張 忠,李科瑋,畢 陽,王 毅,任亞琳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

15種青藏高原植物提取物對幾種常見微生物的抑制作用研究

張 忠,李科瑋,畢 陽*,王 毅,任亞琳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

為研究青藏高原植物提取物對幾種常見微生物的抑制效果,本文采用瓊脂孔擴散法和96孔培養(yǎng)板對倍稀釋法研究了15種高原植物提取物對4種真菌和4種細(xì)菌的體外抑菌率和最低抑菌濃度。結(jié)果顯示:各種植物提取物具有不同的抑菌譜和最小抑制濃度,其中黃腺香青、刺柏、塞北紫芹、龍膽花、苔草的提取物至少對4種供試菌有抑制作用;苔草的三種提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與熒光假單孢菌的最低抑菌濃度為0.05 g/mL;大部分提取物對細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于對真菌的抑制效果。結(jié)果表明生長于青藏高原獨特生態(tài)條件下的許多植物,其代謝物在體外具有較強的抑菌活性和較廣的抑菌譜。

青藏高原植物,瓊脂孔擴散法,最小抑制濃度,食源性致病菌

化學(xué)合成殺菌劑的使用是目前用于防止疾病傳播,食品防腐和果蔬采后病害控制的首要措施[1]。病原菌對現(xiàn)有殺菌劑的抗性,環(huán)境污染以及因消費不安全食品而造成的健康問題和消費者對食品品質(zhì)安全性要求的日益提高,使人們開始尋找現(xiàn)有控制措施的互補或替代措施[2-8]。天然抗菌物質(zhì)既能延長食品的可利用時間,同時又能避免因腐敗微生物的酶系或代謝所產(chǎn)生的營養(yǎng)健康與品質(zhì)安全等方面產(chǎn)生的問題[9]。許多具有抗菌活性的植物提取物如植物精油和多酚類引起了相關(guān)研究學(xué)者的興趣[10-12]。在尋找新的天然活性物質(zhì)時,一些獨特生態(tài)體系的植物被關(guān)注[13];已有研究從一些欠探索的生態(tài)體系中發(fā)掘出有價值的活性物質(zhì),生長于獨特生態(tài)環(huán)境中的生物資源將成為研究和尋找天然活性物質(zhì)的熱點[14-17]。本研究用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5種溶劑逐級分別提取15種高原植物中的抑菌物質(zhì),并測定各種提取物對4種果蔬采后致病真菌與4種常見食源性致病菌的體外抑制效果,以為天然植物源抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試植物 15種供試植物(表1)均采自青海省化隆縣,由本校林學(xué)院植物分類學(xué)孫學(xué)剛教授鑒定后陰干、粉碎后用PE袋(17 cm×12 cm)包裝4 ℃保存,供試植物的選擇基于兩點:生長在較高的海拔區(qū)域,在當(dāng)?shù)孛耖g有抑菌消炎的用途;供試金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),大腸桿菌(Escherichiacoli),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),熒光假單孢菌(Pseudomonasfluorescence),擴展青霉(Penicilliumexpansum)由廣東微生物研究所購得并在本院采后生物學(xué)實驗室保藏?；ジ窠绘滄呔?Alternariaalternate),半裸鐮刀菌(Fusariumsemitectum),粉紅單端孢菌(Trichotheciumroseum) 由本院采后生物學(xué)實驗室從發(fā)病果實分離保藏;所用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二甲亞砜(DMSO) 均為上?；瘜W(xué)試劑有限公司所產(chǎn),分析純級。

索氏抽提儀 臨沂正衡化玻儀器有限公司;96孔培養(yǎng)板 美國BD公司;PYX-DHS 600-BS-11型恒溫培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

表1 供試高原植物及分類信息

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取液制備 采用吳文君[18]索氏抽提連續(xù)法進行活性成分提取,各供試植物樣稱取50 g粉末,用濾紙包好裝入索氏抽提儀依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇進行連續(xù)提取,提取液分別標(biāo)記為PE、CE、EE、AE和ME,各提取液過濾,并在35～45 ℃溫度范圍內(nèi)減壓濃縮至50 mL,制備成1 g/mL的原液,放置4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 菌懸浮液制備 真菌懸浮液制備參照Bi的方法[19],取25 ℃下培養(yǎng)10 d的帶菌馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平皿一個,加入含0.05% Tween 20的無菌水約10 mL,用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子,然后轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中,在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15 s,再用雙層紗布過濾,濾液用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子懸浮液的濃度后,最后稀釋至106CFU/mL。細(xì)菌菌懸液的制備采用平板菌落計數(shù)法[20],將供試細(xì)菌用接種環(huán)接入到50 mL無菌水中,充分振蕩30 min后二倍稀釋菌懸液,吸取標(biāo)記10-4、10-5、10-6菌懸液各200 μL,對號放入無菌平皿中并用涂布器來回涂勻后轉(zhuǎn)入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,選擇最合適平皿計數(shù),并根據(jù)公式(1)計算出每毫升菌懸液中菌落的形成單位。

