鄧夢琴,林曉瑛,張 明,宋賢良,黃 葦

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

超聲輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

鄧夢琴,林曉瑛,張 明,宋賢良*,黃 葦

(華南農業(yè)大學食品學院,廣東廣州 510642)

采用超聲波輔助溶劑法提取菠蘿蜜果皮中的黃酮,研究了不同的提取溶劑、提取方式和提取工藝因素(溶劑濃度、料液比、提取時間)對黃酮提取率的影響,采用響應面實驗設計和多元二次回歸分析優(yōu)化提取工藝。結果表明,超聲輔助溶劑法提取菠蘿蜜果皮黃酮的最佳工藝為丙酮濃度61%,料液比1∶25,提取時間24 min,提取溫度45 ℃,超聲功率300 W。在此條件下進行驗證實驗,黃酮提取率為6.92%。且該提取條件下得到的黃酮具有良好的抗氧化能力,與VC溶液和BHT溶液相比,其DPPH、·OH自由基清除率IC50值和還原能力大小為:粗提液>VC溶液>BHT溶液。

菠蘿蜜果皮,黃酮,提取,抗氧化活性

菠蘿蜜是我國南方典型的熱帶果品之一,含有豐富的蛋白質、糖類、礦物質、維生素等人體所需的營養(yǎng)物質,素有“熱帶珍果”之稱[1]。菠蘿蜜果實碩大,產量高,常用以鮮食,味道清甜可口且香氣濃郁[2],但采后貯藏期短,果皮、果腱等不可食部分幾乎占全果質量的二分之一,在其食用和加工過程中會產生大量的果皮廢棄物,造成極大的資源浪費。菠蘿蜜果皮富含糖類、果膠、膳食纖維、維生素、礦物質等多種營養(yǎng)成分,以及含有豐富的生物活性物質如多酚、黃酮、活性多糖等[3],鄧夢琴等用普通乙醇浸提法提取得到菠蘿蜜果皮黃酮提取量為23.51 mg/g[4],與目前其他原料中黃酮類物質提取研究相比,菠蘿蜜果皮黃酮含量十分可觀,是具有較大潛力的黃酮提取原料。因此,研究菠蘿蜜果皮的黃酮提取是菠蘿蜜果品深加工及利用的有效途徑,對提高果品副產物的綜合利用率及其經濟效益有重要意義。

黃酮類化合物作為次級代謝產物廣泛存在于自然界中[5],大量研究表明,黃酮具有抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤等功效[6-8],作為天然色素、天然抗氧化劑、抗菌劑等已廣泛應用于食品工業(yè)、藥物、化妝品等行業(yè),是近年來天然產物的研究熱點之一。而目前關于菠蘿蜜果皮中的黃酮類物質研究報道甚少,更多集中在菠蘿蜜果肉加工、果酒、果汁[9-11]等加工研究方面。本研究采用超聲波輔助溶劑法提取菠蘿蜜果皮黃酮,通過響應面法優(yōu)化提取工藝,旨在突破菠蘿蜜深加工利用關鍵技術缺乏的現狀,使果品副產物變廢為寶,解決其加工程度低、綜合利用率低等問題,以期為以菠蘿蜜果皮為物料基礎的天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考依據和技術支持。

表1 超聲波輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮單因素實驗

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜皮 購于廣州市天平架水果批發(fā)市場;蘆丁標準品 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鋁、亞硝酸鈉、丙酮、DPPH等試劑均為分析純。

KQ-500DE三頻式超聲波處理機 昆山市超聲儀器有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;752型紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;202型電熱鼓風干燥箱 廣州市富華測控科技有限公司;FW100型萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;H/T16MM臺式高速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程 新鮮果皮清洗→烘干→粉碎→過篩(80目,-4 ℃冷藏備用)→溶劑提取→黃酮粗提液

1.2.2 黃酮含量測定

1.2.2.1 標準曲線繪制 分別取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL的0.98 mg/mL蘆丁標準液于6支10 mL具塞比色管中,加入60%乙醇3 mL,再加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,放置6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻,放置6 min后用1 moL/L氫氧化鈉溶液定容至10 mL,搖勻,放置15 min后在510 nm處測定吸光值。以蘆丁標準液濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,其回歸方程為y=1.0116x-0.008,相關系數R2=0.9995,表明黃酮含量在0～1.0 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

