周 平,羅惠波,2,*,黃 丹,鄧 波,王 慶,黃治國,2,衛(wèi)春會,2,鄧 杰,2

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室,四川自貢 643000;3.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州 646000;4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州 646000;5.長江師范學(xué)院生命科學(xué)系,重慶 408100)

中高溫大曲中一株耐熱細菌的分離鑒定及其風(fēng)味代謝產(chǎn)物分析

周 平1,羅惠波1,2,*,黃 丹1,鄧 波3,4,王 慶5,黃治國1,2,衛(wèi)春會1,2,鄧 杰1,2

(1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000;2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室,四川自貢 643000;3.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州 646000;4.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州 646000;5.長江師范學(xué)院生命科學(xué)系,重慶 408100)

目的:以培菌完成的中高溫大曲為樣品,分離鑒定耐熱細菌并對其風(fēng)味代謝產(chǎn)物進行分析。方法:通過富集培養(yǎng)和稀釋涂布分離、形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA序列分析、生長特性分析,并采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進行分析。結(jié)果:篩選出一株耐熱能力較好的細菌NR2,鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis);該細菌培養(yǎng)第4 h開始進入對數(shù)生長期,培養(yǎng)24 h達穩(wěn)定期;液態(tài)發(fā)酵可以產(chǎn)2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇等風(fēng)味物質(zhì),其中3-羥基-2-丁酮為主要代謝產(chǎn)物;固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物種類要高于液態(tài)發(fā)酵,主要是2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪類化合物含量增加。結(jié)論:曲香的形成及濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成與耐熱細菌NR2的代謝特性有關(guān)。

大曲,耐熱細菌,分離,鑒定,代謝產(chǎn)物,地衣芽孢桿菌

4.National Engineering Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou 646000,China;

5.Department of Life Science,Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

濃香型白酒是我國三大基本香型白酒之一,具有酒香濃郁、口味濃醇、香味協(xié)調(diào)的特征,深受廣大飲酒消費者的喜愛[1]。而中高溫大曲作為釀造濃香型白酒的糖化發(fā)酵劑,含有細菌、霉菌、酵母等多種微生物,這些微生物在濃香型白酒的釀造過程中共酵生成復(fù)雜的白酒成分,賦予了濃香型白酒獨特的風(fēng)格特征[2]。在中高溫大曲制曲培菌過程中,最高品溫可達到62 ℃左右,這種中高溫制曲的工藝既保留了大量中溫微生物,還富集了大量耐熱微生物,使耐熱細菌成為中高溫大曲中一類重要的優(yōu)勢功能菌[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),耐熱細菌能夠代謝3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇以及吡嗪類等香味物質(zhì),且能夠產(chǎn)生多種淀粉酶、蛋白酶等多種酶類,推動著各種生化反應(yīng)的進行[4,6-7]。白酒風(fēng)味的形成與耐熱細菌關(guān)系密切,白酒典型風(fēng)格及特征是大曲中耐熱功能細菌作用的重要體現(xiàn)[8]。

對此,我國白酒生產(chǎn)廠家和部分科研院所對這類耐熱微生物進行了積極的探索,尤其以醬香型高溫大曲中耐熱微生物的研究最多。周瑞平等[9]從偏高溫大曲中分離篩選出一株能耐70 ℃左右的細菌,經(jīng)鑒定為Lysini bacillus屬微生物,為解析多糧濃香型白酒酒體形成原因提供了一定的理論基礎(chǔ);王勇等[10]從濃香型白酒大曲中篩選出8株優(yōu)勢芽孢桿菌,經(jīng)細菌脂肪酸鑒定技術(shù)(MIDI鑒定系統(tǒng))確定為分屬于5個種。連賓等[11]從茅臺酒曲分離出多株嗜熱細菌,并發(fā)現(xiàn)枯草芽抱桿菌群是形成醬香型白酒獨特風(fēng)格的重要菌類。余婷婷等[12]對高溫大曲中產(chǎn)醬香耐高溫細菌進行了篩選,并初步鑒定為地衣芽胞桿菌,同時發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵能產(chǎn)生醬香型白酒固有的醬香味道。葛媛媛等[13]研究了芝麻香型白酒高溫大曲的嗜熱細菌群落結(jié)構(gòu),通過55 ℃高溫篩選獲得的85株嗜熱細菌,為探索形成芝麻香型白酒典型性風(fēng)格的機理奠定了基礎(chǔ)。

