朱明明,樊明濤,何鴻舉,*,馬漢軍

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成非香氣物質(zhì)的條件及優(yōu)化

朱明明1,樊明濤2,何鴻舉1,*,馬漢軍1

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100)

利用高效液相色譜研究類胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成的非香氣物質(zhì)隨酶解時(shí)間、pH、溫度的變化規(guī)律,結(jié)果表明非香氣物質(zhì)生成量會(huì)隨著酶解時(shí)間的增加、pH的降低和溫度的升高出現(xiàn)先增加后減少的趨勢。另外發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素在不同反應(yīng)pH下可生成不同的裂解產(chǎn)物。利用二次多項(xiàng)式逐步回歸得到酶解的最佳工藝條件,β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、角黃質(zhì)和蝦青素的酶解條件分別為pH4.5、溫度30 ℃、時(shí)間15 min,pH4.5、溫度30 ℃、時(shí)間13 min,pH4.5、溫度33 ℃、時(shí)間45 min,pH4.0、溫度30 ℃、時(shí)間41 min,pH4.5、溫度50 ℃、時(shí)間7 min。按上述條件進(jìn)行酶解反應(yīng),得到產(chǎn)物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。該方法有效提高了非香氣物質(zhì)的生成量,并節(jié)約了時(shí)間。

β-胡蘿卜素,β-阿樸-8′-胡蘿卜醛,葉黃素類,類胡蘿卜素裂解酶,酶解因素,二次多項(xiàng)式逐步回歸

類胡蘿卜素是一類由植物和某些光合微生物產(chǎn)生的親脂性異戊二烯類色素,廣泛存在于自然界中[1],已鑒定出的種類超過700種,典型代表有C30類:β-阿樸-8′-胡蘿卜醛;C40類可分為胡蘿卜素類和含氧類胡蘿卜素類,其中β-胡蘿卜素和番茄紅素是前者的典型代表,而后者典型代表為葉黃素類[2-3]。

阿樸類胡蘿卜素(apocarotenoids)是一類由類胡蘿卜素氧化裂解派生的萜類化合物[4]。類胡蘿卜素由于分子氧的作用,可在雙鍵位置斷裂形成醛或者酮從而生成多種多樣的阿樸類物質(zhì)[5]。阿樸類胡蘿卜素在自然界中廣泛存在,且具有非常重要的生物學(xué)功能。類胡蘿卜素的化學(xué)鍵斷裂位置決定了阿樸類胡蘿卜素的作用。第一類重要的阿樸類物質(zhì)是C20化合物如視黃醛及其衍生物,其為脊椎動(dòng)物視覺周期中視網(wǎng)膜紫質(zhì)的發(fā)色團(tuán),起到至關(guān)重要的作用[6-7];第二類阿樸類胡蘿卜素可作為化學(xué)引誘物、排斥物、生長促進(jìn)劑和抑制劑等[8-9],如脫落酸,可引發(fā)芽休眠、促進(jìn)葉子脫落和抑制細(xì)胞生長,在植物耐旱性和糖感知上也起著重要的作用[10];第三類物質(zhì)是香氣化合物,如β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛、香葉醛、α-大馬酮及β-大馬酮等[11],由于其較低的香氣閾值,可有效改善食品的風(fēng)味[12]。另外,β-紫羅蘭酮作為C13類異戊二烯而言還具有一定的生物活性,可抑制癌細(xì)胞增殖、調(diào)控乳腺癌細(xì)胞、抗致畸毒性及降血脂等[13-15]。

本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)巴氏葡萄球菌TS-82可高效降解類胡蘿卜素[16-18],經(jīng)分離純化得到相應(yīng)的類胡蘿卜素裂解酶[19],并對其基本酶學(xué)特性進(jìn)行了研究[20-21]。為進(jìn)一步了解該類胡蘿卜素裂解酶的催化作用機(jī)理,測定產(chǎn)生的香氣物質(zhì)和非香氣物質(zhì),推斷該酶的作用位點(diǎn),需對降解中間產(chǎn)物進(jìn)行研究。由于由液相檢測得到的中間產(chǎn)物主要為非香氣物質(zhì),且中間產(chǎn)物極其不穩(wěn)定,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長、pH的降低以及溫度的升高而降解[20],所以本實(shí)驗(yàn)參照朱明明等酶解蝦青素的方法[20],以β-阿樸-8′-類胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)為底物,研究生成非香氣產(chǎn)物的條件,并與蝦青素酶解條件進(jìn)行對比,得到該酶作用于不同底物的條件、產(chǎn)物,并利用二次多項(xiàng)式逐步回歸[22-23]確定非香氣產(chǎn)物最大生成量的反應(yīng)條件,以期進(jìn)行LC-MS分析,為研究該酶催化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株TS-82;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛(98%)、β-胡蘿卜素(98%)、玉米黃質(zhì)(95%)、角黃質(zhì)(95%)、蝦青素(95%) Sigma-Aldrich;甲醇(HPLC級) 美國Tedia;甲基叔丁基醚 中國Aladdin;色譜級水 娃哈哈;正己烷和丙酮 隴南化學(xué)試劑公司;其他分析級試劑 天津科密歐。