每毫升中菌落形成單位(CFU/mL)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

式(1)

1.2.3 瓊脂孔擴散法抑菌活性測定 參照Cakir的方法[21]并修改。將高壓滅菌的瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,霉菌用PDA培養(yǎng)基)趁液態(tài)倒入干燥滅菌的直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi),厚度約為2 mm,待培養(yǎng)基冷凝后,加入0.1 mL菌懸液并加入少量DMSO,均勻涂布平板,然后用無菌金屬打孔器(d=6 mm)打成深2 mm的小孔1個,用無菌牙簽除去孔內(nèi)瓊脂,并用移液槍吸取一滴瓊脂溶液封底。分別吸取不同的溶劑提取物0.2 mL加入孔內(nèi),并用各自的提取溶劑作空白對照。以上操作均在無菌條件下進行。然后將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h,霉菌置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96 h)。后用十字交叉法測量抑菌圈直徑,以平均值代表菌落的大小,根據(jù)公式2計算抑菌率。

抑菌率(%)=(處理抑菌圈直徑-CK直徑)/處理抑菌圈直徑×100

式(2)

1.2.4 最低抑菌濃度測定(MIC) 采用Eloff法[22]并略做修改,采用5%(v/v)DMSO對各提取原液進行系列二倍稀釋,96孔培養(yǎng)板紫外照射10 min后每孔加入100 μL查氏培養(yǎng)基(真菌)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌),再加入100 μL的系列稀釋液和20 μL的菌懸液,各濃度設(shè)3個平行,最后一列作為對照加入5%(v/v)DMSO。各孔加入0.5 mg/mL的MTT 20 μL作為指示劑,蓋好培養(yǎng)板并在28 ℃(細(xì)菌37 ℃)溫度下培養(yǎng)24～48 h,觀察指示劑顏色變化并記錄最低抑菌濃度。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個實驗重復(fù)3次,全部實驗數(shù)據(jù)用DPS 7.55數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行處理求平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌活性

供試15種高原植物不同提取物對4種真菌和4種細(xì)菌的抑菌譜和抑菌活性強弱表現(xiàn)出很大差異(表2),在分類上同科的兩種植物其抑菌譜和抑菌活性也無相似性。

在15種供試植物的75(15×5)種提取物對8種供試菌的瓊脂孔擴散入法抑菌率測定實驗中,互格交鏈孢對6種提取物敏感,其中香薷的甲醇提取物和鐵棒錘的甲醇提取物在實驗條件下對其有57%的抑菌率。粉紅單端孢在整體上對各種提取物具有較強的抗性,其中僅有3種提取物對粉紅單端孢具有抑菌活性;砂珍棘豆的乙酸乙酯提取物在實驗條件對其有60%的抑菌率。有11種提取物對擴展青霉有抑制效果,刺柏的乙酸乙酯提取物對其有68%的抑制率。有20種提取物對半裸鐮刀菌有抑制效果,其中有三種提取物的抑菌率達(dá)67%。有18種提取物對金黃色葡萄糖球菌有抑制效果,苔草的甲醇提取物對其的抑制率為71%。大腸桿菌對8種提取物敏感,其中黃腺香青的石油醚提取物對其的抑制率高達(dá)73%。有12種提取物對枯草芽孢桿菌有抑制效果,黃腺香青的石油醚提取物對其的抑制率也高達(dá)71%。而熒光假單孢對各種提取物的敏感性最強,有54種提取物對其有不同強度的抑制效果。其中抑菌率最高的為刺柏的乙酸乙酯提取物,在實驗條件下達(dá)到73%的抑菌率。整體上各種提取物對細(xì)菌的抑菌效果強于對真菌的抑菌效果。從植物提取物的抑菌譜方面來分析,苔草、黃腺香青和刺柏的提取物各對5種菌具有抑制效果。唐古特烏頭與鐵棒錘同屬毛莨科,同科植物間提取物的抑菌譜沒有相似性。

表2 各種提取物對不同菌的抑菌率和最低抑菌濃度

續(xù)表

注:表中提取物代號PE為石油迷提取物,CE為氯仿提取物,EE為乙酸乙酯提取物,AE為丙酮提取物,ME為甲醇提取物;菌種代號A.a為互格交鏈孢,P.e為擴展青霉,F.s為半裸鐮刀菌,T.r為粉紅單端孢,S.a為金黃色葡萄糖球菌,E.c為大腸桿菌,B.s為枯草芽孢桿菌,P.f為熒光假單孢;表中“-”表示無活性。

2.2 最低抑菌濃度

最低抑菌濃度(MIC)定量地反映了不同提取物對不同供試菌的生長抑制最低作用濃度。分析表2可知,苔草的提取物EE、AE和ME對金黃色葡萄糖球菌、大腸桿菌、熒光假單孢的MIC最小值達(dá)0.05 g/mL,因此能在較低的濃度下抑制這些菌的生長。另外從供試菌的角度來分析,苔草的EE、AE和ME、互葉醉魚草的CE和EE、金華小檗的CE、EE和AE、龍膽花的EE對熒光假單孢的MIC為0.05 g/mL,表現(xiàn)出多種提取物在較低濃度下該對菌有抑制效果。