為研究中高溫大曲中耐熱細菌與濃香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系,本論文以培菌完成的中高溫大曲為樣品,通過富集培養(yǎng)和稀釋涂布分離得到一株耐熱能力較好的芽孢桿菌,并通過純種液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵,對其風(fēng)味代謝產(chǎn)物進行分析。為研究中高溫大曲中耐熱細菌的功能特性以及對濃香型白酒的貢獻提供實驗依據(jù),為進一步揭示濃香型白酒典型風(fēng)格與大曲耐熱細菌的相關(guān)性以及通過調(diào)控耐熱細菌代謝進而提高濃香型白酒品質(zhì)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中高溫大曲 瀘州老窖制曲生態(tài)園;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;麩皮固體培養(yǎng)基 麩皮99 g,葡萄糖1 g,水70 mL;小麥固體培養(yǎng)基 小麥100 g,水100 mL;麩皮浸出液培養(yǎng)基 麩皮100 g,α-淀粉酶2000 IU,水500 mL,靜止10 min后,加入堿性蛋白酶100000 IU,于55 ℃保持30 min,過濾取上清液;小麥浸出液培養(yǎng)基 小麥100 g,α-淀粉酶2000 IU,水500 mL,靜止10 min后,加入堿性蛋白酶100000 IU,55 ℃保持30 min,過濾取上清液。

Agligent7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;LS-I201型生化培養(yǎng)箱飛世爾實驗器材(上海)有限公司;HT300A系列自動固相微萃取儀 意大利HTA公司;Thermo1500全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;Leica DM300型正置顯微鏡 徠卡儀器(德國)有限公司;Starter2100 pH儀 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐熱細菌的分離及純化 在無菌條件下,取中高溫大曲25 g,加入225 mL生理鹽水中,然后在150 r/min轉(zhuǎn)速下混勻30 min后置于80 ℃水浴1 h;在水浴過后的曲液中取4 mL接種裝有50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中于55 ℃富集培養(yǎng)24 h。

初篩:從富集培養(yǎng)過后的發(fā)酵液中吸取1 mL發(fā)酵液加入裝有9 mL生理鹽水的試管中稀釋10倍,然后逐級稀釋成102、103、104、105倍。吸取100 μL稀釋105倍后的發(fā)酵液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,55 ℃倒置培養(yǎng)24 h,觀察菌落特征,選取差異明顯的菌落進行純化,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

復(fù)篩:將分離純化的耐熱細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,振蕩均勻后放入恒溫培養(yǎng)搖床中以120 r/min,55 ℃培養(yǎng)18 h,以8%的接種量接種于小麥固體培養(yǎng)基中45 ℃培養(yǎng)4 d。請10名進行過聞香訓(xùn)練的專業(yè)人員按酯香味(0～5分)、酸味(0～5分)、醬香味(0～5分)三種香味的強弱對產(chǎn)香情況進行綜合感官評定打分,選取能耐熱且產(chǎn)香突出的菌株作為出發(fā)菌株。

1.2.2 耐熱細菌的形態(tài)及生長特性 將分離純化后的耐熱細菌進行革蘭氏染色,通過光學(xué)顯微鏡進行觀察,對細菌的形狀、大小等進行記錄。

將耐熱細菌從斜面上取一接種環(huán)接入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,置于45 ℃,120 r/min下培養(yǎng),每隔2 h通過酶標儀測定在600 nm波長下發(fā)酵液的OD值,以培養(yǎng)時間為橫坐標、OD值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.2.3 耐熱細菌的鑒定 使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取耐熱細菌的基因組DNA,以細菌的基因組DNA為模板,用細菌16S rDNA通用引物27F和1492R作為上下游引物進行PCR擴增。PCR擴增體系和PCR反應(yīng)條件按照參考文獻[14]進行,然后將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,條件為80 V,60 min,Marker為DL2000,并將PCR產(chǎn)物送至上海杰李生物技術(shù)公司測序,測序結(jié)果上傳到EzTaxon數(shù)據(jù)庫中,然后在ezbiocloud網(wǎng)站進行Identifying搜索,比較所測得的序列與所有已測定的序列,利用MAGE6.06中的Clustal X進行多序列比對,用NJ法/鄰接法(Mega軟件)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,初步確定耐熱細菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.4 耐熱細菌液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵[15]種子液的制備:在斜面保存的菌落中取一環(huán)耐熱細菌接入裝有50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,振蕩均勻后放入恒溫培養(yǎng)搖床中以120 r/min,45 ℃培養(yǎng)18 h得種子液。