CoolSafe冷凍干燥機(jī) Labogene(丹麥)儀器公司;高效液相色譜儀LC-20A 島津(日本)公司;真空離心濃縮儀 Scanlaf(美國)公司;高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;cp2245型分析天平 Sartorius(德國)公司;KQ-2500E型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)有限公司;HH恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制 由于類胡蘿卜素對光和熱均特別敏感,所有儲(chǔ)備液需現(xiàn)配現(xiàn)用。底物儲(chǔ)備液參照蝦青素儲(chǔ)備液的配制方法[20],分別取一定量的類胡蘿卜素底物和1 g Tween-80溶于20 mL的二氯甲烷溶液中,避光條件下,在通風(fēng)櫥中不斷振蕩直至有機(jī)試劑揮發(fā)完全,加入適量的無菌蒸餾水混勻,得到清澈的濃度為160 μmol/L的儲(chǔ)備液,置于4 ℃,待用。

1.2.2 酶催化類胡蘿卜素底物裂解的影響因素 在所有的體外實(shí)驗(yàn)中,分別取450 μL的類胡蘿卜素標(biāo)品儲(chǔ)備液(160 μmol/L),添加4 μg酶粉,用pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液(20 mmol/L)定容至2 mL。雖然所得純酶的最適反應(yīng)pH為3.0[16],但由于在低pH條件下,一方面酶解反應(yīng)加速,另一方面中間產(chǎn)物在低pH下極其不穩(wěn)定,兩方面促使其更易轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物,所以在研究中間產(chǎn)物過程中選擇反應(yīng)pH5.0。

1.2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對非香氣物質(zhì)生成量的影響 分別配制β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)、蝦青素的上述反應(yīng)體系,在30 ℃條件下分別反應(yīng)15、30、45和60 min。雖然該類胡蘿卜素裂解酶的最適反應(yīng)溫度是50～60 ℃[16],但在此溫度下,酶解反應(yīng)快,中間產(chǎn)物很快轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物,難以檢測到非香氣產(chǎn)物,所以選擇反應(yīng)溫度為30 ℃進(jìn)行。以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標(biāo)品儲(chǔ)備液的pH5.0的溶液為對照,在相同條件下處理。在到達(dá)預(yù)訂反應(yīng)時(shí)間后采用朱明明[20]的方法終止反應(yīng)并按照色譜條件測定實(shí)驗(yàn)和對照組中非香氣物質(zhì)峰面積的變化,從而得到產(chǎn)物生成量的變化,用峰面積代表生成量,其中若產(chǎn)物為兩種的,用兩種產(chǎn)物的峰面積總和代表兩產(chǎn)物的總生成量。

1.2.2.2 反應(yīng)pH對非香氣物質(zhì)生成量的影響 將上述反應(yīng)體系稍加修改,采用不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)的醋酸-醋酸鈉緩沖液(20 mmol/L)定容至2 mL。根據(jù)酶解時(shí)間對產(chǎn)物生成量的影響,在30 ℃條件下將各底物的酶解時(shí)間控制在其產(chǎn)物生成量最大的時(shí)間范圍,以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標(biāo)品儲(chǔ)備液的各相應(yīng)pH的溶液為對照,在相同條件下處理。采用上述方法測定產(chǎn)物生成量的變化。

1.2.2.3 反應(yīng)溫度對非香氣物質(zhì)生成量的影響 設(shè)定pH為5.0,根據(jù)不同底物的產(chǎn)物生成量最大時(shí)的酶解時(shí)間不同,將反應(yīng)體系在30、40、50、60、70 ℃條件下分別酶解不同的時(shí)間,以不加酶粉、只加類胡蘿卜素標(biāo)品儲(chǔ)備液的pH5.0的溶液為對照,在相同條件下處理。采用上述方法測定產(chǎn)物生成量的變化。

實(shí)驗(yàn)中定義得到的非香氣物質(zhì)的最大峰面積為100%,其余條件下的生成量轉(zhuǎn)換為相對生成量。以上所有反應(yīng)均重復(fù)三次,取平均值。

1.2.3 酶解的正交實(shí)驗(yàn)及二次多項(xiàng)式逐步回歸分析 優(yōu)化中間產(chǎn)物生成量的三個(gè)變量分別為X1(pH)、X2(溫度T)、X3(時(shí)間t),預(yù)測的非香氣物質(zhì)生成量值為Y1(β-胡蘿卜素非香氣物質(zhì)的相對生成量)、Y2(玉米黃質(zhì)兩個(gè)非香氣物質(zhì)的總相對生成量)、Y3(β-阿樸-8′-胡蘿卜醛非香氣物質(zhì)的相對生成量)、Y4(角黃質(zhì)兩個(gè)非香氣物質(zhì)的總相對生成量)、Y5(蝦青素兩個(gè)非香氣物質(zhì)的總相對生成量)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平根據(jù)之前的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果而定,設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),通過考察非香氣產(chǎn)物的生成量優(yōu)化酶解條件。以蝦青素底物的正交實(shí)驗(yàn)為代表,其因素水平具體見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

