于上富,靳 妲,丁秀云,徐 敏,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

10株乳酸桿菌吸附鉛離子及抗氧化能力的比較

于上富,靳 妲,丁秀云,徐 敏,霍貴成*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

為了篩選出高吸附鉛離子且具高抗氧化能力的菌株,本文對10株乳桿菌進(jìn)行了鉛離子吸附研究,以DPPH清除力、還原能力、羥自由基清除及抗脂質(zhì)過氧化能力為指標(biāo)進(jìn)行了體外抗氧化能力的評定。研究結(jié)果表明:不同乳桿菌之間的清除鉛離子能力不同,抗氧化能力也不相同,其中德式乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207具有高吸附鉛離子和高抗氧化能力,該菌株鉛離子去除率達(dá)79.18%,還原能力達(dá)99.00 μmol/L的半胱氨酸當(dāng)量,清除DPPH率為50.40%,清除羥自由基26.88%,抗脂質(zhì)過氧化能力達(dá)15.62%。此菌株可用于體內(nèi)緩解鉛中毒造成的氧化損傷的研究。

氧化損傷,乳桿菌,抗氧化性,生物吸附

鉛是一種具有神經(jīng)毒性的重金屬元素,是人體非必需元素,廣泛存在于工作環(huán)境和生活環(huán)境中[1],如,化妝品、油漆、汽油、水管、玩具、餐具等[2-3]。長期暴露可以逐漸增加機(jī)體對鉛的吸收,造成人和動物機(jī)體的一些功能障礙[4-5]。已有研究報道,鉛對人體產(chǎn)生氧化損傷[6-8],導(dǎo)致神經(jīng)紊亂[9]以及對腎臟、造血、消化等系統(tǒng)產(chǎn)生影響。其中,鉛可以影響腎小管的上皮細(xì)胞的線粒體的功能,抑制ATP酶的活性,破壞線粒體膜的通透性等。這些都可以促使脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生活性氧、自由基等,超出自身的氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié),從而引起組織的氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生。為緩解機(jī)體的這種氧化損傷,可以合理的攝入抗氧化劑。目前研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌除了具有降低膽固醇、抗癌、治療結(jié)腸癌、增強(qiáng)免疫力等優(yōu)點(diǎn)外[10-11]。乳酸菌在體內(nèi)和體外具有抗氧化能力已被證實(shí)[12-15]。故篩選具有較高吸附鉛離子能力和抗氧化能力的乳酸菌,可以為患有鉛中毒的人們進(jìn)行緩解癥狀,開發(fā)擁有雙重功能的乳酸菌產(chǎn)品,具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳品工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC)擁有著豐富的乳酸菌資源,包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬和酵母屬等7個屬,共計(jì)592株。經(jīng)過近些年的研究,已篩選出具有多種功能的菌株,如降低膽固醇的植物乳桿菌KLDS1.0386[16],抑菌功能的短乳桿菌KLDS1.0355、嗜酸乳桿菌KLDS-AD1和KLDS1.0901[17]等。已有研究表明,乳酸桿菌具有吸附重金屬的能力,如鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌等[18-20]。因此,開展乳酸桿菌吸附重金屬研就逐漸成為熱點(diǎn),本研究通過對本實(shí)驗(yàn)室的10株乳酸桿菌進(jìn)行重金屬吸附實(shí)驗(yàn),并對其的抗氧化能力進(jìn)行分析和評價,旨在篩選出具有雙重能力的乳酸菌,為開發(fā)乳酸菌緩解鉛中毒提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10株乳桿菌 均分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,經(jīng)過16S rDNA測序鑒定分別為:嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、植物乳桿菌KLDS1.0386、植物乳桿菌KLDS1.0344、德氏乳桿菌保加利亞亞種KLDS1.0207、鼠李糖乳桿菌KLDS1.0205、鼠李糖乳桿菌KLDS1.0911、鼠李糖乳桿菌KLDS1.0912、瑞士乳桿菌1.0903、副干酪乳桿菌KLDS1.0351,教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供;酵母粉 英文OXOID公司;蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、無水乙醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀 奧博星生物技術(shù)公司;DPPH、鄰二氮菲、半胱氨酸、抗壞血酸、TBA、BHT 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;硝酸鉛 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鉛標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純) 德國默克集團(tuán)有限公司。

CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;紫外可見分光光度計(jì)DU800 美國BECKMAN公司;電子天平 PL2002 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;900H原子吸收光譜儀 美國PERKINELMER公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)與菌體制備 將乳酸菌以2%的接種量接于MRS液體培養(yǎng)基[21]中,置于37 ℃下培養(yǎng)24 h后,以同樣的方式培養(yǎng)兩代,收集18 h的菌體,將其置于8000×g,20 min,再用無菌的生理鹽水洗滌3次,再次離心,直至上清澄清。

1.2.2 鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別取一定體積的1000 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用20%的硝酸按比例稀釋成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液。以鉛離子質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)繪制鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.01890X+0.01197,相關(guān)系數(shù)R2為0.9993。以鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中鉛含量。鉛離子去除率的計(jì)算公式如下:

式中:RE為鉛離子去除率,%;Ci為最初的金屬離子質(zhì)量濃度,mg/L;Ce為平衡時的溶液中的金屬離子質(zhì)量濃度,mg/L。

1.2.3 吸附鉛離子能力的測定 將上述制備的菌體溶于含50 mg/L鉛離子的水溶液中,使菌體濃度達(dá)到1 g/L,置于37 ℃下培養(yǎng)24 h后,于8000×g下離心20 min,收集上清后,用火焰原子吸收法測定鉛離子含量。

1.2.4 乳酸菌細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞破碎液的制備 取18 h的二代培養(yǎng)基,于8000×g,4 ℃下離心20 min,收集菌體,用無菌的生理鹽水沖洗兩次后,重新懸浮于生理鹽水中,使菌液濃度為1.0×109CFU/mL,即得細(xì)胞懸浮液(IC)。

將上步收集細(xì)胞懸浮液,在冰浴條件下經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行破碎,工作參數(shù)參考白明[22],顯微鏡下觀察無完整菌體,然后于6000×g,離心10 min,收集上清,即為無細(xì)胞提取物(CFE),備用。

1.2.5 乳酸菌還原活性的測定 乳酸菌還原活性參照Lin等人[23]方法測定,并有適當(dāng)改動。取0.5 mL樣品加入0.5 mL 1%的鐵氰化鉀和0.5 mL的PBS(pH=7.2)混勻后,于50 ℃下放置20 min,快速將其冷卻,加入0.5 mL的10%的TCA,再4000 g,5 min,取上清1 mL加1 mL的0.1%的三氯化鐵混勻,靜止10 min,測700 nm處吸光度。設(shè)置不同劑量的半胱氨酸組作為標(biāo)準(zhǔn),將樣品的吸光度值,換算為標(biāo)準(zhǔn)組的劑量(μmol/L)

1.2.6 乳酸菌清除DPPH自由基能力的測定 乳酸菌清除DPPH自由基能力根據(jù)Lin等人[24],翟齊嘯等人[25]的方法進(jìn)行測定,取1 mL的樣,加入1 mL的0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光放置30 min,隨后于7000 g,離心1 0 min,取上清測其517 nm處吸光值,以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零。按照以下公式計(jì)算其清除力:

式中,A空為1 mL樣品和1 mL無水乙醇反應(yīng)的吸光值;A對為1 mL PBS和1 mL DPPH反應(yīng)的吸光值,每組重復(fù)三次,取平均值。

1.2.7 乳酸菌清除羥基自由基能力的測定 乳酸菌清除羥基自由基能力參照Zhang等人和劉洋等人[26-27]的方法進(jìn)行測定。將1 mL的2.5 mmol/L的1,10-菲羅啉,1 mL PBS(pH7.2),1 mL 樣品,1 mL FeSO4混勻,,添加1 mL的雙氧水到上邊混合物中,置于37 ℃下1.5 h,測定536 nm的吸光度,并用蒸餾水做調(diào)零。按照下面公式計(jì)算其清除能力。

式中,A空為用1 mL蒸餾水取代1 mL樣品的吸光值,A對為1 mL的蒸餾水取代1 mL雙氧水的吸光值,每組重復(fù)三次,取平均值。

1.2.8 乳酸菌抗脂質(zhì)氧化能力的測定 乳酸菌抗脂質(zhì)氧化能力參照葛偉,Sabokbar等人和Wang等人[6,28-29]的方法進(jìn)行測定,并作適當(dāng)改動。在1 mL卵磷脂溶液中分別加入0.5 mL PBS(pH7.2)、0.2 mL的0.01%硫酸亞鐵、0.2 mL的0.01%的抗壞血酸,0.5 mL樣品,混勻后置于37 ℃下避光12 h,取2 mL混合液加入0.2 mL的4%的TCA,0.2 mL的0.8% TBA,0.2 mL的0.4%的BHT,置于90 ℃下25 min,冷卻后,加入2 mL的氯仿,4000 g,室溫下離心10 min,取上清測532 nm處吸光值。按照下面的公式計(jì)算其抗脂質(zhì)氧化能力:

