秦玲麗,李雪晴,崔堂兵

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006)

秦玲麗,李雪晴,崔堂兵

(華南理工大學生物科學與工程學院,廣東廣州 510006)

本研究通過初篩(魔芋粉為唯一碳源并結合剛果紅染色法)和復篩(利于對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷法測定β-甘露糖苷酶活力),從采集的森林土壤中篩選產(chǎn)β-甘露糖苷酶的菌株,獲得1株酶高產(chǎn)菌株B19。通過顯微形態(tài)、革蘭氏染色、生理生化特征、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析等方法,將其鑒定為腸桿菌屬(Enterobactersp.)。菌株B19所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶為胞內酶,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h后,測得的酶活力為1.26 U/mL。初步酶學性質研究表明:該酶的最適反應pH和最適反應溫度分別為7.5和50 ℃,且在pH6.0 ～ 8.0和溫度45 ～ 50 ℃穩(wěn)定性較高,濃度為10 mmol/L的Mn2+和Mg2+對該β-甘露糖苷酶具有激活作用,但K+、Fe2+、Ca2+、Cu2+、Co2+及Zn2+抑制酶活力。該菌株可作為產(chǎn)β-甘露糖苷酶的潛在菌株。

β-甘露糖苷酶,篩選,鑒定,腸桿菌屬,酶學性質

β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)屬于外切水解酶類,又稱β-D-甘露糖苷甘露糖水解酶、外切-β-D-甘露聚糖酶,它能夠催化結合甘露寡聚糖末端非還原性的β-1,4-D-糖苷鍵,并切下一個甘露糖分子,是甘露聚糖完全降解所必需的水解酶[1-2]。

已知產(chǎn)β-甘露糖苷酶的生物有很多,如細菌、真菌、古生菌、酵母等微生物[3-6]。β-甘露糖苷酶廣泛應用于食品、石油、造紙、制藥等領域。在食品行業(yè)中,β-甘露糖苷酶被用于咖啡豆發(fā)酵處理,降解咖啡豆中的甘露聚糖,以提高咖啡的質量[7];在石油和天然井氣的開發(fā)過程中,需要β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶一起作用降解膠狀半乳甘露聚糖以降低粘度,從而利于液壓破碎[8];在造紙行業(yè)中,β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶協(xié)作降解有色的半纖維素成分,從而加速紙張的漂白[9];制藥行業(yè)中,因β-甘露聚糖酶轉糖基的作用,已經(jīng)替代化學方法生產(chǎn)功能性甘露寡糖[10]。因此,篩選選育酶活力高的β-甘露糖苷酶產(chǎn)生菌株,具有巨大應用潛力。

本研究從采集的森林土壤樣品中篩選分離β-甘露糖苷酶產(chǎn)生菌株,對酶產(chǎn)量最高的菌株B19進行生理生化和分子生物學的鑒定,并初步研究其酶學性質,旨在為β-甘露糖苷酶的研究及生產(chǎn)提供菌種資源,同時為構建基因工程菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用的森林土壤樣品 采集于河南省信陽市;對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Mannopyranoside,pNPM)美國Sigma公司;對硝基苯酚(pNP) 天津科密歐公司產(chǎn)品;細菌基因組DNA抽提試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司;膠回收試劑盒、2×Premix LA Taq酶、DL2000 DNA Marker TaKaRa公司(寶生物工程大連有限公司);革蘭氏染色試劑盒 廣州華奇盛有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

BS224電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;SP510全自動高壓滅菌鍋 日本YAMATO公司;GZX-9140數(shù)顯鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;SKY-200D恒溫搖床 廣州科橋實驗技術設備有限公司;LRH-250-Z恒溫培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠;PCR反應擴增儀 東勝創(chuàng)新生物技術科技有限公司;DDY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;全自動凝膠成像儀 BIO-RAD公司;CX 41光學顯微鏡 奧林巴斯公司;Eppendorf冷凍離心機 德國Eppendorf公司;超聲波細胞破碎儀 美國SONICS公司;HH-S型水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基(%) 魔芋粉1.0,酵母粉0.2,蛋白胨1.0,NaCl 0.5,K2HPO40.1,調pH7.0 。

1.2.2 選擇培養(yǎng)基(%) 魔芋粉1.0,NaNO30.3,K2HPO40.1,MgSO4·7H2O 0.03,NaCl 0.1,CaCl2·H2O 0.005,瓊脂粉1.6,調pH7.0。

1.2.3 種子培養(yǎng)基(%) 蛋白胨1.0,酵母粉0.5,葡萄糖1.0,NaCl 0.5,pH7.0。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基(%) 魔芋粉1.0,酵母粉0.2,蛋白胨1.0,NaCl 0.5,K2HPO40.1,調pH7.0。