在篩選的15種高原植物中,每種植物至少有一種提取物對某些供試菌有不同程度的抑制能力。對于這些體外具有較強抑菌活性的提取物質(zhì)其體內(nèi)抑菌活性和進一步分離純化有待進行。這些天然活性提取物如果經(jīng)過純化和合理的配方,將可以用于食品腐敗菌的控制,另外也可作為合成新的抑菌劑的分子模板。多種供試植物提取物具有較好的抑菌譜,其中黃腺香青、刺柏、塞北紫芹、龍膽花、苔草的提取物至少對4種供試菌有抑制作用,且抑菌率較高。尤其苔草甲醇提取物對A.alternata、F.semitectum、E.coli、S.aureus、P.fluorescence的MIC值在0.05～0.21 g/mL之間。絕大多數(shù)供試植物提取物對熒光假單孢有明顯的抑制效果。總體來看,各提取物對細(xì)菌的抑制效果強于真菌,細(xì)菌的最高抑制率達(dá)到71%,而真菌最高抑制率均不超過68%;細(xì)菌MIC值同樣低于真菌,真菌只有苔草甲醇提取物對A.alternata和F.sulphureum的MIC值分別達(dá)到0.1 g/mL和0.21 g/mL,而對E.coli和P.fluorescence的MIC值低至0.05 g/mL。同時我們發(fā)現(xiàn)提取物抑菌圈大小與其相應(yīng)的MIC值不一定成負(fù)相關(guān)性,這與左國營[23]的研究結(jié)果相一致,初步分析可能是由于提取液含有多種成分而各成分的活性強度各不相同所致。雖然我們對15種植物樣用不同極性溶劑提取,但還是會出現(xiàn)漏篩現(xiàn)象,比如鮑敏[24]對甘肅雪靈芝乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都有抑制效果,而我們的實驗結(jié)果顯示甘肅雪靈芝各提取物對枯草芽孢桿菌沒有抑制效果。許多因素會影響實驗結(jié)果,其中包括提取物的制備方法(如有效成分的揮發(fā)),活性成分在植物不同器官的分布(如全株與部分器官的差異)和有效組分的富集程度等。

3 結(jié)論

15種高原植物四種不同提取物對8種常見微生物分別具有不同的抑菌譜和最小抑制濃度,其中黃腺香青、刺柏、塞北紫芹、龍膽花、苔草的提取物至少對4種供試菌有抑制作用;苔草的三種提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與熒光假單孢菌的最低抑菌濃度為0.05 g/mL;大部分提取物對細(xì)菌的抑制效果優(yōu)于對真菌的抑制效果。本研究結(jié)果表明生長于青藏高原獨特生態(tài)條件下的許多植物,其代謝物在體外具有較強的抑菌活性和較廣的抑菌譜;進一步研究這些代謝物的抑菌作用與機理將為新型抑菌劑的研發(fā)提供參考,也可為綠色保鮮技術(shù)的研發(fā)開辟新的途徑。

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Inhibition effects of extracts from 15 kinds Tibetan plateau plants against several common microorganisms

ZHANG Zhong,LI Ke-wei,BI Yang*,WANG Yi,REN Ya-lin

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To investigate the antimicrobial activity of some Tibetan Plateau plant extracts,agar-diffusion method and 96-well plate double dilution method were used to evaluate the inhibition effects and minimum inhibitory concentration(MIC)of different extracts from 15 kinds of Tibetan plateau plant samples. The results showed that extracts from different plateau plants had different antimicrobial spectrum and MICs. Extracts fromAnaphaliaaureopunctata,Juniperusformosara,Corydalisimpatiens,Gentianasino-ornataandCarextristachyacan inhibited at least 4 tested microorganisms,the MIC of three extracts fromCarextristachyaagainstStaphylococcusaureus,EscherichiacoliandBacillussubtiliswas 0.05 g·mL-1. Most of extracts showed more effective inhibition against bacteria than fungi. It concluded that several kinds extract from plateau plants had wide antimicrobial range and strong inhibition activity against common microorganisms.

Tibetan plateau plants;agar-diffusion method;minimum inhibitory concentration;common microorganisms

2016-05-20

張忠(1977-)，男，在讀博士，副教授，主要從事天然抗菌活性物質(zhì)方面的研究，E-mail：zhangzhong@gsau.edu.cn。

*通訊作者:畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向：采后生物學(xué)與技術(shù);食品風(fēng)味，E-mail：beyang62@163.com。

國家自然科學(xué)地區(qū)基金項目(31360416)；甘肅省中藥材產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項目(甘肅大宗道地中藥材安全防蛀防霉技術(shù)研究)；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項目(GNCX-2012-42)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000