1.2.2.2 樣品含量測定 提取液離心后取上清液稀釋10倍,再取1 mL稀釋液于10 mL具塞比色管中,按1.2.2.1中步驟測定吸光值,以下方公式計算黃酮提取得率:

式中:c-標曲計算得出的待測液中黃酮質量濃度,mg/mL;v-提取液體積,mL;n-稀釋倍數;m-稱取菠蘿蜜果皮粉末質量,g。

1.2.3 提取溶劑篩選 稱取1.000 g菠蘿蜜果皮粉末,按1∶10的料液比,分別采用60%乙醇、60%丙酮、60%甲醇、乙酸乙酯、水為提取溶劑,40 ℃下常規(guī)浸提2 h,測黃酮得率,選取最佳提取溶劑。

1.2.4 提取方式篩選 稱取1.000 g菠蘿蜜果皮粉末,按1∶10的料液比,60%丙酮為提取溶劑,分別采用40 ℃下常規(guī)浸提1 h、減壓加熱回流提取1 h、超聲波功率300 W下輔助浸提30 min的方法進行提取,提取后的皮渣50 ℃烘干至恒重后,表面噴金,加速電壓為10.0 kV,于 4500倍電鏡下掃描觀察其表面形態(tài),選取最佳提取方式。

1.2.5 單因素實驗 稱取1.000 g菠蘿蜜果皮進行超聲波輔助提取,分別考察溶劑濃度、料液比、提取溫度、超聲波時間和功率對菠蘿蜜果皮黃酮提取率的影響,每個水平做三次重復。其單因素實驗水平設計見表1。

1.2.6 響應面法優(yōu)化實驗 在單因素實驗的基礎上,經單因素顯著性分析,可選擇固定提取溫度45 ℃,超聲輔助功率300 W,建立3因素3水平的Box-Behnken模型,以丙酮濃度、料液比、提取時間為實驗因素,黃酮提取得率為響應值,確定最佳提取工藝。自變量因素編碼及水平見表2。

表2 Box-Behnken設計實驗因素水平及編碼

1.2.7 抗氧化活性測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率 參考陳海光等[12]方法測定。按以下公式計算DPPH自由基清除率:

式中:A0(對照):4.0mLDPPH+0.5mL無水乙醇;A1(反應):4.0mLDPPH+樣品溶液;A2(空白):4.0mL無水乙醇+樣品溶液。

1.2.7.2 ·OH自由基清除率 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法,參考趙艷紅等[13]方法測定。按照以下公式計算·OH自由基清除率:

式中:A0:加入H2O2而不加樣品時測得的吸光值;A1:未加樣品及H2O2時測得的吸光值;A2:加入樣品及H2O2時測得的吸光值。

1.2.7.3 還原能力測定 采用普魯士蘭法,參考陳洪璋等[14]方法測定。測得的吸光值越大,還原能力越好。

1.3 數據處理

使用Origin8.5作圖,SPSS19.0對數據進行統計分析,DesignExpert8.0Trial軟件進行響應面設計與數據處理。

2 結果與分析

2.1 提取方法篩選

由圖1和圖2可知,采用不同類型的溶劑和不同提取方式分別對菠蘿蜜果皮黃酮進行提取,結果表明,以60%丙酮為提取溶劑,黃酮提取率高達5.58%,遠高于其他溶劑對菠蘿蜜果皮黃酮的提取率,這可能是由于菠蘿蜜果皮中黃酮物質的極性與丙酮溶劑有更好的親和性,因而選擇丙酮作為提取溶劑;而對不同提取方式的考察結果可知,超聲波輔助溶劑法的黃酮提取率為6.01%,其提取效果遠優(yōu)于傳統溶劑提取法的3.08%和溶劑熱回流法的4.95%,說明在超聲波的空化作用下,黃酮物質與溶劑接觸更充分,溶出效果更好,故選擇超聲波輔助溶劑法為最適提取方式。