液態(tài)發(fā)酵:培養(yǎng)好的種子液,以8%的接種量分別接種于裝有50 mL麩皮浸出液培養(yǎng)基和小麥浸出液培養(yǎng)基中,以不加種子液的兩種浸出液培養(yǎng)基為空白對照,40 ℃,120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。

固態(tài)發(fā)酵:培養(yǎng)好的種子液,以8%的接種量分別接種于裝有30 g麩皮固體培養(yǎng)基和50 g小麥固體培養(yǎng)基的三角瓶中,以不加種子液的兩種固體培養(yǎng)基為空白對照,40 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.5 風(fēng)味代謝產(chǎn)物檢測[16]固相微萃取條件:精確量取4 mL液態(tài)發(fā)酵樣品(或4 g固體發(fā)酵樣品)于頂空瓶中,將頂空瓶放入全自動固相微萃取儀中,65 ℃平衡10 min后再萃取30 min。

氣相色譜條件:DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛細管色譜柱;進樣口溫度230 ℃;不分流;程序升溫:40 ℃保持1 min,5 ℃/min升到180 ℃用于1 min,再以8 ℃/min升到230 ℃保持7 min;載氣:99.999%氦氣,載氣流速:1 mL/min。

質(zhì)譜條件:電離電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電離方式EI,質(zhì)量掃描范圍20～500 amu,溶劑延遲3 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中生長曲線圖示采用origin作圖,測定結(jié)果以平均值±標準偏差表示;采用Mega6.06軟件進行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的建立;GC-MS數(shù)據(jù)利用NIST數(shù)據(jù)庫和RTLPEST數(shù)據(jù)庫進行比對分析出物質(zhì)種類,并采用面積歸一化法進行定量分析,根據(jù)某一物質(zhì)的色譜峰面積與總峰面積的比值求出其相對百分比含量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐熱細菌的分離篩選與觀察

從中高溫大曲中成功分離純化出4株耐熱細菌,編號為NR1～NR4;其綜合感官評定總分值分別為3、7、5、2分。其中耐熱細菌NR2分值最高,特別是醬香味最為突出,故選取NR2為出發(fā)菌株,NR2菌落及鏡檢結(jié)果如圖1所示。可以看出,細菌NR2在牛肉膏蛋白胨平板上,菌落呈橢圓形,表面光滑,非常濕潤,粘稠不易挑起;在油鏡下,細胞形態(tài)呈長桿狀,革蘭氏陽性。

圖1 菌株NR2菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 colony morphology and gram microscopic examination of the strain NR2

2.2 耐熱細菌NR2的生長特性

將耐熱細菌NR2在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過酶標儀在600 nm波長測定耐熱細菌生長不同時段OD值如圖2所示。細菌NR2培養(yǎng)0～4 h時,OD值幾乎沒有變化,說明這個時間段細菌NR2菌體生長速率緩慢,為生長遲緩期;從第4 h開始,OD值開始迅速上升,說明細菌NR2生長速度加快,菌體生長進入對數(shù)生長期;從第24 h開始,OD值變化趨于平緩,說明細菌NR2菌體量隨時間延長而基本保持平衡,菌體生長處于穩(wěn)定期。

圖2 耐熱細菌NR2的生長曲線Fig.2 growth curve of the strain NR2

2.3 耐熱細菌NR2分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 耐熱細菌NR2的DNA提取及PCR擴增 電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照,結(jié)果如圖3所示。耐熱細菌NR2的基因PCR產(chǎn)物與DNA marker 1500 bp的條帶基本一致,說明其分子量大約為1500 bp,與預(yù)計目標長度相一致,可以將PCR產(chǎn)物被送至測序公司測序。

圖3 菌株NR2的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 16S rDNA PCR amplification electrophoretogram of the strain NR2