1.3 產(chǎn)β-甘露糖苷酶菌株的分離與篩選

根據(jù)參考文獻[11]報道的方法并稍做調整進行β-甘露糖苷酶產(chǎn)生菌株的分離與篩選。

1.3.1 樣品富集 稱取10.0 g采集的森林土壤樣品到50 mL/250 mL富集培養(yǎng)基中(裝有數(shù)顆滅菌的小玻璃珠),在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.2 初篩 取1 mL培養(yǎng)48 h的富集培養(yǎng)基加入到9 mL無菌生理鹽水中并對其進行梯度稀釋。分別取100 μL稀釋106、107、108、109倍的富集培養(yǎng)基涂布到選擇培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)至平板上長出菌落,挑取單菌落點種到新的選擇培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)48 h后,用1.0 g/L剛果紅溶液染色30 min,再用1.0 mol/L的NaCl溶液脫色30 min。挑取剛果紅染色后菌落周圍形成水解圈的菌株進行劃線純化并保藏在種子培養(yǎng)基斜面上,作為復篩供試菌株。

1.3.3 復篩 將斜面保藏的供試菌株轉接到50 mL/250 mL的液體種子培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h,種子液按1∶100的比例接入到50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,收集發(fā)酵上清液和菌體,利于對硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷法測定β-甘露糖苷酶活力,把產(chǎn)酶最高的菌株作為實驗菌株并對其進行菌種鑒定。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)特征 根據(jù)參考文獻[12],在無菌操作條件下,將實驗菌株轉接至LB培養(yǎng)基平板上,37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h,觀察菌落的大小、形狀、邊緣、凹凸度、表面和顏色等特征。

1.4.2 生理生化特征鑒定 參照《常見細菌鑒定手冊》[13]和《伯杰細菌鑒定手冊》[14]進行菌種生理生化鑒定。

1.4.3 16S rDNA的測定 按照鄧毛程等[15]介紹的方法并稍有改動,用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取實驗菌株的總基因組DNA,并將其作為PCR擴增模板,利用16S rDNA測序通用引物,上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和下游引物1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′對16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增反應體系(50 μL):2×Premix LA Taq酶25 μL;10 mmol/L上游引物2 μL;10 mmol/L下游引物2 μL;模板基因組DNA 1 μL;ddH2O 20 μL。PCR擴增反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s;57 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s;共30個循環(huán);最后72 ℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,膠回收目的片段送交至廣州艾基生物技術有限公司完成測序,同源性序列比對用NCBI中的BLAST軟件進行分析,系統(tǒng)發(fā)育進化樹用MEGA 6.06 軟件中Neighbor-Joining法構建[16]。

1.5β-甘露糖苷酶活力測定

1.5.1 對硝基苯(pNP)標準曲線繪制 用0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液配制1.0 mmol/mL的對硝基苯酚標準液,分別精確量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.9、1.0 mL對硝基苯酚標準液,用pH7.0的磷酸緩沖液定容至10 mL,以空白作為參照,測定在410 nm的OD值,繪制對硝基苯標準曲線[11]。

1.5.2β-甘露糖苷酶活力測定 收集發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵上清液和菌體,并在菌體中加入適量pH7.0的磷酸緩沖液,破壁,離心,留上清液即為菌體粗酶液。酶活測定按照張敏等[17]介紹的方法并稍有改動,反應體系為:在50 μL的5 mmol/L底物 pNPM(0.1 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液配制)中加入250 μL待測酶液,于50 ℃水浴中恒溫反應30 min后立即加入2 mL 1.0 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,在410 nm處測定釋放的pNP的OD值。β-甘露糖苷酶活力定義為:在50 ℃和pH7.0條件下,以1 min內分解pNPM生成1 μmol pNP所需的酶量定義為一個單位酶活。

1.6β-甘露糖苷酶的酶學性質研究

根據(jù)參考文獻[18]報道的方法進行β-甘露糖苷酶的酶學性質研究。

1.6.1 pH對酶活力的影響 取適量的粗酶液分別與pH為4.0～10.0的底物pNPM在50 ℃條件下反應30 min,測定β-甘露糖苷酶活力,確定該酶最適反應pH。

1.6.2 溫度對酶活力的影響 取適量的粗酶液與底物pNPM分別置于不同溫度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)下反應,測定β-甘露糖苷酶活力,確定該酶的最適反應溫度。

1.6.3 酶的pH穩(wěn)定性 取適量的粗酶液分別置于pH為4.0 ～ 10.0緩沖液中,37 ℃條件下保溫1 h,在最適pH和最適溫度下測定β-甘露糖苷酶活力,以未處理的粗酶液酶活力作為對照。

