朱 玲史吉平王晨光劉 莉*李保國(guó)1*周 靖

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝多糖的酶法提取工藝研究

朱 玲,史吉平2,王晨光3,劉 莉2,*,李保國(guó)1,*,周 靖3

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;2.中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

以靈芝子實(shí)體粗多糖得率為考察指標(biāo),比較了不同種類酶對(duì)靈芝多糖的提取效果,篩選出能夠提高靈芝多糖提取率的四種酶,即木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶;通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了四種酶的復(fù)配方案和最佳酶用量,即木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%,在此基礎(chǔ)上,以酶法提取過(guò)程中的四個(gè)重要參數(shù)溫度、時(shí)間、pH和液固比為自變量,靈芝粗多糖得率為因變量,采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的方法,研究了各自變量及其相互關(guān)系對(duì)粗多糖得率的影響,獲得了最佳的酶解條件為:溫度60 ℃,時(shí)間118 min,pH4.6,液固比16∶1,在此條件下粗多糖得率為4.41%,與傳統(tǒng)水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%。

響應(yīng)面法,靈芝,多糖,酶法提取,子實(shí)體

靈芝(Ganodermalucidum),又名芝草、瑞草,是一種營(yíng)養(yǎng)、保健價(jià)值極高的扇形或馬蹄形大型擔(dān)子菌[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,靈芝用于治療肝、腎病,高血壓,高血脂,神經(jīng)衰弱,心血管疾病以及抗腫瘤等都有良好的臨床療效。靈芝作為日常生活的保健滋補(bǔ)品,備受人們青睞。而靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一,現(xiàn)已成為健康產(chǎn)業(yè)的研究熱點(diǎn)。大量研究表明,靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂和降血壓等多種生物活性[2-6]。

工業(yè)上一般采用熱水提取法[7-8]提取靈芝多糖,但這種方法存在提取得率低、提取溫度高、效率低等諸多缺陷[9-11]。靈芝多糖存在于靈芝子實(shí)體的細(xì)胞壁內(nèi)壁,除了靈芝多糖以外,子實(shí)體細(xì)胞壁還含有蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維、果膠和幾丁質(zhì)等物質(zhì),這些物質(zhì)的存在都會(huì)影響多糖的提取[12]。

酶法是一種通過(guò)酶解破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)強(qiáng)化有效成分的傳質(zhì)過(guò)程,能最大限度提取中藥有效成分的方法[13],已有研究表明,采用單一酶法[14-16]能夠提高多糖的得率,同時(shí)兩種不同種類的酶[17-18]復(fù)合提取靈芝多糖的研究也有報(bào)道,而且提取效果也優(yōu)于單一酶法提取靈芝多糖,但多種酶協(xié)同作用于靈芝多糖提取的研究鮮有報(bào)道。

本研究以靈芝子實(shí)體為原料,利用復(fù)合酶法提取靈芝多糖,并用響應(yīng)面[19]分析優(yōu)化復(fù)合酶法提取靈芝多糖的最優(yōu)工藝條件,以期提高靈芝多糖的得率,為酶法提取靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和靈芝多糖的生物活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實(shí)體 龍芝二號(hào),由上海百信生物科技有限公司提供,烘干粉碎過(guò)40目篩備用;溶菌酶(2萬(wàn)U/g)、破壁酶(5萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、酸性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、中性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)和果膠酶(3萬(wàn)U/g) 均購(gòu)于南寧龐博生物工程公司;木聚糖酶(20萬(wàn)U/g) 諾維信公司;纖維素酶(200萬(wàn)U/g) 尤特爾公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高速離心機(jī) 日本Hitachi公司;水浴搖床 上海智城分析儀器制造有限公司;全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA集團(tuán);真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖的酶法提取工藝 靈芝子實(shí)體干粉5±0.01 g→加入蒸餾水100 mL→用鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)至最適pH→加酶酶提(60 ℃,120 min,135 r/min)→煮沸滅酶(10 min)→第一次水提(100 ℃,120 min,135 r/min)→離心(10000 r/min,15 min)→沉淀第二次水提(100 ℃,60 min,150 r/min)→離心(10000 r/min,15 min)→濾液合并→旋蒸濃縮至原體積的四分之一(55 ℃,120 r/min)→4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉→過(guò)濾得到濾渣→干燥(60 ℃干燥箱至恒重)→粗多糖。

