孫麗平,李 笑,蘇雪嬌

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

中華牛肝菌多糖的性質及抗氧化活性

孫麗平,李 笑,蘇雪嬌

(昆明理工大學云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)

中華牛肝菌經(jīng)熱水抽提、乙醇分級沉淀制備多糖(BSP80),測定BSP80的平均分子量大小、單糖組成及其抗氧化活性。結果顯示,BSP80的主要平均分子量為53.73 ku,并含有少量4 ku的組分;BSP80主要含有半乳糖、葡萄糖和甘露糖,并含有一定量的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,阿拉伯糖未檢出。BSP80具有較好的還原能力和清除羥自由基能力,其中清除羥自由基的IC50為398.21 μg/mL。此外,BSP80能夠顯著降低H2O2誘導的HepG2細胞內ROS含量,同時提升細胞內SOD酶活性,且呈一定劑量關系。

中華牛肝菌,多糖,單糖組成,抗氧化活性,活性氧

牛肝菌是一類重要的野生食用菌資源,具有很高的營養(yǎng)和藥用價值,因肉質肥厚,極似牛肝而得名,為“四大菌王”之一[1]。真菌多糖是一種具有多種生理功能和開發(fā)價值的活性多糖,對人體具有顯著的保健功效[2]。目前,針對于牛肝菌多糖的研究主要有美味牛肝菌、小美牛肝菌和銅色牛肝菌等。中華牛肝菌隸屬于牛肝菌屬,子實體中等大,菌蓋為半球形或扁平狀,夏秋季生于林中地上,主要分布于云南、四川等地。為了充分利用中華牛肝菌資源,對其子實體中的多糖進行研究是非常必要的。本文對中華牛肝菌中的多糖進行提取,乙醇沉淀分離,測定多糖的單糖組成和分子量大小,并進一步對制備的多糖抗氧化能力進行評價,以期為該資源的綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華牛肝菌 云南省普洱市墨江縣野生菌市場;單糖標品 美國Sigma試劑公司;葡聚糖系列色譜純標品(T500、T100、T50、T20、T5) 上海源葉生物科技有限公司;胎牛血清(FBS) 美國ScienCell公司;超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;活性氧檢測試劑盒 碧云天生物研究所。

Agilent1206高效液相色譜儀 美國Agilent公司;TU1901型雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;AC2-6S1 Alrstream I級A2型生物安全柜 新加坡ESCO公司;SpectraMax M5型多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的制備 取中華牛肝菌,凍干,磨碎,參考文獻方法[3]并修改進行多糖的提取。按1∶10的比例加入體積分數(shù)為80%的乙醇超聲處理30 min(300 W,兩次),5000 r/min離心15 min,棄上清液,取沉淀,采用熱水浸提法提取多糖。按料水比1∶50的比例加入蒸餾水,置于恒溫水浴鍋中,80 ℃熱水提取2 h,5000 r/min離心10 min,沉淀再提取0.5 h。將兩次提取液的上清合并,真空減壓濃縮。在多糖提取液中加入無水乙醇,使得體系中最終乙醇濃度為60%,4 ℃靜置一夜,5000 r/min離心20 min,收集上清液加無水乙醇至濃度為80%,4 ℃靜置一夜,5000 r/min離心20 min,沉淀組分采用Sevage法除蛋白4次,采用大孔樹脂AB-8除色素,制備的多糖樣品記為BSP80。

1.2.2 多糖的理化分析

1.2.2.1 多糖含量的測定 多糖含量采用硫酸苯酚法進行測定[4]。

1.2.2.2 多糖分子量測定 Agilent1206高效液相色譜儀,色譜柱TSKgel G3000PWXL(7.8 mm×300 mm),柱溫為35 ℃,流動相為超純水,流速為0.6 mL/min,示差折光檢測器。分別取葡聚糖標準品用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的溶液,過0.45 μm濾膜,進樣量為20 μL,時間為45 min[5]。將BSP80用蒸餾水配制成濃度為3.0 mg/mL的溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,在相同條件下進行高效液相色譜分析,記錄樣品的保留時間tR值。以葡聚糖品分子量的對數(shù)lg Mw為縱坐標,保留時間tR為橫坐標,繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線和樣品在色譜圖上的保留時間,計算多糖樣品的相對分子量。

1.2.2.3 單糖組成 取適量單糖標品和多糖樣品于水解管中,加入2 mol/L 三氟乙酸2 mL,置于110 ℃水解4 h。冷卻至室溫后,調節(jié)水解液pH至中性,并定容至25 mL。5000 r/min離心10 min,吸取上清液1 mL,依次加入1.0 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液,0.3 mol/L NaOH 1 mL,混勻后70 ℃水浴衍生30 min,衍生結束后室溫冷卻10 min,加1 mL 0.3 mol/L HCl中和,加入3 mL三氯甲烷萃取三次至上清液無色,除去多余的PMP。取上層水相過0.45 μm膜,采用Agilent1206高效液相色譜儀,ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱;流動相A:15%乙腈+85%的KH2PO4-NaOH緩沖液(pH6.9);流動相B:40%乙腈+60%的KH2PO4-NaOH緩沖液(pH6.9);洗脫梯度:0～25 min為0～25%流動相B。柱溫為25 ℃,檢測波長為250 nm,流速為1.0 mL/min。通過各單糖標準品的保留時間可以對樣品單糖進行定性,峰面積對樣品進行定量[6]。