1.6.4 酶的溫度穩(wěn)定性 取適量粗酶液分別置于不同溫度(40、45、50、55、60 ℃)下保溫10、20、40、60、90、120、150和210 min。在最適pH和最適溫度下測定β-甘露糖苷酶活力,以未處理的粗酶液酶活力作為對照。

1.6.5 金屬離子對酶活力的影響 在底物pNPM中加入不同的金屬離子,金屬離子的終濃度為10 mmol/L,研究其對β-甘露糖苷酶活力的影響。在最適pH和最適溫度的條件下測定β-甘露糖苷酶活力,以未加金屬離子的粗酶液酶活力作為對照。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有數(shù)據(jù)都是3次平行實驗取其平均值,采用MEGA 6.06和Origin 8.0作圖分析。

2 結果與討論

2.1 菌株篩選

以魔芋粉為唯一碳源,并結合剛果紅染色的方法從選擇培養(yǎng)基中分離具有明顯水解圈的菌株,多次劃線后獲得純菌株,將其進行發(fā)酵產(chǎn)酶實驗,以pNPM為底物測定β-甘露糖苷酶活力大小,篩選出一株最佳產(chǎn)酶菌株B19。該菌株的水解圈直徑為1.71 cm,菌落直徑為0.47 cm,水解圈直徑與菌落直徑的比值為3.64 cm。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株B19的形態(tài)學觀察 將菌株B19在LB固體培養(yǎng)基平板上倒置培養(yǎng)24 h后,在自然光下肉眼可觀察,該菌落中等大小,圓形,邊緣整齊,中心稍突起,表面光滑,呈淡黃色且無色素產(chǎn)生(圖1A);為革蘭氏陰性菌(圖1B);在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡下觀察該菌呈棒狀,菌長約0.6 ～ 0.7 μm、寬約0.6 ～ 1.7 μm(圖1C和圖1D)。

圖1 菌株B19的形態(tài)Fig.1 The morphology of strain B19注:A菌株B19的菌落形態(tài);B菌株B19革蘭氏染色后細胞形態(tài)(1000×);C菌株B19的掃描電鏡形態(tài)(15000×);D菌株B19的透射電鏡形態(tài)(7000×)。

2.2.2 生理生化特性 對篩出的菌株B19做生理生化實驗,其生理生化特征結果見表1。

表1 菌株B19主要生理生化特征

注:+:陽性,-:陰性。2.2.3 16S rDNA序列分析 經(jīng)測序,菌株B19的16S rDNA大小為1439 bp(圖2),將該序列在NCBI中的BLAST軟件進行同源性序列比對分析,根據(jù)比對結果選取同源性較高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)。結果表明:該序列與腸桿菌屬(Enterobactersp.)細菌相似性達99.0%。菌株B19與相關的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看到,B19與Enterobactercloacaesubsp.dissolvensM940(HQ651840)和Enterobactercloacaesubsp.dissolvensM354(HQ651837)親緣關系最近,綜合以上形態(tài)和生理生化特征,可以確定菌株B19為腸桿菌屬(Enterobactersp.),GenBanK登錄號為KU500561。

圖2 菌株B19的16S rDNA電泳圖 Fig.2 The electrophoretogram of 16S rDNA 注:M:2000bp Marker;1 ～ 3:PCR產(chǎn)物。

圖3 基于16S rDNA 序列建立的菌株B19和相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain B19 and other strains

2.3β-甘露糖苷酶的分布及酶活力測定

將菌株B19于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h,并分別檢測了搖瓶發(fā)酵上清液和細胞破碎液中的β-甘露糖苷酶活力,以確定β-甘露糖苷酶的分布。結果如表2所示,β-甘露糖苷酶主要分布在細胞破碎液中,其酶活力是發(fā)酵上清液的331.58倍,說明該菌株所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶是胞內酶。與已經(jīng)報道的β-甘露糖苷酶產(chǎn)生菌株相比較,比如Waino等[19]從自然界篩出一株耐鹽耐堿的產(chǎn)β-甘露糖苷酶菌株,其酶活力為0.05 U/mL,Akino等[20]從果樹地中分離出一株嗜堿芽孢桿菌(alkalophilicBacillussp.),所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶活力為0.3 U/mL,Gomes等[21]分離出的一株嗜熱子囊菌(Thermoascusaurantiacus),其β-甘露糖苷酶活力為4.0 nkat/mL。因此,本研究所篩選的菌株B19所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶活力較高。

表2 β-甘露糖苷酶的分布

注:a:細胞破碎液/發(fā)酵上清液活力。

2.4β-甘露糖苷酶的酶學性質研究

2.4.1 pH對酶活力的影響與pH穩(wěn)定性 如圖4所示,來自菌株B19的β-甘露糖苷酶的最適反應pH為7.5。由圖5可知,當pH在6.0～8.0時,該β-甘露糖苷酶具有較高的穩(wěn)定性,酶活力達70%以上,之后隨著pH的上升,酶活力迅速下降,說明該菌株產(chǎn)的β-甘露糖苷酶不耐堿。