圖1 不同提取溶劑對菠蘿蜜果皮黃酮提取率的影響Fig.1 The effect of different extraction solvents on flavonoids yield of jackfruit peel

圖2 不同提取方式對菠蘿蜜果皮黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of different extraction methods on flavonoids yield of jackfruit peel

通過掃描電鏡觀察三種不同提取方式下菠蘿蜜果皮皮渣的表面形態(tài)結構,由圖3可看出,經傳統溶劑浸提后的菠蘿蜜果皮皮渣結塊,表面粗糙且孔隙較少,料液不能充分接觸滲入;經加熱回流和超聲輔助提取的菠蘿蜜果皮皮渣分散性好,表面凹凸明顯,尤以超聲波輔助提取的皮渣孔隙最多最深入。這是由于超聲波的空化作用引起的強大穿透力所致,表面孔隙能顯著提高提取過程的傳質速率和效果,加速黃酮溶出,縮短提取時間,驗證了超聲輔助溶劑提取黃酮的高效性機制。

圖3 不同方式提取蘿菠蜜皮渣的掃描電鏡照片Fig.3 The SEM photos of jackfruit peel for different extraction methods

2.2 提取單因素實驗結果分析

2.2.1 丙酮濃度對黃酮提取率的影響 由圖4可知,隨著丙酮濃度的增加,黃酮提取率呈現先增大后減少的變化趨勢,且當丙酮濃度為60%時,黃酮的提取率最高,其原因可能是,當丙酮濃度超過60%時,使得提取粗品中一些低極性雜質等溶出,和黃酮競爭結合丙酮,使有效成分降低,黃酮提取率下降。故選取丙酮濃度為60%。

圖4 不同溶劑濃度對黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of different solvent concentration on flavonoids yield of jackfruit peel

圖5 料液比對黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of ratio of material to liquid on flavonoids yield of jackfruit peel

2.2.2 料液比對黃酮提取率的影響 由圖5可知,隨著料液比的減小,黃酮提取率呈現先增大后減少的變化趨勢,且料液比為1∶25時黃酮的提取率最高。這是因為,料液比在一定范圍內的減小有利于增加溶劑和原料的接觸,增大濃度差,加快溶劑擴散,從而提高黃酮浸出率,當料液比過小時,黃酮溶出量達到飽和,而其他雜質溶出增多,反而降低了黃酮提取率,且不利于節(jié)能環(huán)保。故選取料液比為1∶25。

2.2.3 超聲時間對黃酮提取率的影響 由圖6可知,隨著提取時間的增加,黃酮提取率呈現先增大后減少的變化趨勢,且提取時間為20 min時,黃酮提取率最高。當提取時間超過20 min時,黃酮提取率下降,這可能是長時間暴露物料,使黃酮氧化,其化學結構易遭到破壞,從而降低提取率,且延遲提取時間,還會促進原料中的雜質溶出,降低有效成分,增加能耗、工時等其他成本。故選擇超聲提取時間為20 min。

圖6 超聲時間對黃酮提取率的影響Fig.6 The effect of different extraction time on flavonoids yield of jackfruit peel

圖7 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.7 The effect of different extraction temperatures on flavonoids yield of jackfruit peel

2.2.4 提取溫度對黃酮提取率的影響 由圖7可看出,提取溫度對于黃酮提取率影響不顯著,當提取溫度為45 ℃時,黃酮提取率略高于其他水平實驗組。當65 ℃時提取率由下降趨勢轉為提高,其原因可能是溫度升高,造成丙酮揮發(fā)損失及其他成分的溶解度增大,從而影響總黃酮含量的測定,考慮到環(huán)保節(jié)能和黃酮物質的穩(wěn)定性,提取溫度為45 ℃比較適宜。

2.2.5 超聲提取功率對黃酮提取率的影響 圖8顯示,超聲功率對于黃酮提取率影響不顯著,當超聲功率為300 W時,黃酮提取率略高于其他水平實驗組。隨著功率增大,超聲波對細胞破碎作用增強,利于黃酮溶出;繼續(xù)增大功率,黃酮溶出達到飽和狀態(tài),在超聲作用下反而易造成局部高溫影響黃酮的穩(wěn)定性,因此設定超聲功率300 W為最佳提取功率。