1.2.3 抗氧化活性

1.2.3.1 還原能力 取不同濃度(50、100、150、200 μg/mL)多糖樣品1 mL于5 mL離心管,加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和1 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混勻,50 ℃水浴20 min,加入1 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻,取 1 mL 混合溶液于 5 mL離心管,加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,迅速混勻,測定700 nm的吸光值,吸光值表示樣品的還原能力[7],以BHT和VC為陽性對照。

1.2.3.2 羥自由基清除能力 取不同濃度(200、400、600、1000 μg/mL)多糖樣品1.0 mL,依次加入8.0 mmol/L濃度的FeSO4溶液0.3 mL,20 mmol/L的H2O2溶液0.25 mL以及3.0 mmol/L的水楊酸溶液1.0 mL,混勻后37 ℃水浴30 min,取出后流水冷卻,加入超純水0.45 mL,使反應體系最終體積為3.0 mL,5000 r/min離心15 min,取上清液,測定510 nm吸光值[8],空白調零為蒸餾水+FeSO4+H2O2,以VC為陽性對照。

羥自由基清除率(%)=[(A對照-(A樣品-A樣品對照)/A對照]×100

式中:A對照為蒸餾水+FeSO4+H2O2+水楊酸;A樣品為樣品+FeSO4+H2O2+水楊酸;A樣品對照為樣品+FeSO4+H2O2+水。

1.2.4 細胞活性實驗

1.2.4.1 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的HepG2細胞,調整細胞密度為1×104個/mL,接種于96孔板中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁之后,棄去培養(yǎng)基,分別加入不同濃度(25、50、100、200 μg/mL)的BSP80,各組濃度設置6個復孔,同時設置空白對照組(不含樣品),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸出含樣品的培養(yǎng)基,加入含MTT的不完全培養(yǎng)基150 μL(MTT用不完全培養(yǎng)基稀釋至濃度為0.5 mg/mL),培養(yǎng)4 h。除去培養(yǎng)基后加入DMSO 150 μL置于回旋振蕩器中震蕩10 min,充分溶解后,利用酶標儀于570 nm波長下測定吸光值[9],細胞存活率按照下式計算:

細胞存活率(%)=樣品組OD值/空白組OD值×100

1.2.4.2 細胞內ROS水平檢測 對數(shù)生長期的HepG2細胞,調整細胞密度為5×104個/mL,接種于6孔板中,每孔2 mL,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁之后;棄掉培養(yǎng)基,更換新的培養(yǎng)基,設置空白對照組(只含完全培養(yǎng)基)、陽性對照組(5 μg/mL VC)、陰性對照組(0.9 mmol/L H2O2)、BSP80低濃度組(50 μg/mL),中濃度組(100 μg/mL)和高濃度組(200 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄掉培養(yǎng)基,空白對照組加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基,其余各組均加入2 mL 0.9 mmol/L的H2O2溶液,H2O2處理6 h后,采用活性氧檢測試劑盒,通過流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。

ROS相對水平(%)=As/Ao×100

式中:Ao為空白對照組ROS水平,As為其余各組ROS水平。

1.2.4.3 細胞內SOD活力測定 細胞培養(yǎng)方法同1.2.4.2。使用超聲波細胞粉碎儀破碎細胞后按照SOD試劑盒說明測定SOD酶活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析,差異顯著性水平為p<0.05。每個實驗至少重復三次,結果以均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 多糖的理化分析

以標準葡聚糖分子量的對數(shù)lg Mw為縱坐標,保留時間tR為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:lg Mw=-1.1761t+16.16(R2=0.9620)。結合標準曲線回歸方程計算,BSP80主要平均分子量分別為53.73 ku,并含有少量平均分子量為4 ku的組分。單糖組成顯示BSP80富含半乳糖、葡萄糖和甘露糖,其中半乳糖和葡萄糖分別占總糖的23.69%和20.78%。BSP80還含有半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,分別占總糖含量的3.00%和0.65%,沒有檢測到阿拉伯糖,檢測的八種單糖占總糖比例的75.86%。

表1 BSP80單糖組成及多糖含量的比例

注:nd,表示未檢出。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 還原能力 還原能力主要研究被測物質提供氫原子或電子的能力,是體現(xiàn)物質抗氧化能力的一種方法[10]。對不同質量濃度的BSP80進行還原能力測定,以BHT和VC作為對照,結果見圖1。牛肝菌多糖具有一定的還原能力,還原能力隨質量濃度的增加而升高。BSP80的還原能力與BHT相當,但較 VC的低,表明中華牛肝菌多糖具有較好的還原能力。