式中,A空為PBS取代樣品的吸光值。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,運(yùn)用SPSS 19.0和Origin 9.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌吸附鉛離子能力的篩選

由圖1可以看出,各個菌株之間差異性不同,KLDS1.0207和KLDS1.0903差異不顯著,且與KLDS1.0351差異顯著,去除率在22.47%～79.18%之間,其中KLDS1.0207菌的鉛去除率最高,為79.18%,KLDS1.0351菌的鉛去除率最低,為22.47%。乳酸菌是革蘭氏陽性菌,細(xì)胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸、脂磷壁酸、S-蛋白組成,表面有羧基、羥基、磷酸根、氨基等陰離子基團(tuán)[30]。不同菌株的這些基團(tuán)的的含量也是不同的[31]。通過一定方法減少表面的羧基基團(tuán),發(fā)現(xiàn)菌株吸附金屬的量也減少[32]。當(dāng)與溶液中金屬陽離子接觸時,這些基團(tuán)可能參與,從而形成含鉛的顆粒聚集在菌體表面[33]。Halttunen等人[18]研究發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌的鉛去除率范圍在39.70%～69.60%,這與本文所得結(jié)果極為相近。

圖1 乳酸菌在50 mg/L的鉛離子溶液中的對鉛的吸附能力Fig.1 Pb binding ability of LAB strains when incubated with an initial Pb concentration of 50 mg/L注:不同小寫字母代表差異性不同(p<0.05),字母相同代表無差異;圖2～圖5同。

2.2 乳酸菌還原能力

鐵氰化鉀還原法的測定原理是:具有還原性的物質(zhì)將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀與三價鐵離子反應(yīng)生產(chǎn)不溶的普魯士藍(lán),普魯士藍(lán)的最大吸收波長在700 nm[34]。

一般情況下,還原能力越強(qiáng)代表其抗氧化能力強(qiáng)。由圖2可知,菌株之間差異性不同,菌體的還原能力范圍在47.00～106.50 μmol/L的L-半胱氨酸之間,其中KLDS1.0344的還原能力最高(106.50 μmol/L),其次是KLDS1.0207(99.00 μmol/L),KLDS1.0912的還原能力最弱(47.00 μmol/L)。細(xì)胞提取物的還原能力范圍在39.70～97.40 μmol/L的L-半胱氨酸之間,其中KLDS1.0207最大(97.40 μmol/L)、其次KLDS1.0344(87.30 μmol/L)、KLDS1.0911最小(39.70 μmol/L)。Zhai等[25]人測定CCFM8610的還原能力等同于99.41 μmol/L的L-半胱氨酸,這個結(jié)果與KLDS1.0207極為相近,略低于KLDS1.0344。

圖2 乳酸菌的還原能力Fig.2 Reducing activity of LAB

2.3 乳酸菌清除DPPH的能力

DPPH自由基有單電子,其乙醇溶液呈現(xiàn)紫色,且在517 nm處有強(qiáng)吸收,當(dāng)有自由基清除物質(zhì)存在是,可以與其單電子配對,使其在517 nm處吸收減弱或消失,這種褪色程度與接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系,由此可以定量分析生物試樣和食品的抗氧化能力。

圖3 乳酸菌對DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rates of LAB against DPPH free radical

由圖3可知,不同菌株之間的DPPH自由基清除能力差異性不同,大部分菌株的DPPH清除率比對應(yīng)的細(xì)胞提取物較高,僅有KLDS1.0344、KLDS1.0912的細(xì)胞提取物比菌株的DPPH清除率高。其中,菌株KLDS1.0207、KLDS1.1003、KLDS1.0903的DPPH清除能力較高,分別為50.40%、47.31%、47.46%,KLDS1.0912的DPPH清除能力最弱,為36.01%;KLDS1.0344、KLDS1.0912、KLDS1.0207的細(xì)胞提取物較高,分別為:42.10%、40.20%、33.60%,KLDS1.0911的細(xì)胞提取物的清除DPPH能力最弱為18.30%。Kachouri等人[35]對植物乳桿菌的清除DPPH自由基能力為57.07%,這個結(jié)果高于本文所供菌株的DPPH自由基清除能力。