2.3.2 耐熱細菌NR2的16S rDNA序列測定及分析 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)上海杰李生物技術(shù)有限公司測序,耐熱細NR2經(jīng)測序得到長度為1424 bp的基因片段,將序列上傳至EzTaxon數(shù)據(jù)庫,將其與EzTaxon數(shù)據(jù)庫中原有其它細菌的16S rDNA序列進行相似性比較,發(fā)現(xiàn)與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)都有較高的相似性,其中與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的相似性最高為100%。選取5株相似度較高的菌株序列與NR2用Clustal X進行序列比對,用Mega6.06軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4所示。

圖4 基于16S r DNA序列同源性的菌株NR2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S r DNA sequence of the strain NR2

從圖4可以看出,耐熱細菌NR2與地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)位于同一分支,同源關(guān)系可信度為100%,結(jié)果可靠。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的相似性和同源性分析,結(jié)合它的形態(tài)學(xué)特征、革蘭氏染色實驗結(jié)果,耐熱細菌NR2被鑒定可能為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

注:nd代表未檢出。2.4 耐熱細菌NR2的風(fēng)味代謝產(chǎn)物分析

2.4.1 耐熱細菌NR2液態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物 耐熱細菌NR2在麩皮浸出液和小麥浸出液中培養(yǎng)4 d后,采用頂空固相微萃取對其發(fā)酵液和空白浸出液進行萃取,然后利用GC-MS對風(fēng)味物質(zhì)進行檢測。麩皮浸出液和小麥浸出液及耐熱細菌NR2發(fā)酵液的GC-MS總離子流色譜圖如圖5、圖6所示,揮發(fā)性成分與譜庫比對結(jié)果如表1所示。

圖6 小麥浸出液和菌株NR2在小麥浸出液中發(fā)酵的總離子流色譜圖Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of wheat leaching solution and strain NR2 fermentation in wheat leaching solution

由圖5、圖6和表1可知,在麩皮浸出液和小麥浸出液中均未檢測到揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。耐熱細菌NR2在麩皮浸出液和小麥浸出液中發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物種類差異不大,在麩皮浸出液和小麥浸出液中發(fā)酵均產(chǎn)生了4種主要的風(fēng)味物質(zhì),其中兩種發(fā)酵液中共有的物質(zhì)為2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇。通過峰面積歸一法對各化合物成分在發(fā)酵液樣品中相對含量進行計算,發(fā)現(xiàn)3-羥基-2-丁酮在兩種發(fā)酵液中所占的比例最高,相對含量分別達到了84.162%、90.206%。說明在耐熱細菌NR2在麩皮浸出液和小麥浸出液兩種液體培養(yǎng)基中發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物為3-羥基-2-丁酮。研究表明,3-羥基-2-丁酮對白酒風(fēng)味的形成起到非常重要的作用,它是生成吡嗪類化合物的前體物質(zhì),與其他代謝產(chǎn)物共同作用參與到白酒特征風(fēng)味物質(zhì)的形成,特別是為醬香型白酒特征風(fēng)味香氣的形成奠定了基礎(chǔ)[17]。

2.4.2 耐熱細菌NR2固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物 耐熱細菌NR2在麩皮固體培養(yǎng)基和小麥固體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)4 d后,采用頂空固相微萃取對發(fā)酵后的培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基進行萃取,然后利用GC-MS對風(fēng)味物質(zhì)進行檢測,GC-MS總離子流色譜圖如圖7、圖8所示,揮發(fā)性成分與譜庫比對結(jié)果如表2所示。

表2 菌株NR2在麩皮和小麥固態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果

圖7 麩皮固體培養(yǎng)基和菌株NR2在麩皮固態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵的總離子流色譜圖Fig.7 GC-MS total ion current chromatogram of bran solid medium and strain NR2 fermentation in bran solid medium

圖8 小麥固體培養(yǎng)基和菌株NR2在小麥固態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵的總離子流色譜圖Fig.8 GC-MS total ion current chromatogram of wheat solid medium and strain NR2 fermentation in wheat solid medium