圖1 類胡蘿卜素裂解酶催化β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素酶解反應(yīng)的液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of β-carotene,β-apo-8′-carotenal,zeaxanthin,canthaxanthin,astaxanthin cleavage reaction cleaved by carotenoid cleavage enzyme 注:a、c、e、g、j-β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素未加酶的液相色譜圖和照片(對照);b、d、f、h、k-β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素加酶反應(yīng)的液相色譜圖和照片(pH5.0、30 ℃、30 min)。色譜峰:β-胡蘿卜素,保留時(shí)間33.787 min;中間產(chǎn)物β1,保留時(shí)間30.837 min。β-阿樸-8′-胡蘿卜醛,保留時(shí)間21.653 min;中間產(chǎn)物a1,保留時(shí)間17.920 min。玉米黃質(zhì),保留時(shí)間23.361 min;中間產(chǎn)物z1,保留時(shí)間24.670 min;中間產(chǎn)物z2,保留時(shí)間25.473 min。角黃質(zhì),保留時(shí)間24.704 min;中間產(chǎn)物c1,保留時(shí)間25.330 min;中間產(chǎn)物c2,保留時(shí)間25.619 min。蝦青素,保留時(shí)間19.982 min;中間產(chǎn)物x1,保留時(shí)間20.619 min;中間產(chǎn)物x2,保留時(shí)間21.915 min。

利用二次多項(xiàng)式逐步回歸確定方程,采用通徑系數(shù)分析反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH及其相互作用對非香氣產(chǎn)物生成量的影響。優(yōu)化過程中定義反應(yīng)時(shí)間30 min、pH5.0、溫度30 ℃條件下生成的非香氣物質(zhì)的峰面積為100%,其他條件下的生成量轉(zhuǎn)化為相對生成量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用DPS軟件(Version Rel.6.55,1997)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素裂解酶純酶的制備

參照樊明濤等[19]的方法制備純酶粉,4 ℃保存待用。

2.2 非香氣物質(zhì)生成的條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示巴氏葡萄球菌TS-82類胡蘿卜素裂解酶具有催化降解五種類胡蘿卜素底物(β-胡蘿卜素、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素)的能力(圖1),表明其可催化多種類胡蘿卜素。由酶解反應(yīng)和空白對照可看出,在pH5.0、溫度30 ℃條件下反應(yīng)30 min后,底物峰面積明顯降低,表明該類胡蘿卜素裂解酶活性很好,能夠快速催化底物降解;在底物降解的同時(shí)轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物,其中β-阿樸-8′-胡蘿卜醛和β-胡蘿卜素分別生成一種產(chǎn)物,即a1和β1,而葉黃素類則均生成兩種中間產(chǎn)物,分別為z1和z2、c1和c2、x1和x2。

2.2.1 反應(yīng)時(shí)間對非香氣物質(zhì)生成量的影響 由于非香氣物質(zhì)(中間產(chǎn)物)不穩(wěn)定,易轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物,探究酶解過程中反應(yīng)時(shí)間的變化有助于檢測到非香氣物質(zhì)的最大生成量,其結(jié)果如圖2所示。由圖中可看出反應(yīng)時(shí)間對所有非香氣產(chǎn)物的生成量都有著顯著影響(p<0.05)。在酶解反應(yīng)初期,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,產(chǎn)物生成量逐步增加,這是因?yàn)榈孜锏拿附夥磻?yīng)生成中間產(chǎn)物;而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長時(shí),產(chǎn)物的生成量開始下降,這可能是因?yàn)橹虚g產(chǎn)物隨著時(shí)間的延長而發(fā)生降解轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物所致。在pH5.0和30 ℃條件下,β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產(chǎn)物a1最大生成量的酶解時(shí)間為60 min,隨著反應(yīng)的繼續(xù)延長,其生成量減少(圖中未顯示);得到β-胡蘿卜素的非香氣產(chǎn)物β1和角黃質(zhì)的兩個(gè)非香氣產(chǎn)物c1和c2總相對含量最高值的酶解時(shí)間是30 min;而對于玉米黃質(zhì)和蝦青素底物而言,反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí)非香氣物質(zhì)生成量最高(p<0.05)。這些結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了該酶優(yōu)先催化玉米黃質(zhì)裂解,而最后催化β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的結(jié)論[20]。同時(shí)在玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素酶解反應(yīng)過程中,反應(yīng)初期產(chǎn)物z2、c2和x2的生成量明顯高于z1、c1和x1的生成量,而后隨著時(shí)間的延長,產(chǎn)物z2、c2和x2的生成量減少,z1、c1和x1的生成量增加,前者量低于后者量。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對五種類胡蘿卜素底物轉(zhuǎn)化為非香氣物質(zhì)的相對生成量的影響Fig.2 Effects of reaction time on the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產(chǎn)物不同時(shí)間下差異顯著(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)中定義得到的非香氣產(chǎn)物的最大峰面積為100%,其余的條件下的生成量轉(zhuǎn)換為相對生成量。圖4、7同。