圖4 pH對酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the enzyme activity

圖5 酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on the stability of enzyme activity

2.4.2 溫度對酶活力的影響與溫度穩(wěn)定性 由圖6可知,來自菌株B19的β-甘露糖苷酶的最適反應溫度為50 ℃。如圖7所示,該β-甘露糖苷酶在45 ～ 50 ℃保溫150 min后酶活力仍剩余60%以上,而55 ℃保溫150 min后酶活力就僅剩50%,當在60 ℃保溫150 min后檢測不到酶活力。由此可知,該菌株產(chǎn)的β-甘露糖苷酶的溫度耐受性較差。

圖6 溫度對酶活力影響Fig.6 Effect of temperature on the enzyme activity

圖7 酶的溫度穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of the enzyme activity

2.4.3 金屬離子對β-甘露糖苷酶活力的影響 圖8顯示不同金屬離子在10 mmol/L的濃度下對β-甘露糖苷酶活力的影響?？芍?0 mmol/L的Mn2+和Mg2+對該β-甘露糖苷酶活力具有激活作用;Cu2+和Zn2+明顯的抑制酶活力,K+、Fe2+、Ca2+及Co2+對該酶活力顯示不同程度的抑制作用。

圖8 金屬離子對酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ions on the enzyme activity

不同來源的β-甘露糖苷酶,其酶學性質上存在著差異。如楊先芹等[18]研究的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的β-甘露糖苷酶,它的最適pH為6.0,最適溫度為30 ～ 40 ℃之間,而本研究篩選的酶最適pH為7.5,最適溫度為50 ℃。對于金屬離子的影響,10 mmol/L的Ca2+和K+對來源于多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶活力有促進作用[22],而本研究卻與之相反,當然在其它的酶學性質上也存在差異性。所以,不同物種或菌株所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶在酶學性質上是有所差異的。

3 結論

本研究通過初篩和復篩,從采集的森林土壤中成功分離出一株產(chǎn)β-甘露糖苷酶最高的菌株B19,通過對菌株B19進行顯微形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化實驗、16S rDNA鑒定、序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析,將菌株B19鑒定為腸桿菌(Enterobactersp.)。該菌株所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶為胞內酶,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶為1.26 U/mL。跟許多關于篩選產(chǎn)β-甘露糖苷酶菌株的研究報道相比,本實驗研究的菌株B19所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶活力較高。該酶的最適反應pH和最適反應溫度分別為7.5和50 ℃,且在pH6.0 ～ 8.0和溫度45 ～ 50 ℃穩(wěn)定性較高。本研究篩選的菌株B19所產(chǎn)的β-甘露糖苷酶具有良好的應用潛力,同時為后續(xù)研究工作構建基因工程菌,以期獲得更高的產(chǎn)酶菌株奠定了一定基礎。

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Isolation,identification and enzymatic properties of the strain producingβ-mannosidase

QIN Ling-li,LI Xue-qing,CUI Tang-bing

(School of Biological Science and Bioengineering,South China University of Technology,Guangdong,Guangzhou 510006,China)

The strain B19 with high yield ofβ-mannosidase was isolated from forest soil sample using first screening(Konjac powder as the sole carbon source and Congo red staining method)and secondary screening(determination ofβ-mannosidase enzyme activity by p-Nitrophenyl-β-D-Mannopyranoside method). The strain was identified asEnterobactersp. by electron microscopy,Gram-staining,physiological and biochemical examination,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis. The strain B19 could produce intracellularβ-mannosidase,and its activity could be up to 1.26 U/mL when the strain was cultivated 48 h under the condition of 37 ℃,200 r/min. The enzymatic properties analysis showed that the optimal pH and temperature of this enzyme were 7.5 and 50 ℃,respectively. The enzyme exhibited high thermal stability when the temperature ranged from 45 to 50 ℃,or the pH value ranged from 6.0 to 8.0. The enzyme activity was activated by Mg2+and Mn2+in concentration of 10 mmol/L,but was inhibited by K+,Fe2+,Ca2+,Cu2+,Co2+and Zn2+. It might be a good candidate strain in studyingβ-mannosidase.

β-mannosidase;isolation;identification;Enterobactersp;enzymatic properties

2016-05-27

秦玲麗(1990-)，女，在讀碩士生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：lily900412@163.com。

*通訊作者:崔堂兵(1967-)，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，酶工程，生物制藥等方面的研究，E-mail：fetbcui@scut.edu.cn。

國家自然科學基金(31171732)；廣東省自然科學基金(S2013010013162)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000