注:nd代表未檢出。

由圖7、圖8可知,從空白麩皮固體培養(yǎng)基和空白小麥固體培養(yǎng)基中檢測到少量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),消除空白組中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)后,兩種固體培養(yǎng)基發(fā)酵后檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)見表2。由表2可知,耐熱細菌NR2在以麩皮和小麥為發(fā)酵底物進行固態(tài)發(fā)酵分別檢測出6種、7種揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物,其中3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇在兩種固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的風(fēng)味產(chǎn)物中相對含量最高,為耐熱細菌NR2在固態(tài)發(fā)酵中的主要代謝產(chǎn)物。同時可以發(fā)現(xiàn),耐熱細菌NR2固態(tài)發(fā)酵要比液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)的揮發(fā)性風(fēng)味代謝產(chǎn)物種類要多,主要是吡嗪類物質(zhì)含量增加。兩種固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中均檢測出三種吡嗪類物質(zhì),其中2,3,5-三甲基吡嗪相對含量較其它兩種高,吡嗪類化合物是醬香型白酒中特征風(fēng)味物質(zhì),但同時也是濃香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一,其對優(yōu)質(zhì)酒陳香風(fēng)味的貢獻很大[18]。

耐熱細菌NR2在以麩皮和小麥為底物的固態(tài)發(fā)酵過程較液態(tài)發(fā)酵更為復(fù)雜,從而導(dǎo)致3-羥基-2-丁酮含量降低,而2,3-丁二醇含量上升,而且產(chǎn)生了吡嗪類物質(zhì),分析原因可能是在固態(tài)發(fā)酵過程中3-羥基-2-丁酮在各種酶的作用下通過一系列化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇和吡嗪類物質(zhì)。

3 結(jié)論

耐熱細菌是中高溫大曲在培菌過程中非常重要的菌種,為了研究中高溫大曲中耐熱細菌與濃香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)之間的聯(lián)系,以培菌完成的中高溫大曲為樣品,通過富集培養(yǎng)和稀釋分離得到一株耐熱能力較好的細菌NR2,經(jīng)培養(yǎng)特征形態(tài)觀察以及16S rDNA序列分析,鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。通過對耐熱細菌NR2的生長特性研究發(fā)現(xiàn):NR2從培養(yǎng)第4 h開始進入對數(shù)生長期,培養(yǎng)24 h達穩(wěn)定期;通過對耐熱細菌NR2的發(fā)酵特性研究發(fā)現(xiàn):耐熱細菌NR2在麩皮固體培養(yǎng)基、麩皮液體培養(yǎng)基、小麥固體培養(yǎng)基及小麥液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)4 d后,采用頂空固相微萃取和GC-MS對風(fēng)味物質(zhì)進行檢測,從液態(tài)發(fā)酵液中檢測到2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇等風(fēng)味物質(zhì),其中3-羥基-2-丁酮為主要代謝產(chǎn)物;固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類要高于液態(tài)發(fā)酵,主要是2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪類化合物含量增加。

高溫轉(zhuǎn)化期是中高溫大曲制曲生產(chǎn)中重要工序,在制曲品溫升高過程中,絕大多數(shù)霉菌死亡,酵母菌數(shù)量幾乎為零,耐熱細菌成為唯一優(yōu)勢菌群;加強對耐熱細菌在白酒釀程中產(chǎn)酶及風(fēng)味代謝的研究,不僅有利于用科學(xué)方法和原理指導(dǎo)生產(chǎn)、改進白酒生產(chǎn)工藝,同時還可以為進一步闡明白酒典型風(fēng)格特征的形成機理奠定基礎(chǔ),從而可以提高酒體的質(zhì)量。

[1]李維青. 濃香型白酒流派[J]. 釀酒科技,2009(12):112-116.

[2]黃祖新,蔣詠梅,許旭萍. 強化高溫大曲與傳統(tǒng)高溫大曲的香氣物質(zhì)比較分析[C]. 中國首屆微生物與白酒釀造技術(shù)研討會. 2013.

[3]劉前生,時衛(wèi)平. 從枝江大曲釀造微生物狀態(tài)看產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)格的形成[J]. 釀酒科技,2004(1):48-49.

[4]姚粟,張明娟,劉勇,等. 芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱功能菌的篩選與鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(7):18-23.

[5]周瑞平,王濤,陳云宗,等. 偏高溫大曲發(fā)酵過程中可培養(yǎng)細菌群落研究[J]. 食品科學(xué),2013,34(13):198-201.