2.4 乳酸菌清除羥自由基能力

將雙氧水與鄰二氮菲-Fe+2混合反應(yīng),產(chǎn)生羥自由基和鄰二氮菲-Fe+3,橙黃色的鄰二氮菲-Fe+2在536nm處的吸收峰消失,稱為芬頓反應(yīng)[36],且羥自由基具有強(qiáng)化氧化性,利用乳酸菌對產(chǎn)生的羥自由基進(jìn)行清除,以此來評價抗乳酸菌的氧化能力。具體結(jié)果如圖4所示。

圖4 乳酸菌對羥自由基的清除率Fig.4 Scavenging rates of LAB against hydroxyl radical

由圖4可知,菌株KLDS1.0386,KLDS1.0344、KLDS1.0911、KLDS1.0207的清除羥自由基能力較高,分別為33.15%、28.85%、27.60%、26.88%,KLDS1.0903的清除羥自由基能力最低,為12.23%;KLDS1.0386、KLDS1.0207、KLDS1.0903的細(xì)胞提取物對羥自由基的清除率較高,分別為:33.00%、26.33%、23.53%,KLDS1.003的細(xì)胞提取物對羥自由基的清除能力最弱,為12.20%。

2.5 乳酸菌抗脂質(zhì)過氧化能力

采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定抗脂質(zhì)過氧化的能力。脂質(zhì)過氧化是多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)的氧化變質(zhì),產(chǎn)生自由基,打破氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)平衡,從而引起損傷生物膜等組織,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[37]。

圖5 乳酸菌對抗脂質(zhì)過氧化的抑制率Fig.5 Inhibitory rate of LAB on lipid peroxidation

由圖5可知,菌株KLDS1.0386、KLDS1.1003、KLDS1.0205、KLDS1.0351的抗脂質(zhì)過氧化能力較高,分別為31.61%、29.89%、26.82%、18.30%,KLDS1.0912的抗脂質(zhì)過氧化能力最弱,為8.72%;KLDS1.1003、KLDS1.0386、KLDS1.0205的細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力較高,分別為:27.60%、25.20%、24.37%,KLDS1.0912的細(xì)胞提取物的抗脂質(zhì)過氧化能力最弱,為11.83%。

3 結(jié)論

對10株乳酸菌吸附鉛離子的能力和體外抗氧化能力評價進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,10株菌株均有吸附鉛離子的能力和抗氧化能力,但不同菌株及對應(yīng)的細(xì)胞提取物之間存在顯著性差異(p<0.05)。其中,KLDS1.0207菌株的DPPH清除能力、清除羥自由基能力、還原能力三個指標(biāo)較其他菌株能力強(qiáng),同時,其具有最高的去除重金屬的能力。結(jié)合以上結(jié)果,與其他菌株相比,KLDS1.0207菌株進(jìn)行體內(nèi)抗氧化能力具有明顯優(yōu)勢,因此,在未來的研究中,我們可以利用該菌株進(jìn)行體內(nèi)緩解鉛中毒造成的氧化損傷的評價,為深入研究提供有價值的參考。

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Invitroantioxidant activity of ten strains of lactobacillus with sequestering lead ions

YU Shang-fu,JIN Da,DING Xiu-yun,XU Min,HUO Gui-cheng*

(Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,College of Food Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select strains of high adsorption of lead ions strains and has antioxidant capacity,the 10 strains of lactobacillus of lead ions adsorption experiment were conducted in this experiment,and the antioxidant capabilities of 10 strains of lactic acid bacteriainvitrowere evaluated through reducing radical activity assay,scavenging DPPH free radicals,scavenging hydroxyl free radical and inhibiting linoleic acid peroxidation. The ability to remove lead ions between different Lactobacillus different,not the same antioxidant capacity.The results showed that KLDS 1.0207 had the capacity of sequestering lead ions was 79.18%,reducing power up to 99.00 μmol/L cysteine equivalents. Scavenging action level of DPPH and hydroxyl free radicals were 50.40%,26.88% respectively.In liposome system,anti-lipid peroxidation resistance only reached 15.62%.This strain can be used to alleviate the oxidative damage in the body caused by lead poisoning.

oxidative damage;lactobacillus;oxidation resistance;biosorption

2016-05-24

于上富(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：yushangf@163.com。

*通訊作者:霍貴成(1958-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

國家自然科學(xué)基金(31401512)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA100902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000