由于葉黃質(zhì)類底物的酶解過程相似,因此在文中僅以玉米黃質(zhì)為例列出產(chǎn)物變化圖,其產(chǎn)物隨時(shí)間變化如圖3所示,可看出反應(yīng)7 min時(shí)產(chǎn)物z2峰面積高于z1峰面積,所以z2生成量高于z1生成量;而15 min時(shí)兩者生成量相當(dāng),反應(yīng)達(dá)到30 min時(shí)可明顯觀察到產(chǎn)物z2含量低于z1含量。隨著反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長,兩個(gè)產(chǎn)物生成量均降低,可能是因?yàn)閮晌镔|(zhì)都出現(xiàn)降解造成的,該現(xiàn)象表明在玉米黃質(zhì)酶解反應(yīng)中,類胡蘿卜素裂解酶可能先催化底物轉(zhuǎn)化為z2,然后又轉(zhuǎn)化生成z1。在角黃質(zhì)和蝦青素中也出現(xiàn)類似結(jié)果,表明其裂解路徑可能與玉米黃質(zhì)相似。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對玉米黃質(zhì)酶解的影響Fig.3 Effects of reaction time on the zeaxanthin degradation注:色譜峰:z代表玉米黃質(zhì),保留時(shí)間23.361 min;中間產(chǎn)物z1,保留時(shí)間24.670 min;中間產(chǎn)物z2,保留時(shí)間25.473 min。

相較于報(bào)道的其他植物源和微生物源的此類酶[24-26],該類胡蘿卜素裂解酶可在短時(shí)間內(nèi)迅速催化底物裂解,表明該酶作用于各底物的催化效率明顯高于之前報(bào)道的酶類。

2.2.2 反應(yīng)pH對非香氣物質(zhì)生成量的影響 類胡蘿卜素裂解中間產(chǎn)物在強(qiáng)酸環(huán)境下極其不穩(wěn)定,易降解。如圖4所示,反應(yīng)pH的變化對非香氣產(chǎn)物的生成量有顯著影響(p<0.05)。在pH4.0時(shí),非香氣產(chǎn)物a1生成量、β1生成量、z1和z2總相對生成量、x1和x2總相對生成量顯著下降(p<0.05)。在30 ℃和各pH條件下根據(jù)底物不同,選擇各自中間產(chǎn)物最大生成量的酶解時(shí)間進(jìn)行反應(yīng),其生成量變化見圖3,可知β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產(chǎn)物a1生成量,玉米黃質(zhì)z1和z2總生成量,蝦青素x1和x2總生成量達(dá)到最大化值時(shí)的pH為5.0;β-胡蘿卜素的非香氣產(chǎn)物β1生成量最高時(shí)的反應(yīng)pH為5.0;角黃質(zhì)的兩個(gè)產(chǎn)物c1和c2總生成量達(dá)到最高值時(shí)的反應(yīng)pH為4.0(p<0.05)。當(dāng)pH低于4.0時(shí),非香氣產(chǎn)物迅速降解,可能是由于pH對中間產(chǎn)物影響較大,其在酸性條件下不穩(wěn)定,發(fā)生降解所致。在低pH條件下,一方面酶活性變高,另一方面中間產(chǎn)物在酸性條件下易降解,而在相同的反應(yīng)時(shí)間下,中間產(chǎn)物已降解,兩方面導(dǎo)致生成量減少,轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物,因此并不是酶作用最適pH就是中間產(chǎn)物生成量最大的條件,故從得到非香氣物質(zhì)最大生成量的角度考慮,選擇酶解底物β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、蝦青素的pH條件為5.0;酶解角黃質(zhì)的pH條件為4.0。雖然β-胡蘿卜素在反應(yīng)pH為4.5和5.0時(shí)酶解生成的非香氣產(chǎn)物β1的含量無顯著性差異,但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)在pH低于5.0時(shí),β-胡蘿卜素除了生成非香氣物質(zhì)β1,在其保留時(shí)間之前又生成一種新的非香氣產(chǎn)物β2,這是在其他底物中未發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象,也是其他報(bào)道中未提到的。如圖5所示,所以在進(jìn)行非香氣物質(zhì)純化時(shí),選擇β-胡蘿卜素酶解pH條件為4.5,分別收集產(chǎn)物β1和β2,以期進(jìn)行LC-MS鑒定,確定非香氣產(chǎn)物。

圖4 反應(yīng)pH對五種類胡蘿卜素底物轉(zhuǎn)化為非香氣物質(zhì)的相對生成量的影響Fig.4 Effects of pH valueson the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產(chǎn)物不同pH下差異顯著(p<0.05)。

圖5 不同pH對β-胡蘿卜素酶解反應(yīng)的影響Fig.5 Effects of different pH valueson the β-carotene degradation注:a-pH5.0條件下β-胡蘿卜素加酶反應(yīng)的液相色譜圖(40 ℃、30 min);b-pH4.5條件下β-胡蘿卜素加酶反應(yīng)的液相色譜圖(40 ℃、30 min)。色譜峰:β-胡蘿卜素保留時(shí)間33.787 min;中間產(chǎn)物β1,保留時(shí)間30.837 min;中間產(chǎn)物β2,保留時(shí)間28.667 min。

在玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素酶解反應(yīng)過程中,隨著pH的降低,類胡蘿卜素裂解酶的活性增加,酶解反應(yīng)加快,酶解反應(yīng)產(chǎn)物z2、c2和x2的生成量先增加后減少,z1、c1和x1的生成量增加。以玉米黃質(zhì)為例,其產(chǎn)物隨著pH變化如圖6,可看出在pH由6.0到5.0時(shí)z2和z1含量逐步升高,這是由于在6.0時(shí)酶活特別低而隨著pH降低酶活升高,但隨著pH繼續(xù)降低,酶活性顯著增加,z2生成量卻出現(xiàn)下降,而z1生成量始終升高,原因可能是該酶先催化玉米黃質(zhì)生成z2,而z2在酸性條件下,又轉(zhuǎn)化為z1。角黃質(zhì)和蝦青素也出現(xiàn)類似狀況。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長也出現(xiàn)該現(xiàn)象,進(jìn)一步說明其催化底物先生成z2、c2和x2,而后又轉(zhuǎn)化為z1、c1和x1的結(jié)果。

圖6 反應(yīng)pH對玉米黃質(zhì)酶解的影響Fig.6 Effects of pH value on the zeaxanthin degradation注:色譜峰:z代表玉米黃質(zhì),保留時(shí)間23.361 min;中間產(chǎn)物z1,保留時(shí)間24.670 min;中間產(chǎn)物z2,保留時(shí)間25.473 min。

圖7 反應(yīng)溫度對五種類胡蘿卜素底物轉(zhuǎn)化為非香氣物質(zhì)的相對生成量的影響Fig.7 Effects of temperature on the relative amounts of non-volatile compounds converted from five carotenoids注:不同小寫字母代表相同香氣產(chǎn)物不同溫度下差異顯著(p<0.05)。

2.2.3 反應(yīng)溫度對非香氣物質(zhì)產(chǎn)量的影響 由于類胡蘿卜素裂解中間產(chǎn)物在高溫環(huán)境下極其不穩(wěn)定,易降解,如圖7所示,反應(yīng)溫度的變化對非香氣產(chǎn)物的相對生成量有顯著影響(p<0.05)。當(dāng)反應(yīng)溫度在50 ℃及以上時(shí),所有產(chǎn)物的相對生成量都顯著下降(p<0.05)。在pH5.0條件下反應(yīng),β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產(chǎn)物a1的生成量,玉米黃質(zhì)產(chǎn)物z1和z2總生成量,β-胡蘿卜素的產(chǎn)物β1生成量達(dá)到最大時(shí)的反應(yīng)溫度是40 ℃;蝦青素產(chǎn)物x1和x2總生成量和角黃質(zhì)產(chǎn)物c1和c2總生成量最高時(shí)的反應(yīng)溫度是30 ℃(p<0.05)。當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí),非香氣物質(zhì)迅速降解,原因可能是反應(yīng)溫度對中間產(chǎn)物影響較大,其在溫度較高的條件下不穩(wěn)定,發(fā)生降解所致;當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí),由于酶的活性受到抑制,導(dǎo)致底物轉(zhuǎn)化效率低,使非香氣物質(zhì)生成量較低。因此并不是酶最適作用溫度就是非香氣物質(zhì)生成量最大的條件,故從得到非香氣物質(zhì)最大生成量的角度考慮,選擇酶解底物β-阿樸-8′-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素的反應(yīng)溫度是40 ℃;酶解蝦青素和角黃質(zhì)的反應(yīng)溫度是30 ℃。

表2 蝦青素酶解的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

注:Y51、Y52和Y53代表三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的蝦青素非香氣產(chǎn)物的相對生成量。2.3 二次多項(xiàng)式逐步回歸分析

2.3.1 建立回歸方程 通過單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度對中間產(chǎn)物生成量的影響后,選用正交實(shí)驗(yàn)探討這3個(gè)因素對中間產(chǎn)物生成量的影響,以蝦青素底物的正交實(shí)驗(yàn)為代表,結(jié)果見表2。

對所有底物的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析,由DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)擬合得出剔除不顯著項(xiàng)的回歸方程:

Y1=1262.83-73.12X3-45.30X12-0.14X22-0.16X32+13.88X1X3+0.37X2X3(Eq.1)

Y2=2827.40-130.03X2-121.12X12-0.26X22-0.16X32+29.34X1X2+0.14X2X3

(Eq.2)

Y3=1460.43-43.96X3-76.72X12-0.15X22-0.10X32+2.28X1X2+11.15X1X3

(Eq.3)

Y4=-349.60+37.84X3+22.56X12+0.09X22-0.19X32-2.00X1X2-5.52X1X3

(Eq.4)

(Eq.5)

同時(shí)得到二次多項(xiàng)式逐步回歸方程的相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo):按照上述方程(Eq.1)～(Eq.5)的順序,相關(guān)系數(shù)r分別為0.9943、0.9981、0.9940、0.9996和0.9977,F值分別為288.4028、888.7373、274.1786、4243.9423和490.5013,p均為0.0001,調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)ra分別為0.9925、0.9976、0.9922、0.9995和0.996 7,剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=2.4732、1.2983、1.3332、0.9554、3.4261,Durbin-Waston統(tǒng)計(jì)量d=2.18032406、1.50983326、2.39660911、1.43751667、1.94520693。由上述回歸方程統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)可知,回歸方程(Eq.1)～(Eq.5)都能夠正確反應(yīng)各因素與非香氣物質(zhì)生成量之間的關(guān)系,可靠性較高,同時(shí)因?yàn)閞>ra,Y回歸效果顯著。