圖1 不同質量濃度BSP80的還原能力Fig.1 The reducing power of BSP80

2.2.2 羥自由基清除率 研究認為羥基自由基是氧化性最強的自由基,幾乎可以和所有細胞發(fā)生相關反應,對機體危害極大[11]。圖2表明BSP80和VC的清除羥自由基能力,不同質量濃度的BSP80對羥基自由基均具有一定的抑制能力,多糖對羥基自由基的抑制能力隨著質量濃度的增加而增強。同等質量濃度下BSP80的抑制能力低于VC,BSP80和VC對羥基自由基的半數(shù)抑制質量濃度(IC50)分別為398.21和101. 12 μg/mL。結果表明,中華牛肝菌多糖具有明顯的抑制羥基自由基的能力。

圖2 不同質量濃度BSP80的羥基自由基清除能力Fig.2 Scavenging activity of OH· of BSP80

2.3 細胞內活性

2.3.1 細胞存活率 不同濃度BSP80對HepG2細胞存活率的影響見圖3,當濃度為25 μg/mL時,BSP80能夠輕微的促進細胞增殖。當濃度為50、100和200 μg/mL時,細胞存活率沒有顯著的下降(p>0.05)。結果表明,BSP80在低于200 μg/mL時,對細胞無毒副作用。

圖3 不同濃度BSP80的細胞存活率,Fig.3 Effects of BSP80 on cell viability of HepG2 cells注:不同字母代表數(shù)據(jù)有顯著性差異(p<0.05);圖4、圖5同。

2.3.2 細胞內ROS的影響 BSP80對H2O2誘導的HepG2細胞內ROS的影響見圖4。將空白組細胞內的ROS相對水平定為100%,當加入H2O2誘導后,與空白對照組相比,細胞內ROS的相對水平上升到126.81%(p<0.05),說明H2O2對細胞產(chǎn)生了損傷。BSP80能夠抑制細胞內ROS的生成,且隨著濃度的上升,ROS水平逐漸降低。當BSP80濃度為200 μg/mL時,與 5 μg/mL的VC抑制能力相當。結果說明,BSP80能夠清除H2O2誘導HepG2細胞內ROS,進一步保護受損的HepG2細胞。

圖4 BSP80對H2O2誘導的HepG2細胞內ROS的影響Fig.4 Effects of BSP80 on ROS in HepG2 cells

2.3.3 BSP80對SOD酶活的影響 H2O2能夠使細胞內ROS急劇的增加,但是過多的ROS能夠被許多有抗氧化活性的酶,如SOD、GSH-Px和過氧化氫酶等除去[12]。有研究報道,SOD可以降低氧化應激引起的細胞損傷[13]。從圖5可以看出,H2O2能夠顯著的降低SOD活力(p<0.05),BSP80能夠保護細胞內SOD酶的活性,且隨著濃度增加而增加,呈一定劑量關系。BSP80濃度為50μg/mL時與濃度為5μg/mL的VC效果相當。結果表明,BSP80能夠提升細胞的SOD酶活性,具有良好的預防氧化應激損傷能力。Zhuang等研究表明,當歸多糖能有效增加經(jīng)H2O2處理后軟骨細胞的SOD活力并成劑量關系[14],與本實驗的結果相似。

圖5 BSP80對H2O2誘導的HepG2細胞內SOD酶活的影響Fig.5 Effects of BSP80 on SOD in HepG2 cells

3 結論

通過對中華牛肝菌進行熱水抽提和乙醇沉淀,制備多糖組分BSP80。BSP80的主要平均分子量為53.73 ku,并含有少量平均分子量為4 ku的組分,BSP80主要含有半乳糖、葡萄糖和甘露糖。BSP80具有較好的還原能力和清除羥自由基能力,同時,能夠顯著降低H2O2誘導的HepG2細胞內ROS含量,同時提升細胞內SOD酶活性。本文的研究結果為中華牛肝菌的活性多糖制備和高值化利用提供數(shù)據(jù)支持。

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Preparation and antioxidant activities of the polysaccharides fromBoletussnicus

SUN Li-ping,LI Xiao,SU Xue-jiao

(Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

The polysaccharose(BSP80)was prepared from the fruiting bodies ofBoletussnicuswith boiling water and purified by ethanol precipitation. The molecular weight,monosaccharide composition and antioxidant activity of BSP80 was measured. The results showed that the main average molecular weight of BSP80 was about 53. 73 ku with a small part of 4 ku components. BSP80 was rich in galactose,glucose and mannose. The galacturonic acid and glucuronic acid were detected and the arabinose was undetected. BSP80 had showed high reducing power and hydroxyl radical scavenging activity,and the IC50value of hydroxyl radical scavenging was 398.21 μg/mL. Furthermore,BSP80 decreased the ROS generation of HepG2 cell induced by H2O2with promoting intracellular enzymatic activity of SOD,significantly. The activities were related to the concentration of BSP80.

Boletussnicus;polysaccharides;monosaccharide compositions;antioxidant activity;ROS

2016-06-15

孫麗平(1981-),女,博士,教授,研究方向:食品質量與安全控制,E-mail:kmlpsun@163.com。

國家自然科學基金資助項目(31301456)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000