對(duì)同一批油菜籽粕進(jìn)行提取,提取后原花青素得率分別為2.49、4.06 mg/g,而雙水相法所得原花青素的得率為7.76 mg/g,雙水相法提取得率明顯高于以上兩種方法,約為水提法的4倍,加速溶劑法的2倍,均有極顯著差異(p<0.01),可能是雙水相體系萃取過程中能夠?qū)⒉糠蛛s多糖與雜蛋白去除,在一定程度上提高了原花青素的得率,由此可以得出雙水相法在原花青素的提取上更有優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn),擬合了乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH、提取溫度,這四個(gè)因素對(duì)原花青素得率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型回歸模型,經(jīng)驗(yàn)證重復(fù)實(shí)驗(yàn)證明Box-Benhnken 設(shè)計(jì)法所得模型擬合度高,準(zhǔn)確有效,用于預(yù)測(cè)雙水相法提取油菜籽粕中花青素的得率是可行的。由該模型優(yōu)化后的提取條件如下:乙醇體積分?jǐn)?shù)為26%,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%,pH為2.40,提取溫度為39 ℃,在此最優(yōu)條件下原花青素得率為7.78 mg/g,該方法易操作、對(duì)比傳統(tǒng)提取方法提取效果較好。

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Extraction of proanthocyanidins from rapeseed meal with aqueous two-phase system

WANG Fang,LIAO Liang,HUANG Yu,ZHAO Xiao-min,HOU Jun-Nan,CAO Wen-li,LI Dan,LI Xue-wen*

(College of Food and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Aqueous two-phase system was used to extract proanthocyanidins from rapeseed meal. Four extraction parameters including ethanol concentration,ammonium concentration,pH,temperature were optimized based on single factor investigations for achieving yield of proanthocyanidins,the interaction of the respective variables and their influence on the yield were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory,a quadric regression equation forpredicting the extraction yield of proanthocyanidins was established . The results showed that better extraction conditions were as follows:ethanol mass fraction of 26%,ammonium sulfate mass fraction of 18%,pH of 2.40,the extraction temperature 39 ℃,Under optimum conditions,the yield of proanthocyanidins was 7.78 mg/g. The study would provide certain data base for the effective utilization and development of proanthocyanidin.

rapeseed meal;proanthocyanidins;aqueous two-phase;extracting;response surface methodology

2016-06-28

王芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail:lei8883@163.com。

*通訊作者:李學(xué)文(1964-)男，教授，主要從事果蔬采后生理及貯運(yùn)保鮮技術(shù)研究，E-mail:1741695056@qq.com。

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃青年教師科研啟動(dòng)基金(XJEDU2014S018)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000