李 萍,米生權(quán),趙 卓

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191)

塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用研究

李 萍,米生權(quán),趙 卓*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院,北京 100191)

為了探討塑化劑鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用,將L2期秀麗隱桿線蟲暴露于不同濃度DBP(32.5、131、522 mg/L)48 h后,檢測秀麗隱桿線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著DBP濃度升高,線蟲體內(nèi)MDA含量升高。與對照組相比,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)T-SOD和CAT酶活力、GSH含量均極顯著降低(p<0.01)。結(jié)論:DBP對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生氧化損傷作用。

秀麗隱桿線蟲,鄰苯二甲酸二丁酯,氧化損傷

鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)是一種重要的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)(PAEs),由于性能優(yōu)良,工藝成熟,價(jià)格低廉[1],是工業(yè)上常用的增塑劑和軟化劑,多用于輪胎、橡膠、粘合劑和電線外皮等工業(yè)生產(chǎn)[2],還用于人工瓣膜的潤滑劑和皮膚軟化劑等醫(yī)療領(lǐng)域。由于PAEs與高分子聚合物之間不以共價(jià)鍵形式結(jié)合,而僅僅以氫鍵或范德華力結(jié)合,彼此仍保持獨(dú)立的化學(xué)結(jié)構(gòu)[3],隨著使用和時(shí)間的推移,DBP不斷從塑料材料中逸出,污染空氣、土壤、水源乃至食品,對人類健康造成潛在影響[4]。

DBP的主要毒性是生殖發(fā)育毒性,DBP染毒大鼠出現(xiàn)睪丸萎縮和附睪發(fā)育不全等雄性生殖系統(tǒng)損害;仔鼠體重增長變緩和睪丸損害等[5]。神經(jīng)毒性方面,PAEs使雄性大鼠神經(jīng)細(xì)胞核深染固縮,染色質(zhì)凝結(jié)成團(tuán),胞漿泡沫樣改變而呈現(xiàn)出一系列神經(jīng)反射異?，F(xiàn)象。同時(shí)DBP經(jīng)口對嚙齒類動(dòng)物有肝腎毒性作用,主要是通過對其體內(nèi)的過氧化脂質(zhì)以及抗氧化酶活力的影響來實(shí)現(xiàn)[6]。Tseng等研究發(fā)現(xiàn),DBP誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲行為缺陷,包括身體彎曲,翻轉(zhuǎn)頻率及趨溫性改變等[7]。目前有關(guān)DBP對哺乳動(dòng)物、浮游生物、節(jié)肢動(dòng)物和魚類毒性作用的研究均有報(bào)道,但多集中在生殖毒性、胚胎毒性和發(fā)育毒性,本實(shí)驗(yàn)主要研究DBP對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,簡稱C.elegans)是多細(xì)胞無脊椎生物,具有結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清晰、進(jìn)化高度保守、飼養(yǎng)方便、身體透明、生命周期短、基因可操縱性強(qiáng)等特點(diǎn),是一種理想的毒理研究模式生物,已發(fā)展為應(yīng)用行為學(xué)指標(biāo)研究化學(xué)物神經(jīng)毒性和生殖毒性的成熟模型[8-9]。由于增塑劑鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)對秀麗隱桿線蟲毒性效應(yīng)的研究極少,本實(shí)驗(yàn)選擇秀麗隱桿線蟲為動(dòng)物模型,研究不同濃度DBP對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力(SOD)等抗氧化酶和抗氧化劑的影響,從而探討DBP對秀麗隱桿線蟲的氧化損傷作用,為DBP在功能食品中的應(yīng)用提供毒理學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌OP50與N2野生型C.elegans中國科學(xué)院生物物理研究所惠贈(zèng);鄰苯二甲酸二丁酯(DBP 純度:98.0%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(DMSO 純度:99.0%) 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;SOD試劑盒(測總)、(CAT)可見光試劑盒、(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒 南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司等。

XDS-1B型倒置顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司;MJ-250F-II型霉菌生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;5804R型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;UV-2000型紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品板制備 無菌條件下,分別吸取0.3125、1.25和5 mL的鄰苯二甲酸二丁酯于對應(yīng)離心管中,依次加入DMSO使溶液終體積為10 mL,再依次從中取出0.2 mL樣品溶液于200 mL滅菌融化的NGM培養(yǎng)基中,配制成DBP 濃度為32.5、131、522 mg/L的樣品培養(yǎng)基(DMSO≤0.1%)。再取0.2 mL DMSO于200 mL滅菌融化的NGM培養(yǎng)基中,配制成0.1%DMSO對照組培養(yǎng)基。每個(gè)濃度組200 mL NGM培養(yǎng)基平均倒12個(gè)平板,其中每6個(gè)平板合并為1個(gè)平行,即分為2組平行。