在用水浴搖床對(duì)靈芝進(jìn)行提取的過(guò)程中每隔15 min對(duì)三角瓶中的樣液進(jìn)行觀察,防止靈芝樣品不能完全浸沒(méi)在液體中而不能得到充分的提取;熱水提取法為去掉酶提部分。

1.2.2 酶的篩選 按照方法1.2.1,分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、破壁酶、溶菌酶和纖維素酶,取酶量為靈芝子實(shí)體的1.5%,對(duì)靈芝子實(shí)體進(jìn)行酶法提取多糖,計(jì)算粗多糖得率,以此為考察指標(biāo)篩選提取效果較好的酶。

1.2.3 酶用量的單因素實(shí)驗(yàn) 參考張?zhí)煨17],控制酶解pH為5.0,酶解溫度60 ℃,酶解時(shí)間120 min不變,調(diào)節(jié)酶用量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,以粗多糖得率為考察指標(biāo),確定酶的最佳酶用量。

1.2.4 酶的復(fù)配及用量的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)酶用量的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纖維素酶(C)和果膠酶(D)為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken的中心設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),利用Design Expert V8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表1。

表1 酶的復(fù)配及用量響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平

1.2.5 酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 參考賀寅[20],在確定了最佳酶的復(fù)配方案和酶用量基礎(chǔ)上,選擇酶解溫度(A)、時(shí)間(B)、pH(C)和液固比(D)為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Benhnken的中心設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行四因素三水平的酶解條件的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),利用Design Expert V8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到最適酶解條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平見(jiàn)表2。

表2 酶解條件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素和水平

1.2.6 粗多糖得率的計(jì)算方法 靈芝粗多糖得率計(jì)算如式(1):

式(1)

式中:M為提取得到的粗多糖的質(zhì)量;M0為樣品的質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin軟件進(jìn)行分析,ANOVA程序進(jìn)行方差分析,當(dāng)p<0.05時(shí)認(rèn)為平均值有顯著性差異,最小顯著差異法用于數(shù)據(jù)多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對(duì)靈芝粗多糖得率的影響

圖2 酶用量對(duì)靈芝粗多糖得率的影響Fig.2 Influence of enzyme dosage on the crude polysaccharide yield

考察9種酶對(duì)靈芝多糖的提取效果,如圖1所示。由圖1可以看出:熱水提取法中的靈芝粗多糖得率為3.12%;在所選擇的4種蛋白酶中,木瓜蛋白酶中粗靈芝多糖的得率為3.35%,對(duì)靈芝多糖提取的效果最好,這可能與幾種蛋白酶的作用位點(diǎn)不同有關(guān);因?yàn)殪`芝多糖存在于細(xì)胞壁里面,而細(xì)胞壁上有幾丁質(zhì)、果膠和纖維素等物質(zhì),分別添加破壁酶、纖維素酶和果膠酶后,這些酶能促進(jìn)細(xì)胞壁的破裂,對(duì)靈芝多糖提取的會(huì)起到促進(jìn)作用,添加這三種酶處理后,靈芝粗多糖得率分別為3.37%、3.34%和3.27%;而靈芝子實(shí)體細(xì)胞壁上沒(méi)有能被溶菌酶和木聚糖酶催化分解的物質(zhì),這兩種酶對(duì)靈芝子實(shí)體細(xì)胞壁的破碎沒(méi)有起到作用,不能促進(jìn)多糖的提取,提取的得率分別為3.12%和3.13%。因此選定木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶作為靈芝多糖提取的酶源。

圖1 不同種類的酶對(duì)靈芝粗多糖得率的影響Fig.1 Influence of different kinds of enzymes on the crude polysaccharide yield

2.2 酶用量對(duì)粗靈芝多糖得率的影響

不同濃度的木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶對(duì)靈芝粗多糖得率的影響如圖2所示,由圖2可看出,隨著酶用量的增大,粗靈芝多糖的得率隨之增大,但酶用量增大到一定值之后,粗靈芝多糖的得率沒(méi)有明顯增高,說(shuō)明酶濃度已經(jīng)趨于飽和,從經(jīng)濟(jì)性考慮,確定四種酶的最佳用量分別為:木瓜蛋白酶1.5%、破壁酶2.0%、纖維素酶1.5%、果膠酶2.0%。

