李 靜,鄧青云,劉愛璐,黃 文,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070;2.湖北工程學院生命科學技術學院,湖北孝感 432000)

響應面優(yōu)化微波輔助酶法提取柚皮多糖工藝

李 靜1,2,鄧青云2,劉愛璐1,黃 文1,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070;2.湖北工程學院生命科學技術學院,湖北孝感 432000)

以柚皮為原料,利用微波輔助酶法提取柚皮多糖。在單因素實驗的基礎上,選取纖維素酶與果膠酶加酶比、微波時間、微波功率為自變量,柚皮多糖得率為響應值,通過響應面實驗優(yōu)化提取工藝。結果表明:柚皮多糖提取的最佳工藝條件為酶解時間30 min,纖維素酶與果膠酶比例為1.3∶1,pH為3,加酶量2%,酶解溫度50 ℃,料液比1∶40,微波時間2.5 min,微波功率720 W。在此條件下,經(jīng)驗證柚皮粗多糖的實際得率可以達到22.8%。

柚皮,多糖,提取工藝,微波輔助酶法

柚子是蕓香科植物的成熟果實,我國作為柚子的主產(chǎn)地,柚類種植面積和產(chǎn)量都居世界前列[1]。柚皮占整個柚子的43%～48%,除含有水分、維生素、礦物質這些人體必需的營養(yǎng)素外,還含有多種對人體健康有益的生理活性成分[2-4]。柚皮多糖作為植物多糖的一種與其他的植物多糖類似。不僅含有重要的功效成分,而且具有多種生理功能,其應用的范圍也在逐步擴大[5-7]。每年柚子成熟后,大量柚皮成為垃圾,不僅污染環(huán)境而且造成資源浪費。關于柚皮多糖的提取還停留在傳統(tǒng)的提取方法階段,如熱水浸提、回流提取等[5-10],而傳統(tǒng)方法提取時間長,效率較低。本實驗引入微波這種快速、高效的提取手段以期達到提高多糖提取效率的目的。本實驗以柚子皮為原料,采用微波輔助酶法提取柚皮多糖,在單因素基礎上通過響應面優(yōu)化工藝條件,為柚皮多糖的深加工和資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宜昌蜜柚 購于華中農(nóng)業(yè)大學市場;纖維素酶(50 U/mg)、果膠酶(1000 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、濃硫酸、無水乙醇 均為分析純。

RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Avanti J-E高速冷凍離心機 Beckman Coulter公司;DF-01S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海是精益有機玻璃制品儀器廠;Apha2-4 LD凍干機 CHRIST德國;AL203分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Seveneasy型pH計 梅特勒托利多(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚皮處理 將新鮮柚子的柚皮剝下后,在55 ℃烘箱中烘干至恒重,將干柚子皮粉碎后過80目篩即得到柚皮粉備用。

1.2.2 多糖提取的單因素實驗 將經(jīng)過處理后的柚皮粉加入蒸餾水按照料液比1∶20,在酶解溫度50 ℃、pH4下水浴浸提30 min,然后利用微波輔助提取在640 W下提取1 min,抽濾得濾液,將濾液濃縮至一定體積,加入95%乙醇靜置過夜,離心,取沉淀冷凍干燥后得到柚皮粗多糖。以上述條件為基礎,分別考察不同的酶解時間(10、30、50、70、90 min),不同的pH(3、5、7、9、11),不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50),不同的加酶比(1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2),不同的加酶量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%),不同的微波功率(160、320、480、640、800 W),不同的微波時間(0.5、1、1.5、2、2.5 min)對多糖提取得率的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化設計 在單因素實驗的基礎上,選擇微波功率、微波時間和加酶比,為自變量,根據(jù)Box-Behnken設計,進行三因素三水平的響應面分析實驗,以多糖得率為響應值利用Design-Expert V8.0軟件設計實驗,并通過二次回歸分析。實驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.2.4 柚皮粗多糖得率測定

得率(%)=M1/M2×100

式中:M1為冷凍干燥后柚皮粗多糖質量(g);M2為原料質量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖,其中響應面實驗則采用Design-Expert V8.0軟件進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 酶解工藝條件對柚皮多糖提取得率的影響

2.1.1 酶解時間對柚皮多糖得率的影響 由圖1可知,當提取時間在10 min到30 min時,多糖的提取量增加非常明顯,這是由于短時間內(nèi)細胞壁的溶脹和破壞程度不夠,隨著溶解時間的增加,細胞破裂多糖得率增加[11-13];當酶解時間大于30 min后,細胞的破裂程度已經(jīng)達到最大值,多糖的得率趨于平衡;時間過長,提取時間在50 min以后,柚皮多糖的得率反而減小,其原因是多糖的溶出已經(jīng)達到平衡狀態(tài),而一些雜質隨著酶解時間的增加溶出增加,還有可能是酶解時間過長溶出的柚皮多糖發(fā)生少量降解,所以最佳酶解時間應該選取30 min。