在NGM培養(yǎng)基中涂布100μL OP50菌液,于20恒溫培養(yǎng)48 h,待大腸桿菌長出薄薄一層后備用。

1.2.2 線蟲轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 將同步化后L2期蟲子切塊,分別接種到制備好的含樣品和DMSO的培養(yǎng)皿上,每個(gè)平板培養(yǎng)線蟲150～200條左右,20恒溫培養(yǎng)48 h[10]。

1.2.3 抗氧化酶、抗氧化劑和MDA指標(biāo)的檢測 取研磨管4支,標(biāo)記為DMSO對照組、32.5、131、522 mg/L DBP濃度組,轉(zhuǎn)移各樣本組線蟲至相應(yīng)研磨管中,加入PBS使各研磨管中液體總體積為0.5 mL,加入研磨珠適量,組織研磨儀設(shè)置為1500 r/min,60 s運(yùn)行時(shí)間,10 s間歇時(shí)間,進(jìn)行3次研磨循環(huán),最后在倒置顯微鏡下取20 μL蟲液觀察線蟲是否研磨充分(研磨管和研磨珠提前在冰上預(yù)冷)。若線蟲研磨充分,離心線蟲研磨液,取上清,按照SOD試劑盒(測總)、(CAT)可見光試劑盒、(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)測試盒說明書進(jìn)行測定,并且測定各樣本組蛋白濃度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù),以ANOVA分析方法比較不同組間T-SOD和CAT酶活力、GSH和MDA含量,用OriginPro 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DBP處理對秀麗隱桿線蟲T-SOD活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體重要的抗氧化酶,負(fù)責(zé)清除機(jī)體超氧陰離子自由基,起到抗氧化保護(hù)作用。如圖1所示,與對照組相比,131 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力提高(p<0.05),而522 mg/L DBP處理組T-SOD酶活力極顯著降低(p<0.01)。該結(jié)果表明,低濃度131 mg/L DBP激活了線蟲體內(nèi)T-SOD酶活力,而高濃度522 mg/L DBP顯著降低T-SOD酶活力,可能原因?yàn)榈蜐舛?31 mg/L DBP脅迫激活機(jī)體免疫機(jī)能,高濃度522 mg/L DBP脅迫產(chǎn)生的氧化壓力超出了機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力,使抗氧化酶活性降低,對機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷。

圖1 不同濃度DBP對線蟲體內(nèi)總超氧化物歧化酶活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of DBP on the activities of superoxide dismutase in C.elegans注:與DMSO對照組相比,* p<0.05,** p<0.01;圖2～圖4同。

2.2 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)CAT活力的影響

過氧化氫酶(CAT)是機(jī)體重要的抗氧化酶,機(jī)體細(xì)胞呼吸過程中部分氧會(huì)被還原為H2O2,H202易被細(xì)胞內(nèi)還原劑還原為強(qiáng)氧化劑·OH自由基,過氧化氫酶能消除由機(jī)體代謝產(chǎn)生的H202,阻斷·OH的累積,防止機(jī)體氧化損傷。如圖2所示,與DMSO處理組相比,32.5 mg/L和131 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)CAT酶活力均極顯著升高(p<0.01),而522 mg/L DBP處理組CAT酶活力極顯著降低(p<0.01)。該結(jié)果表明,低濃度DBP顯著激活了線蟲體內(nèi)CAT酶活力,而高濃度DBP顯著降低CAT酶活力。

圖2 不同濃度DBP對線蟲體內(nèi)過氧化氫酶活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DBP on the activities of catalase in C.elegans

圖3 不同濃度DBP對線蟲體內(nèi)谷胱甘肽含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of DBP on the contents of glutathione in C.elegans

2.3 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH含量的影響

還原型谷胱甘肽(GSH)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,與自由基、重金屬等結(jié)合,具有清除自由基、抗氧化、抗衰老等生理功能。如圖3顯示,與對照組相比,32.5 mg/L與131 mg/L DBP處理組GSH含量沒有變化(p>0.05)。522 mg/L DBP處理組GSH含量極顯著降低(p<0.01)。

2.4 DBP處理對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物,常用于評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和氧化受損傷程度,MDA的含量越大則說明機(jī)體氧化損傷越嚴(yán)重。如圖4所示,與對照組相比,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)MDA含量極顯著升高(p<0.01)。且隨著DBP濃度逐漸增大,MDA含量逐漸升高。以上結(jié)果表明,DBP造成線蟲細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。

圖4 不同濃度DBP對線蟲體內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of DBP on the contents of MDA in C.elegans

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所測T-SOD和CAT為酶抗氧化系統(tǒng),GSH為非酶抗氧化系統(tǒng)。當(dāng)機(jī)體存在氧化應(yīng)激壓力時(shí),抗氧化防御系統(tǒng)清除機(jī)體產(chǎn)生的活性氧,共同作用保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷;但當(dāng)抗氧化防御系統(tǒng)不能有效清除機(jī)體內(nèi)過量的自由基時(shí),則導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷,使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),產(chǎn)生大量的MDA[11]。