[6]林群,董勝,付秋香,等. 產(chǎn)香風(fēng)味枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分離及發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析[J]. 釀酒科技,2013(11):30-32.

[7]馬校衛(wèi),顏林春,湯二將,等. 高溫大曲中產(chǎn)耐熱性蛋白酶芽孢桿菌的篩選和鑒定[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(15):169-173.

[8]吳群,徐巖. 高溫大曲中地衣芽胞桿菌(BacilluslicheniformisCGMCC3963)的耐高溫特征[J]. 微生物學(xué)報,2012,52(7):910-915.

[9]周瑞平,陳云宗,唐代云,等. 偏高溫大曲中一株嗜熱細菌的分離與鑒定[J]. 釀酒科技,2010(1):36-38.

[10]王勇,羅惠波,劉燕梅,等. 濃香型大曲中多株芽孢桿菌的分離及鑒定[J]. 四川理工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2015,28(2):5-8.

[11]連賓,任鐵. 茅臺酒曲嗜熱細菌的研究[J]. 貴州科學(xué),1993(1):75-81.

[12]余婷婷,賴世強,曹文濤,等. 高溫大曲中產(chǎn)醬香耐高溫細菌的篩選及鑒定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(11):109-112.

[13]葛媛媛,姚粟,劉洋,等. 芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱細菌群落研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(11):16-19.

[14]左勇,江鵬,葉碧霞,等. 一株產(chǎn)藍色素菌株的篩選及初步鑒定[J]. 食品工業(yè)科技,2016(3):166-169.

[15]張榮. 產(chǎn)醬香功能細菌的篩選及其特征風(fēng)味化合物的研究[D]. 無錫:江南大學(xué),2009.

[16]祝云飛,黃治國,鄧杰,等. 濃香型大曲中一株酵母菌的分離鑒定及其揮發(fā)性產(chǎn)物分析[J]. 四川理工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2016(1):7-11.

[17]張榮. 地衣芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)地衣素及風(fēng)味活性物質(zhì)對白酒品質(zhì)的影響[D]. 無錫:江南大學(xué),2014.

[18]廖妍儼,黃家?guī)X. 淺談白酒中吡嗪類化合物的檢測應(yīng)用[J]. 中國化工貿(mào)易,2015,7(27):193.

Separation and identification of thermoduric bacteria strains in medium/high temperature Daqu and the analysis of the flavor metabolites

ZHOU Ping1,LUO Hui-bo1,2,*,HUANG Dan1,DENG Bo3,4,WANG Qing5, HUANG Zhi-guo1,2,WEI Chun-hui1,2,DENG Jie1,2

(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science & Engineering,Zigong 643000,China; 2.Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China; 3.Luzhou Laojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;

Objective:With the medium/high temperature Daqu bacteria through cultivation as examples,separation of thermoduric bacteria and the analysis of the flavor metabolites. Method:Isolated via enrichment culture and dilution coating,the morphological observation and 16S rDNA sequence analysis,growth characteristics analysis,the solid and liquid fermentation products were analyzed through headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry technology. Result:The thermoduric bacteria strain NR2 was isolated and it wasBacilluslicheniformis,the bacteria culture began to enter the logarithmic phase from the 4 h of cultivation and reached the stable phase after 24 h of cultivation,the liquid state fermentation flavor substances,such as 2,3-diacetyl,3-hydroxy-2-butanone and 2,3-butanediol,with 3-hydroxy-2-butanone being the main metabolites. In addition,there were more species of solid state fermentation metabolites that liquid ones. The contents of pyrazine compounds,such as 2,3,5-methyl pyrazine and 2,3,5,6-tetramethyl pyrazine increased.Conclusion:The formation of liquor and highly-flavored liquor flavor substances was closely related to the metabolic characteristics of the thermoduric bacteria.

Daqu;thermoduric bacteria;separation;identification;metabolites;Bacilluslicheniformis

2016-06-15

周平(1993-),男,碩士研究生,研究方向:釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用,E-mail:zhouping19930408@163.com。

*通訊作者:羅惠波(1969-),男,教授,研究方向:釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用,E-mail:sgxlhb@suse.edu.cn。

國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心項目(2015K-245);重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(cstc2015shmszx80025)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000