圖8 不同超聲功率對黃酮提取率的影響Fig.8 The effect of different ultrasonic power on flavonoids yield of jackfruit peel

2.3 菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝優(yōu)化

表3 單因素方差分析

注:**表示p<0.01,極顯著;*表示p<0.05,顯著;表5同。2.3.1 分析單因素方差分析 利用SPSS 19.0軟件對單因素的溶劑濃度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)、提取溫度(D)、超聲功率(E)5個因素進行方差分析,由表3可知溶劑濃度、料液比和提取時間在單因素實驗中p<0.01,差異極顯著;而提取溫度和超聲功率對黃酮提取率影響不顯著(p>0.05),故由單因素方差分析可知,響應面法優(yōu)化提取工藝可固定提取溫度為45 ℃,超聲功率為300 W,以溶劑濃度、料液比和超聲時間3個因素為自變量,黃酮提取率為響應值Y進行實驗。

2.3.2 回歸模型的建立及統計檢驗 響應曲面優(yōu)化實驗結果見表4。采用軟件Design Expert 8.0 Trial對所得數據進行回歸分析,分析結果見表5。

表4 Box-Behnken實驗設計結果

表5 回歸模型的方差分析

由表5中數據可知,溶劑濃度和料液比的一次項對黃酮提取率的影響達到顯著水平(p<0.05),二次項的影響呈極顯著水平(p<0.01);超聲時間一次項和二次項均未達到顯著水平;各因素的交互項中,A與B交互作用顯著,A與C交互作用極顯著;由F值可知,各因素對黃酮提取率的影響依次為:料液比(B)>溶劑濃度(A)>超聲時間(C);方差分析結果表明,此模型達到極顯著水平(p<0.01),失擬項不顯著(p=0.2033>0.05),說明該方程擬合良好。因此,各因素值和響應值之間的關系可以用此模型來函數化,此回歸方程可對實驗結果進行分析預測。通過Design Expert 8.0 Trial軟件對表4數據進行非線性回歸的二次項擬合后,得到相應的回歸方程如下:

Y(%)=6.78+0.15A+0.27B+0.1C+0.25AB-0.3AC-0.028BC-0.58A2-1.44B2-0.1C2

2.3.3 因子交互效應分析 由上述響應面模型繪制響應面分析圖。由圖9可知,當超聲時間一定時,溶劑濃度較高值在50%～70%,料液比在1∶25左右的范圍內,隨著溶劑濃度和料液比增大,黃酮提取率顯著提高,當溶劑濃度大于70%,料液比大于1∶25后,提取率反而降低。表明最佳的溶劑濃度和料液比在設定范圍內,且二者交互作用顯著。圖10表明,在料液比一定時,溶劑濃度高值在50%～70%,增大溶劑濃度,黃酮提取率呈現先逐漸上升最終趨于平緩的變化趨勢,保持溶劑濃度不變時,黃酮提取率隨超聲時間延長而緩慢提高,二者交互作用顯著。

圖9 溶劑濃度與料液比影響菠蘿蜜皮中黃酮提取率的響應面圖Fig.9 Response surface for solvent concentration and ratio of material to liquid on flavonoids yield

圖10 溶劑濃度與提取時間影響菠蘿蜜皮中黃酮提取率的響應面圖Fig.10 Response surface for solvent concentration and extraction time on flavonoids yield

2.3.4 最優(yōu)工藝參數及驗證實驗 用Design-Expert 8.0軟件對二次多項式回歸方程進行計算求解,可得菠蘿蜜果皮中黃酮提取工藝的優(yōu)化值為:溶劑濃度61%,料液比1∶24.45,提取時間23.8 min,黃酮提取率為6.81%。為方便實驗操作,將提取工藝的最佳參數取整,即丙酮濃度61%,料液比1∶25,提取時間24 min,提取溫度45 ℃,超聲功率300 W,此條件下的驗證實驗,黃酮提取率為6.92%(單因素實驗與優(yōu)化實驗所用菠蘿蜜非同一批次,由于菠蘿蜜有季節(jié)性,而且同一個品種的菠蘿蜜不同成熟度黃酮含量也有所差異,優(yōu)化實驗所用菠蘿蜜皮的黃酮含量本身就比單因素實驗的偏低,所以導致優(yōu)化后的黃酮提取率比單因素實驗低。),與理論預測值的相對誤差為1.55%,表明該響應面預測模型可靠。