2.3.2 非香氣物質(zhì)生成量與考察因素及其交互作用之間的相關(guān)關(guān)系 類胡蘿卜素底物酶解生成的非香氣物質(zhì)相對生成量與考察因素及其交互作用的相關(guān)關(guān)系如表3所示。從各方程的回歸系數(shù)來看,反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度與產(chǎn)物生成量的相關(guān)性與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由表中數(shù)據(jù)可知,反應(yīng)pH和反應(yīng)時(shí)間的交互作用對β-胡蘿卜素的非香氣產(chǎn)物β1的生成量、β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的非香氣產(chǎn)物a1的生成量、角黃質(zhì)的兩個(gè)非香氣物質(zhì)c1和c2的總生成量、蝦青素的非香氣物質(zhì)x1和x2的總生成量都有顯著性影響(p<0.001),均呈正相關(guān)關(guān)系,表明pH越高,酶活性越低,隨著時(shí)間的延長,底物緩慢降解,產(chǎn)物含量逐步增高;反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的交互作用與β-胡蘿卜素的非香氣產(chǎn)物β1的生成量和玉米黃質(zhì)產(chǎn)物z1、z2的總生成量呈正相關(guān)關(guān)系,而與蝦青素酶解產(chǎn)物的總生成量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明時(shí)間越長,溫度越高,酶活越高,中間產(chǎn)物降解越嚴(yán)重,含量越低;反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度的交互作用可顯著影響玉米黃質(zhì)產(chǎn)物z1、z2的總生成量、角黃質(zhì)產(chǎn)物c1、c2的總生成量、蝦青素酶解產(chǎn)物x1和x2的總成生量(p<0.001),但相關(guān)性各不相同,分析其原因可能是pH升高會(huì)降低酶活,而溫度升高又會(huì)促進(jìn)酶活,但中間產(chǎn)物在高溫下又不穩(wěn)定。

表3 非香氣物質(zhì)的相對生成量與考察因素及其交互作用的相關(guān)關(guān)系

注:***p<0.001。

表4 優(yōu)化條件下各因素與非香氣產(chǎn)物生成量的直接通徑系數(shù)

注:利用F檢驗(yàn)計(jì)算顯著性;**差異極顯著(p<0.01)。在得到的回歸方程的條件下,各個(gè)因素與非香氣物質(zhì)生成量的直接通徑系數(shù)見表4。各因素對非香氣產(chǎn)物β1生成量的相對重要性根據(jù)直接通徑系數(shù)的絕對值由大到小依次排序是X3、X1X3、X2X3、X12、X32、X22,即反應(yīng)時(shí)間對其產(chǎn)量影響最大,其次是反應(yīng)pH和反應(yīng)時(shí)間的交互作用,而反應(yīng)溫度的二次項(xiàng)影響最小,因此在優(yōu)化β-胡蘿卜素非香氣產(chǎn)物生成量的過程中需要注意反應(yīng)時(shí)間和pH的選擇;各因素對玉米黃質(zhì)產(chǎn)物z1和z2生成量的重要性從大到小依次是X1X2、X2、X12、X22、X32、X2X3,即反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度的交互作用影響最大,而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的交互作用影響最小,因此在優(yōu)化玉米黃質(zhì)非香氣產(chǎn)物生成量的過程中要慎重選擇反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度;考察因素對非香氣物質(zhì)a1生成量的影響從大到小依次是X1X3、X3、X12、X32、X22、X1X2,即反應(yīng)pH和反應(yīng)時(shí)間的交互對其生成量影響最大,而反應(yīng)pH和反應(yīng)溫度的交互影響最小,因此在優(yōu)化β-阿樸-8′-胡蘿卜醛產(chǎn)物生成量的過程中首要平衡反應(yīng)pH和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系;對產(chǎn)物c1和c2總生成量有影響的因素從大到小依次排列為X3、X1X3、X32、X12、X1X2、X22,即反應(yīng)時(shí)間的影響最大,其次是pH和時(shí)間的交互作用,而溫度的二次項(xiàng)影響最小,因此在優(yōu)化角黃質(zhì)非香氣物質(zhì)生成量時(shí)也要時(shí)刻注意反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH的選擇;各因素對蝦青素產(chǎn)物x1和x2總生成量的影響從大到小排列為X1X3、X22、X32、X1、X2、X3、X2X3、X12,即pH和時(shí)間的交互作用對其生成量有較大影響,而反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的交互作用有較小影響,pH的二次項(xiàng)影響最小,故在優(yōu)化蝦青素非香氣物質(zhì)生成量時(shí)要平衡反應(yīng)時(shí)間和pH的選擇。綜上在優(yōu)化各非香氣產(chǎn)物生成量的過程中要注意平衡反應(yīng)pH、溫度和時(shí)間的關(guān)系,以便得到最大生成量。