2.3 酶的復(fù)配及用量對(duì)靈芝多糖得率的影響

以靈芝多糖的得率(Y)為響應(yīng)值,29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)由分析點(diǎn)和零點(diǎn)組成,其中分析點(diǎn)為自變量A、B、C、D的取值所構(gòu)成的三位頂點(diǎn),零點(diǎn)為區(qū)域中心點(diǎn),其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次以便估算實(shí)驗(yàn)誤差響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酶的復(fù)配及用量的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design Expert V8.05軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸,得到粗多糖得率(Y)與木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纖維素酶(C)、果膠酶(D)四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y=-1.19692+1.44767A+0.55133B+2.41767C+1.18133D+4.8AB+0.02AC-0.06AD-0.22BC+1.12BD+0.08CD-0.72333A2-0.83533B2-0.68033C2-0.79033D2(R2=0.9352)

由表4方差分析表可知,一次項(xiàng)A(p=0.0050<0.01)、B(p=0.0098<0.01)和D(p<0.01)都極其顯著,而C(0.01FA>FB>FC,即果膠酶>木瓜蛋白酶>破壁酶>纖維素酶。

為了考察木瓜蛋白酶、破壁酶、纖維素酶和果膠酶的交互作用對(duì)粗多糖得率的影響,采用Design Expert V8.05軟件得到了交互作用顯著的破壁酶和木瓜蛋白酶、交互作用極其顯著的破壁酶和果膠酶的響應(yīng)面圖,由圖3可知,靈芝多糖得率在木瓜蛋白酶用量為1.6%時(shí)達(dá)到最大,當(dāng)木瓜蛋白酶的用量大于1.6%后,繼續(xù)增加木瓜蛋白酶用量,靈芝粗多糖的得率反而下降,這可能是因?yàn)槟竟系鞍酌阜肿舆^(guò)飽和,一部分沒(méi)有機(jī)會(huì)與底物結(jié)合,酶解效果變差;而隨著破壁酶的增大,粗靈芝多糖的得率也隨之增大,當(dāng)破壁酶用量增大到2.0%左右時(shí),靈芝多糖得率最高,繼續(xù)增加酶用量,靈芝多糖得率開(kāi)始下降,這可能是破壁酶過(guò)飽和時(shí),破壁酶除了水解細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì),也對(duì)多糖起到了水解的作用。由圖4可知,破壁酶和纖維素酶交互效應(yīng)的響應(yīng)面走勢(shì)陡峭,表明兩者交互作用對(duì)多糖提取率影響極其顯著,而這也與方差分析的結(jié)果一致。

圖3 木瓜蛋白酶與破壁酶交互作用對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Influence of the interaction of papain and lyticase on the crude polysaccharide yield

圖4 破壁酶與果膠酶交互作用對(duì)粗靈芝多糖得率的影響Fig.4 Influence of the interaction of lyticase and pectinase on the crude polysaccharide yield

表4 回歸模型方差分析表

注:**表示極顯著(p<0.0001),*表示顯著(p<0.05);表6同。

表5 酶解條件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)模型預(yù)測(cè)最佳酶用量為:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%,在此酶用量下預(yù)測(cè)靈芝粗多糖得率為3.84%。對(duì)最佳酶用量條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,得到靈芝粗多糖得率為3.67%,與預(yù)測(cè)值相比,誤差為4.42%。因此,優(yōu)化得到的酶法提取靈芝多糖的酶的復(fù)配和用量有參考價(jià)值。

2.4 酶解條件對(duì)靈芝多糖得率的影響

在確定了最優(yōu)酶的復(fù)配和用量的條件后,選擇溫度(A)、時(shí)間(B)、pH(C)、液固比(D)四個(gè)因素為自變量,以粗多糖得率(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)對(duì)靈芝多糖酶解提取條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表5。

利用Design-Expert V8.05軟件對(duì)表5中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸,得到粗多糖得率(Y)與溫度(A)、時(shí)間(B)、pH(C)、液固比(D)四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=-45.72+0.30A+0.37×B+4.89C+0.96D+0.0010AB-0.0153AC-0.0095AD+0.0004×BC+0.0006BD+0.0305CD-0.0015A2-0.0019B2-0.4949C2-0.0186D2(R2=0.9660)