2.4 抗氧化活性評價

采用DPPH、·OH自由基清除率和還原能力為指標來綜合評價黃酮粗提液的體外抗氧化活性,以VC溶液和BHT溶液為對照,結果如表6至表8所示。

IC50值是指自由基清除率為50%時,抗氧化劑的濃度值,IC50值越小抗氧化能力越好。由表6可以看出,粗提液與VC的DPPH自由基清除率IC50值幾乎相等,表明粗提液對DPPH自由基的清除效果和VC相當,具有良好的DPPH自由基清除能力。由表7可知,樣品提取液的·OH自由基清除率的IC50值小于BHT,即二者清除·OH自由基能力為:提取液>BHT。由表8可知,同等濃度下粗提液和VC溶液,二者的還原能力的吸光值:粗提液>VC溶液,即提取液的還原能力要優(yōu)于同濃度下的VC溶液。綜合上述分析不難看出,經響應面法優(yōu)化的提取工藝所提取的黃酮粗提液有優(yōu)于VC和BHT的體外抗氧化活性。

表6 提取液和VC的DPPH自由基清除率IC50值比較

表7 提取液和BHT的·OH自由基清除率IC50值比較

表8 提取液和同濃度下的VC還原能力比較

3 結論

本研究采用超聲波輔助溶劑提取法提取菠蘿蜜果皮中的黃酮類物質,分別考察各單因素對黃酮提取率的影響并通過響應面對提取工藝進行優(yōu)化,得到各因素對黃酮提取率影響程度大小為:溶劑濃度>料液比>超聲時間>提取溫度>超聲功率,并優(yōu)化得到最佳提取工藝為:丙酮濃度61%,料液比1∶25,提取時間24 min,提取溫度45 ℃,超聲功率300 W。在此條件下進行驗證實驗,黃酮提取率高達6.92%;

比較粗提液、VC溶液和BHT溶液的DPPH、·OH自由基清除率IC50值和還原能力,得出抗氧化活性大小為:粗提液>VC溶液>BHT,表明菠蘿蜜果皮黃酮粗提液具有良好的體外抗氧化活性,值得進一步研究和開發(fā)。

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Studies on ultrasonic assisted extraction and antioxidant function of flavones from the peels ofArtocarpusheterophyllusLam

DENG Meng-qin,LIN Xiao-ying,ZHANG Ming,SONG Xian-liang*,HUANG Wei

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

Flavonoids was extracted from jackfruit peel by ultrasonic assisted solvent extraction method and the effects of different extraction solvents and extraction methods on the extraction rate of flavonoids were studied. At the same time,the effect of solvent concentration,ratio of material to liquid and extraction time on the yield of flavonoids from jackfruit peel were studied and the extraction process was optimized by the response surface experiment design. Results showed that the optimum extraction conditions were 61% solvent concentration,solid-liquid ratio 1∶25,extraction time 24 min,extraction temperature of 45 ℃,ultrasonic power 300 W.Under these conditions,the extraction rate of flavonoids could reach up to 6.9213% with a significant antioxidant ability. Moreover,the scavenging capacity of DPPH and OH free radical value(IC50)was ordered as follows:crude extract>VCsolution>BHT solution,as well as the reduction ability compared with the VCsolution and BHT solution.

jackfruit peel;flavonoids;extraction;antioxidant activity

2016-06-17

鄧夢琴(1991-)，女，碩士，研究方向：食品加工，E-mail：dmq503592509@163.com。

*通訊作者:宋賢良(1969-)，男，副教授，主要從事食品加工新技術的研究，E-mail:songxl2000@163.com。

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303077)。

TS209

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000