圖1 酶解時間對柚皮多糖得率的影響Fig.1 The effect of time on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.2 pH對柚皮多糖得率的影響 由圖2中可以看出當pH為3時粗多糖的得率最高,隨著pH的升高,多糖得率不斷降低,而當pH為6時,多糖得率又陡然升高,這可能是因為兩種酶反應適合的pH范圍不同,所以酶解效果隨之受到影響,選擇pH=3最為合適。

圖2 pH對柚皮多糖得率的影響Fig.2 The effect of pH on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.3 液料比對柚皮多糖得率的影響 由圖3可知可以看出料液比對柚皮多糖提取得率的影響非常顯著,在一定范圍內(nèi)伴隨著料液比的增加,多糖的得率呈現(xiàn)顯著增加趨勢,當料液超過1∶40多糖得率不再增加,趨于穩(wěn)定。原因是多糖已經(jīng)基本全部溶解,再增加溶劑的量也不會使得溶解的多糖量增加。再增加可能會使多糖的得率減少。考慮后續(xù)工藝需要濃縮多糖提取液,過量的溶劑也會加重能耗,降低效率,因此料液比選在1∶40料液比最為合適。

圖3 液料比值對柚皮多糖得率的影響Fig.3 The effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2. 1.4 加酶比例柚皮多糖得率的影響 圖4可以看出隨著纖維素酶與果膠酶添加比例的增加,柚皮多糖的得率呈現(xiàn)先升高,然后趨于平穩(wěn),后降低的趨勢。在加酶比例在1∶2到1∶1的范圍內(nèi),柚皮多糖得率顯著增加;在加酶比例為1∶1到2∶1之間時,柚皮多糖的得率基本上保持不變;而當加酶比例繼續(xù)增加,到兩者比例大于2∶1以后,柚皮多糖提取量下降。所以選擇纖維素酶∶果膠酶為1∶1最為合適。

圖4 加酶比例值對柚皮多糖得率的影響Fig.4 The effect of cellulase-to-pectinase ratio on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.1.5 加酶量柚皮多糖得率的影響 圖5可以看出當加酶量在0.5%到2%時,柚皮多糖得率上升,這是因為在這個范圍內(nèi),增加的酶能夠與底物迅速結合,發(fā)生酶解反應,致使多糖更快的分離出來[14-15]。而酶量增加到2%以后,由于底物都已經(jīng)與酶結合,酶分子出現(xiàn)飽和,多余的酶無法與底物結合,所以即使繼續(xù)增加酶量,并不能使多糖的得率增加,多糖提取物的量趨于穩(wěn)定。經(jīng)分析得當加酶量為2%時,柚皮多糖得率最高。

圖5 加酶量值對柚皮多糖得率的影響Fig.5 The effect of total enzyme dosage on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.2 微波工藝條件對柚皮多糖提取得率的影響

2.2.1 微波功率柚皮多糖得率的影響 由圖6可以看出隨著微波功率的增加,多糖得率不斷升高,理論上在實驗范圍內(nèi)微波功率越高,多糖得率越高,而在實際過程中,當微波功率800 W時,柚皮多糖提取量不僅沒有升高卻發(fā)生下降的情況。這是因為反應體系能量增加后會加速目標物溶出,所以多糖得率提高。當功率過高時,樣品溶液的溫度就會急劇升高,多糖結構可能被破壞。所以在微波功率的選擇上還要結合實際情況,選擇640 W的微波功率最為合適。

圖6 微波功率對柚皮多糖得率的影響Fig.6 The effect of microwave power on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.2.2 微波時間柚皮多糖得率的影響 由圖7在一定范圍內(nèi)柚皮多糖得率逐漸增加與微波時間的增加有關。微波時間繼續(xù)延長,多糖得率不再提高,反而緩慢下降。微波加熱可以讓極性分子產(chǎn)生撕裂和相互摩擦發(fā)熱,而這種劇烈運動則進一步使原料細胞破裂,多糖溶出[16-19]。但是微波處理時間也不能過長。因為微波過程中溶液溫度會迅速升高,長時間的微波萃取會使溶劑中的水分蒸發(fā)速率增加,會導致溶解多糖的溶劑減少。甚至會讓已經(jīng)得到的多糖水解,所以多糖得率會有所下降。因此,最適合的微波時間為2 min。

圖7 微波時間對柚皮多糖得率的影響Fig.7 The effect of microwave time on the yield of polysaccharide from shaddock peel

2.3 響應面法優(yōu)化提取工藝條件

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理,綜合單因素影響實驗結果,選取纖維素酶與果膠酶加酶比、微波時間、微波功率對柚皮多糖得率影響顯著的三個因素,在單因素實驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行實驗設計,實驗結果見表2。

表2 三因素三水平中心組合實驗方案及結果

以柚皮多糖得率為響應值,得到的二次回歸方程為:

Y=-30.75500+0.12162A-13.05500B+34.43500C+0.023125AB-9.37500E-003AC+4.50000BC-1.15527E-004A2-1.33000B2-14.93000C2

應用Design-Expert 8.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行分析,由表3可知,模型回歸p=0.0011<0.01極顯著,失擬項p=0.7779>0.05不顯著,說明該回歸方程可以進行預測。方程系數(shù)R2=0.9468說明預測值與實際值之間有高度的相關性。

表3 回歸方程方差分析

注:*表示影響顯著(p<0.05);**表示影響極顯著(p<0.01)。其中微波功率對柚皮多糖得率影響顯著,添加酶的比例對柚皮多糖得率影響極顯著,微波時間對多糖得率影響不顯著。對多糖得率各因素影響主次順序分別為加酶比(C)>微波功率(A)>微波時間(B)。模型中C、A2、C2極顯著,A、AB顯著?？紤]因素之間的交互作用,微波時間和微波功率之間交互作用顯著。

三維空間的響應面圖能比較形象的反映各因素之間的交互作用。為進一步反映兩變量交互作用對柚皮多糖得率影響的顯著性,也作了相應的等高線圖,圖中,橢圓形則表示顯著,而圓形表示不顯著[20-21]。通過多元回歸方程借助Design-Expert 8.0軟件做響應面圖和等高線圖,微波輔助復合酶法提取柚皮多糖效果的實驗中,微波功率、微波時間和加酶比之間的交互作用對柚皮多糖得率的影響如圖8所示。

圖8 兩因素交互作用對柚皮多糖得率的響應面圖Fig.8 Response surface plot of two factors on yield of polysaccharide from shaddock peel

由圖8(a)可以看出,微波功率與微波時間的坡度陡峭。說明微波時間與微波功率之間交互作用顯著,這也與方差分析結果一致。而且微波功率的等高線比微波時間密集,說明微波功率的主效大于微波時間。

由圖8(b)可以看出微波功率與加酶比之間的等高線排列疏松且橢圓曲率小,近似圓形。說明微波功率與加酶比之間的交互作用不明顯。

由圖8(c)可以看出,微波時間與加酶比之間的坡度較為陡峭,說明兩者有一定的交互作用,但是并不顯著。

通過Design-Expert 8.0 分析可以得到提取柚皮多糖的最佳條件為:A=723.62,B=2.5,C=1.3,即微波功率為723.62 W,微波時間2.5 min,纖維素酶與果膠酶加酶比為1.3∶1,在最佳工藝情況下,最高得率為22.99%。根據(jù)實際情況對工藝參數(shù)做一定的調整為微波功率720 W,微波時間2.5 min,加酶比1.3∶1,經(jīng)過三次驗證實驗后,得到平均柚皮多糖得率為22.8%,與理論值接近,說明該回歸模型能夠很好地預測微波輔助復合酶法提取柚皮多糖的得率,優(yōu)化的最適條件是可靠且具有實際價值的。

3 結論

在酶法提取的基礎上,利用微波輔助提取柚皮多糖,不僅能夠提高多糖得率,而且具有效率高的特點。本研究在單因素實驗的基礎上利用Design-Expert V8.0軟件設計實驗,并通過二次回歸分析得到了微波輔助復合酶法提取柚皮多糖得率與微波功率、微波時間、纖維素酶和果膠酶加酶比例之間關系的回歸模型,分析可知該模型是可靠的,能夠較好預測柚皮多糖的得率。由該模型得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為纖維素酶與果膠酶加酶比1.3∶1,微波功率720 W,微波時間2.5 min,平均柚皮多糖實際得率為22.8%。

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Optimization of microwave assisted enzyme methodauthor_info_translateextraction technology of polysaccharide from shaddock peel by response surface method

LI Jing1,2,DENG Qing-yun2,LIU Ai-lu1,HUANG Wen1,*

(1.College of Food Science &Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 2.College of Life Science and Biotechnology,Hubei Engineering University,Xiaogan 432000,China)

Microwave assisted enzymaticd was used to extract polysaccharide from shaddock peel . On the basis of single factor test,the cellulase-to-pectinase ratio,microwave time and microwave power were selected as independent variables to shaddock peel polysaccharide extraction rate response by using Box-Behnken experimental and response equation. The results showed that the optimal extraction conditions were the cellulase-to-pectinase ratio 1.3∶1,reaction temperature 50 ℃,enzymolysis time 30 min,pH3,solid-solvent ratio 1∶40,microwave power 720 W,microwave time 2.5 min.Shaddock peel polysaccharides extracted utilization rate under these conditions was 22.8%.

shaddock peel;polysaccharide;extraction technology;microwave assisted enzyme method

2016-06-15

李靜(1990-)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究，E-mail：ljlipod@sohu.com。

*通訊作者:黃文(1968-)，女，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究，E-mail：huangwen@mail.hzau.edu.cn。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201503142-04)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000