表6 回歸模型方差分析表

由表6方差分析結(jié)果表明,一次項(xiàng)B(p<0.01)影響極顯著;C、D(p<0.05)影響顯著;A(p>0.05)影響不顯著;二次項(xiàng)B2、C2、D2、AD(p<0.01)影響極顯著;AB、A2(p<0.05)影響顯著;AC、BC、BD、CD(p>0.05)影響不顯著。從方差分析表可知:FA=1.60,FB=61.82,FC=15.77,FD=21.92,各因素對(duì)粗多糖得率的影響順序?yàn)?B>D>C>A,即時(shí)間>液固比>pH>溫度。

圖5為固定pH為5.0,液固比為20∶1得到交互作用顯著的酶解溫度和時(shí)間的響應(yīng)面圖,由圖5可知,隨著酶解時(shí)間的增加,多糖得率增大,當(dāng)酶解時(shí)間增加到120 min后,繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間,粗多糖得率反而下降,這可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致多糖分解;在圖示的溫度范圍內(nèi),粗多糖的得率隨溫度的變化不大,這可能是選擇的溫度范圍在復(fù)合酶的最適溫度范圍內(nèi),酶解溫度的變化沒(méi)有影響到酶的活性。圖6為固定時(shí)間為100 min,pH為5.0得到的的酶解溫度與液料比交互作用的響應(yīng)面圖,圖形的走勢(shì)極其陡峭,表明酶解溫度與料液比交互作用顯著,這也與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 酶解溫度與時(shí)間交互作用對(duì)粗多糖得率的影響Fig.5 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and time on the crude polysaccharide yield

圖6 溫度與料液比交互作用對(duì)粗多糖得率的影響Fig.6 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and liquid to solid ratio on the crude polysaccharide yield

通過(guò)模型預(yù)測(cè)得到最佳酶解條件:溫度60 ℃、時(shí)間118 min、pH4.6、液固比16∶1,在該條件下模型預(yù)測(cè)靈芝粗多糖得率為4.55%。為了驗(yàn)證模型的可靠性,對(duì)最優(yōu)的條件進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),靈芝粗多糖實(shí)際得率為4.41%,與理論預(yù)測(cè)值相比誤差為2.86%。因此,采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的酶法提取靈芝多糖的條件參數(shù)具有實(shí)用參考價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,最終得到的酶法提取靈芝多糖的工藝條件為:a.酶及酶用量:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纖維素酶1.6%、果膠酶2.3%;b.最佳酶解條件:溫度60 ℃,時(shí)間118 min,pH4.6,液固比16∶1。在此條件下靈芝粗多糖得率為4.41%,與傳統(tǒng)的水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%?？蔀閺?fù)合酶法提取靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides fromganodermalucidumusing response surface methodology

ZHU Ling1,SHI Ji-ping2,WANG Chen-guang3,LIU Li2,*,LI Bao-guo1,*,ZHOU Jing3

(1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China; 3.Shanghai Baixin Bio-Tech Co.,Ltd.,Shanghai 201401,China)

Effects of different kinds of enzymes on the extraction ofGanodermalucidumpolysaccharides have been investigated,with the crude polysaccharides yield fromGanodermalucidumfruit body as the index. The results showed that four enzymes,i.e.,papain,lyticase,cellulase,and pectinase,could increase the polysaccharides yield. The optimal combination and dosages of the four enzymes were determined by the single factor experiment method and the response surface methodology,which was papain 1.6%,lyticase 2.1%,cellulase 1.6%,and pectinase 2.3%,respectively. Then the response surface methodology was used again to determine the optimal enzymatic extraction conditions,with the temperature,time,pH value,and liquid to solid ratio as the variables,as well as the crude polysaccharides yield as the response. The optimal enzymatic extraction conditions were as follow:temperature 60 ℃,time 118 min,pH value 4.6,the liquid to solid ratio of 16∶1. Under these conditions,the crude polysaccharide yield was 4.41%,which was 41.3% higher than that of 3.12% extracted by traditional hot water extract method.

response surface methodology;Ganodermalucidum;polysaccharides;enzymatic extraction;fruit body

2016-07-07

朱玲(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：15921079038@163.com。

*通訊作者:劉莉(1982-)，女，博士，副研究員，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail: liul@sari.ac.cn。 李保國(guó)(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品和農(nóng)產(chǎn)品加工新技術(shù)，E-mail:lbaoguo@126.com。

上海市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(滬農(nóng)科轉(zhuǎn)字2015第2-2號(hào))；中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2015232)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000