2.3.3 優(yōu)化條件的驗(yàn)證 由回歸方程(Eq.1)得到非香氣產(chǎn)物β1生成量達(dá)到最高指標(biāo)時(shí),各個(gè)因素組合為Y1=182.6984;X1=4.5;X2=30;X3=15,即反應(yīng)pH為4.5、反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min,在此條件下,產(chǎn)物β1的生成量可達(dá)到定義條件下的1.82倍;同樣地,由回歸方程(Eq.2)～(Eq.5)得到,玉米黃質(zhì)的酶解條件為反應(yīng)pH4.5、反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間13 min,在此條件下,產(chǎn)物z1和z2總生成量為定義條件下的2.02倍;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的酶解條件為反應(yīng)pH4.5、反應(yīng)溫度33 ℃、反應(yīng)時(shí)間45 min,此條件下非香氣物質(zhì)a1的生成量為定義條件下的1.57倍;角黃質(zhì)的酶解條件為pH4.0、反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間41 min,此時(shí)產(chǎn)物c1和c2的生成量為定義條件下的1.83倍,蝦青素的酶解條件是反應(yīng)pH4.5、反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間7 min,由此得到非香氣物質(zhì)x1和x2的生成量可達(dá)到定義條件下的1.95倍。

為檢驗(yàn)預(yù)測結(jié)果是否可靠,采用優(yōu)化后的酶解反應(yīng)條件進(jìn)行各底物的酶解反應(yīng),重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)得到非香氣物質(zhì)相對生成量。產(chǎn)物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2相對產(chǎn)量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍,接近最優(yōu)預(yù)測值,明顯高于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明此優(yōu)化結(jié)果可靠,對實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)具有一定的價(jià)值。

3 結(jié)論

通過研究酶解時(shí)間、pH和溫度對非香氣物質(zhì)生成的影響,得到不同底物生成非香氣物質(zhì)的變化規(guī)律,在酶解反應(yīng)初始隨著酶解時(shí)間的增加、pH的降低和溫度的升高,非香氣物質(zhì)生成量增加直到達(dá)到最大值,而隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)延長、pH的繼續(xù)降低和溫度的繼續(xù)升高,非香氣物質(zhì)生成量迅速降低。另外研究發(fā)現(xiàn),β-胡蘿卜素在不同反應(yīng)pH下生成不同的裂解產(chǎn)物。

選擇反應(yīng)時(shí)間、pH和溫度為考察因素利用二次多項(xiàng)式逐步回歸優(yōu)化酶解產(chǎn)物的生成量,得到其酶解的最佳工藝條件分別為:β-胡蘿卜素的酶解條件為反應(yīng)pH為4.5、反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min;玉米黃質(zhì)的酶解條件為pH4.5、溫度30 ℃、時(shí)間13 min;β-阿樸-8′-胡蘿卜醛的酶解條件為pH4.5、溫度33 ℃、時(shí)間45 min;角黃質(zhì)的酶解條件為4.0、溫度30 ℃、時(shí)間41 min;蝦青素的酶解條件為pH4.5、溫度50 ℃、時(shí)間7 min。按上述條件進(jìn)行酶解反應(yīng),得到產(chǎn)物β1、z1和z2、a1、c1和c2、x1和x2的生成量分別為定義條件下的1.74、1.80、1.39、1.66和1.75倍。該方法有效提高了非香氣物質(zhì)的生成量,并節(jié)約了時(shí)間,為產(chǎn)物的鑒定奠定基礎(chǔ)。

[1]Polyakov NE,Kispert LD. Water soluble biocompatible vesicles based on polysaccharides and oligosaccharides inclusion complexes for carotenoid delivery[J]. Carbohydrate Polymers,2015,128:207-219.

[2]劉曉瑞. 一株鞘氨醇桿菌合成類胡蘿卜素的分子機(jī)制和代謝雜環(huán)的氧化壓力研究[D]. 上海:上海交通大學(xué),2013:10-15.

[3]Britton G. Structure and properties of carotenoids in relation to function[J]. Faseb Journal,1995,9(15):1551-1558.

[4]Eklund AM,Forsblom I,Berg JE,et al. Tobacco chemistry. 83. Four new cyclized cambranoids from Tobacco[J]. Acta Chemica Scandinavica,1998,52(10):1254-1262.

[5]Vogel JT,Tan BC,McCarty DR,et al. The carotenoid cleavage dioxygenase 1 enzyme has broad substrate specificity,cleaving multiple carotenoids at two different bond positions[J]. Journal of Biological Chemistry,2008,283(17):11364-11373.

[6]Grote M,O’Malley MA. Enlightening the life sciences:the history of halobacterial and microbial rhodopsin research[J]. Fems Microbiology Reviews,2011,35(6):1082-1099.

[7]Spudich JL,Yang CS,Jung KH,et al. Retinylidene proteins:structures and functions from archaea to humans[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology,2000,16(1):365-392.

[8]Li CN,Srivastava MK,Nong Q,et al. Molecular cloning and characterization of SoNCED,a novel gene encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase from sugarcane(Saccharum officinarum L.)[J]. Genes & Genomics,2013,35(1):101-109.

[9]Bouvier F,Suire C,Mutterer J,et al. Oxidative tailoring of carotenoids:a prospect towards novel functions in plants[J].

Trends in Plant Science,2005,10(4):187-194.

[10]Schwartz SH,Qin XQ,Zeevaart JAD. Elucidation of the indirect pathway of abscisic acid biosynthesis by mutants,genes,and enzymes[J]. Plant Physiology,2003,131(4):1591-1601.