研究證實(shí),DBP在生物體內(nèi)代謝過程中可誘發(fā)活性氧自由基的大量產(chǎn)生,從而對生物體產(chǎn)生氧化損傷[12]。SOD和CAT是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,SOD將氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2,CAT進(jìn)一步分解H2O2為H2O。防止機(jī)體氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)研究表明,低濃度DBP(131 mg/L)激活T-SOD酶活力,低濃度DBP(32.5 mg/L和131 mg/L)激活CAT酶活力,高濃度DBP(522 mg/L)顯著降低T-SOD和CAT酶活力。低濃度DBP對T-SOD和CAT酶活力影響不同,這可能與兩種酶的受影響模式不同有關(guān),SOD歧化超氧陰離子產(chǎn)生的H202不完全由CAT還原,且細(xì)胞色素P450氧化酶激活也可產(chǎn)生H202。王艷[13]研究了幾種鄰苯二甲酸酯對蚯蚓的分子毒性機(jī)理,結(jié)果表明DBP單一污染對蚯蚓體內(nèi)CAT酶活性的影響為低濃度激活,隨著DBP濃度的增加,CAT活性逐漸降低。蔡立哲等[14]研究PAHs對菲律賓蛤仔抗氧化酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),PAHs對SOD和CAT活性的影響均表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制。Pan等[15]實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),低濃度PAHs脅迫下櫛孔扇貝血淋巴SOD活性持續(xù)上升,高濃度脅迫下SOD活性表現(xiàn)為先升后降。其可能原因?yàn)榈蜐舛菵BP脅迫激活機(jī)體免疫機(jī)能,高濃度DBP脅迫產(chǎn)生的氧化壓力超出了機(jī)體自我調(diào)節(jié)能力,使抗氧化酶活性降低,對機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷。

GSH是機(jī)體重要的抗氧化劑,本實(shí)驗(yàn)研究表明,522 mg/L DBP處理組秀麗隱桿線蟲體內(nèi)GSH含量顯著降低。秦文娟[16]研究鄰苯二甲酸二丁酯對雄性小鼠生殖毒性及氧化損傷作用發(fā)現(xiàn),DBP能使肝臟和睪丸組織受到損傷,引起GSH含量降低,誘導(dǎo)肝臟組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用,產(chǎn)生MDA。

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和氧化受損傷程度的重要指標(biāo)[17]。本實(shí)驗(yàn)研究表明,隨著DBP濃度逐漸增大,無論秀麗隱桿線蟲體內(nèi)SOD和CAT活性被激活還是被抑制,MDA含量逐漸升高,DBP暴露處理可誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞脂質(zhì)過氧化。蔡鳳云[18]等研究鄰苯二甲酸二丁酯對體外大鼠肝臟細(xì)胞的氧化損傷作用,結(jié)果表明隨著DBP染毒濃度的升高,大鼠肝臟細(xì)胞的MDA含量逐漸上升。

綜上所述,DBP具有造成生物體氧化損傷的作用,DBP做為塑料工業(yè)的主要增塑劑和軟化劑,是一種已被確定的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,食品中含有DBP將對食用者造成嚴(yán)重氧化應(yīng)激負(fù)荷,從而引發(fā)多種神經(jīng)疾病,如記憶功能下降[19],神經(jīng)反射降低[20]等,尤其對兒童健康危害更加嚴(yán)重,使幼兒智力下降,發(fā)育畸形[21]等,因此食品中DBP的危害及安全標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該給予足夠重視,本實(shí)驗(yàn)以抗氧化酶(SOD和CAT)、抗氧化物質(zhì)(GSH)及氧化產(chǎn)物(MDA)等指標(biāo)研究DBP的氧化損傷作用,為DBP在功能食品中的應(yīng)用提供毒理學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)。

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2

Study on the oxidative damage effects of dibutyl phthalate inCaenorhabditiselegans

LI Ping,MI Sheng-quan,ZHAO Zhuo*

(College of Applied Arts And Science of Beijing Union University,Beijing 100191,China)

The aim of this article was to investigate the oxidative damage effect of dibutyl phthalate(DBP)inC.elegans.C.elegansin L2period were expoused to the different concentrations of DBP(32.5,131 and 522 mg/L)for 48 h. Then the activities of T-SOD,CAT and the contents of GSH,MDA inC.eleganswere measured. Results:With increasing DBP concentration,the contents of MDA increased. Compared with the control group,the activities of T-SOD and CAT and the contents of GSH were significantly decreased in 522 mg/L DBP treatment group(p<0.01). These results suggested that DBP could induce the oxidative damage inC.elegans.

Caenorhabditiselegans;dibutyl phthalate;oxidative damage

2016-07-20

李萍(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向:營養(yǎng)與慢性病，E-mail:1114176776@qq.com。

*通訊作者:趙卓(1963-), 男，博士，教授, 研究方向: 營養(yǎng)與慢性病, E-mail:zhaozhuo@buu.edu.cn。

北京市教委研究項(xiàng)目資助(SQKM201311417014)；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教計(jì)劃資助項(xiàng)目(PHR201107150)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000