[11]Sun Z,Hans J,Walter MH,et al. Cloning and characterisation of a maize carotenoid cleavage dioxygenase(ZmCCD1)and its involvement in the biosynthesis of apocarotenoids with various roles in mutualistic and parasitic interactions[J]. Planta,2008,228(5):789-801.

[12]王樹林. 沙棘酒香味前體物β-胡蘿卜素降解產(chǎn)香規(guī)律及機(jī)理研究[D]. 楊陵:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011:16-31.

[13]Gurak PD,Mercadante AZ,González-Miret ML,et al. Changes in antioxidant capacity and colour associated with the formation ofβ-carotene epoxides and oxidative cleavage derivatives[J]. Food Chemistry,2014,147c:160-169.

[14]Liu JR,Dong HW,Sun XR,et al. Effects of beta-ionone on mammary carcinogenesis and antioxidant status in rats treated with DMBA[J]. Nutrition and Cancer,2010,62(1):58-65.

[15]孫向榮,劉家仁,陳炳卿.β-紫羅蘭酮的生物活性研究進(jìn)展[J]. 毒理學(xué)雜志,2008,22(6):477-480.

[16]Zhu MM,Wang SL,Fan MT. Isolation and identification of a novelβ-carotene degrading microorganism from sea buckthorn juice[J]. Food Biotechnology,2016,30(1):1-17.

[17]王樹林,朱明明,李婧. 影響β-胡蘿卜素降解菌酶活性因素的研究[J]. 食品科學(xué),2013,34(13):157-161.

[18]麻俊俠,樊明濤,王樹林,等.β-胡蘿卜素降解葡萄球菌化學(xué)合成培養(yǎng)基營養(yǎng)素的研究[J]. 食品科學(xué),2013,34(5):137-141.

[19]樊明濤,朱明明,王樹林. 一種β-胡蘿卜素降解酶的純化方法:中國,CN103555684A[P]. 2014-02-05.

[20]朱明明,賀靜,樊明濤,等. 細(xì)菌類胡蘿卜素裂解酶酶解蝦青素工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2015,36(8):1-5.

[21]朱明明,王樹林,賀靜,等. 巴氏葡萄球菌類胡蘿卜素降解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2016,16(2):18-24.

[22]關(guān)海寧. 二次逐步回歸優(yōu)化超聲酶法提取大豆多糖工藝[J]. 中國釀造,2012,31(5):53-55.

[23]陳林,楊蕾,王藝璇,等. 二次多項(xiàng)式逐步回歸在狹葉仙鶴蘚生長研究中的應(yīng)用[J]. 昆明學(xué)院學(xué)報(bào),2012,(3):37-40.

[24]Harrison PJ,Bugg TDH. Enzymology of the carotenoid cleavage dioxygenases:Reaction mechanisms,inhibition and biochemical roles[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,2014,544(4):105-111.DOI:10.1016/j.abb.2013.10.005.

[25]Hoffmann J,Bóna-Lovász J,Beuttler H,et al.Invivoandinvitrostudies on the carotenoid cleavage oxygenases from Sphingopyxis alaskensis RB2256 and Plesiocystis pacifica SIR-1 revealed their substrate specificities and non-retinal-forming cleavage activities[J]. Febs Journal,2012,279(20):3911-24.

[26]Ilg A,Beyer P,Al-Babili S. Characterization of the rice carotenoid cleavage dioxygenase1 reveals a novel route for geranial biosynthesis[J]. Febs Journal,2009,276(3):736-747.

Conditions and optimization for the degradation of different substrates by a carotenoid cleavage enzyme

ZHU Ming-ming1,FAN Ming-tao2,HE Hong-ju1,*,MA Han-jun1

(1.School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

The variation of the non-volatile compounds generated from the degradation of different substrates by carotenoid cleavage enzyme was investigated using HPLC method,with the changing of enzymolysis time,pH value and temperature. The results showed that the production of non-volatile compounds had a trend of increased at the beginning and then decreased,with the increasing of enzymolysis time and temperature and decreasing of pH. In addition,it was found that theβ-carotene was degraded into different products at different pH values. By using quadratic polynomial stepwise regression analysis,the optimum reaction conditions for cleaving different substrates by purified enzyme were obtained and summarize as follows:pH4.5,15 min at 30 ℃ forβ-carotene,pH4.5,13 min at 30 ℃ for zeaxanthin,pH4.5,45 min at 33 ℃ forβ-apo-8′-carotenal,pH4.0,41 min at 30 ℃ for canthaxanthin,pH4.5,7 min at 50 ℃ for astaxanthin,respectively. Under these conditions,the total yields of non-volatile products were 1.74,1.80,1.39,1.66 and 1.75-fold higher than the defined yields,respectively. In conclusion,this method could be used to enhance the yields of non-volatile products effectively and was also time-saving.

β-carotene;β-apo-8′-carotenal;xanthophylls;carotenoid cleavage enzyme;hydrolysis factors;quadratic polynomial stepwise regression analysis

2016-06-28

朱明明(1989-)，女，博士，講師，研究方向：食品分析及食品生物技術(shù)，E-mail:happyzhumingming@126.com。

*通訊作者:何鴻舉(1983-)，男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量分析與快速檢測，E-mail:hongju_he007@126.com。

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(17A550001)；河南科技學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2015015)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171728)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(13IRTSTHN006)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000