舒沿沿,胡冰雪,潘道東,曾小群,孫楊贏,吳 振,曹錦軒

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

發(fā)酵鵝肝肽的分離純化及其抗氧化特性研究

舒沿沿,胡冰雪,潘道東*,曾小群,孫楊贏,吳 振,曹錦軒

(寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211)

為了提高普通鵝肝的綜合利用價(jià)值,本研究利用解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)混合發(fā)酵制備鵝肝肽,采用Sephadex G-25凝膠層析法分離純化出發(fā)酵鵝肝肽,并對(duì)其分離組分進(jìn)行氨基酸分析和功能特性研究(抗氧化活性、金屬螯合率測(cè)定),最后通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)測(cè)定高活性組分的相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果表明:Sephadex G-25凝膠層析依次出現(xiàn)P1、P2、P3三個(gè)峰;其中P3的必需氨基酸含量(70.32±5.35) mg/100 g明顯高于P1(40.06±2.04) mg/100 g和P2(55.39±2.56) mg/100 g,含硫氨基酸(Met、Cys)和疏水性氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)分別占總氨基酸含量的17.78%和31.31%,均高于P1(8.18%,21.46%)、P2(6.63%,21.53%)。P1、P2、P3均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。其中P3的TBRAS值為0.2495±0.016顯著低于P1、P2(p<0.01),抑制羥自由基能力,Fe2+螯合率和Cu2+螯合率分別為75.75%±0.49%、72.40%±0.80%和69.04%±0.40%,均顯著高于P1、P2(p<0.01,p<0.05,p<0.05);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定P3的相對(duì)分子質(zhì)量范圍在1.02 kD 以下。

發(fā)酵鵝肝肽,分離純化,抗氧化活性,金屬離子螯合活性

我國(guó)鵝肝資源豐富,但利用價(jià)值較低[1]。目前對(duì)鵝肝的利用仍限于初加工產(chǎn)品,研究多集中在鵝肝醬的研制,而對(duì)其精深加工研究鮮有報(bào)道。普通鵝肝的腥、異味重,質(zhì)地粗糙,漿液松散,不被消費(fèi)者推崇[2],但其蛋白含量高,具有潛在的利用價(jià)值。大分子蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗原性強(qiáng)且不易被機(jī)體直接吸收等原因影響其利用率[3-4]。小分子多肽,不僅易消化吸收,還具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老以及調(diào)節(jié)免疫等功能[5-8]。微生物發(fā)酵法除可降解大分子蛋白,增強(qiáng)發(fā)酵制品的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味特性外,還有助于生物活性肽的釋放[9-10]。

分離純化生物活性肽對(duì)其后期功能特性評(píng)價(jià)和結(jié)構(gòu)分析,進(jìn)而確定其構(gòu)效關(guān)系尤為重要。凝膠色譜法除層析柱可反復(fù)使用外,還具有設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便,洗脫條件溫和等優(yōu)勢(shì),因此多用于生物活性肽的分離純化。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)具有高的靈敏度、準(zhǔn)確度、分辨率,是一種強(qiáng)有力的分析測(cè)試手段。由于其屬于軟電離技術(shù),適用于大范圍分子質(zhì)量樣品的分析[11]。這些分析特點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)選用 5800 MALDI-TOF測(cè)定發(fā)酵鵝肝肽的相對(duì)分子質(zhì)量提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

生物活性肽種類多樣,其所具有的生物活性,如抗氧化、降血壓等逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。自由基氧化性較強(qiáng),與許多疾病和衰老有關(guān),如關(guān)節(jié)炎、糖尿病等[12]。另一方面,活性肽與金屬離子以配位鍵結(jié)合形成一種穩(wěn)定性適中的螯合物,具有比原肽較強(qiáng)的抗氧化[13]、抗菌[14]、抗衰老[15]等生物活性,作為一種天然的新型功能性物質(zhì),其安全性更高,具有較好的研究?jī)r(jià)值。所以,探究發(fā)酵鵝肝肽的抗氧化等功能特性,對(duì)鵝肝蛋白源食品添加劑或功能性食品的開發(fā)意義重大。

鑒于此,本文利用產(chǎn)蛋白酶豐富的有益菌,混合發(fā)酵鵝肝泥,采用凝膠層析分離發(fā)酵鵝肝肽,并對(duì)其分離組分的抗氧化活性等進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)而篩選出抗氧化活性較高組分,并測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量。此研究為鵝肝源功能性食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凍藏鵝肝 由象山曙海大白鵝食品有限公司提供;解淀粉芽孢桿菌(BacillusamyloliquefaciensCICC 10888)、地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisCICC 21737) 購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC 14917) 為本實(shí)驗(yàn)室保存;LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基 杭州生物試劑公司;交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25 西安沃爾森生物科技有限公司;菲啰嗪 上海晶純生化科技股份有限公司;抗壞血酸 成都市科龍化工試劑廠;丙二醛(Malondialdehyde)試劑盒 南京建成生物工程有限公司;抑制羥自由基能力試劑盒 南京建成生物工程有限公司;肉桂酸(CHCA C2020-10G) 美國(guó) Sigma 公司。

A200氨基酸自動(dòng)分析儀 德國(guó)安米諾西斯;5800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF) 上海生工;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;MM12B型絞肉機(jī) 廣東省韶關(guān)市大金食品機(jī)械廠;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;Spectar Max 190 酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;GYB30-6D高壓均質(zhì)機(jī) 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠;YC-2層析柜 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵鵝肝肽的制備 用絞肉機(jī)將解凍鵝肝2.0 kg絞成泥狀,加入1.5倍體積比的丙酮浸提24 h,8000 r/min離心20 min后傾去上清液,收集沉淀冷凍干燥48 h。將凍干后的鵝肝粉按1∶3料水比(121 ℃滅菌15 min),1∶1∶1(解淀粉芽孢桿菌:地衣芽孢桿菌:嗜酸乳桿菌)的混菌比,4%的接種量32 ℃發(fā)酵48 h,121 ℃滅菌15 min終止發(fā)酵。發(fā)酵液8000 r/min離心15 min后收集上清液,經(jīng)0.08 MPa隔膜真空泵抽濾除雜、0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后,冷凍干燥成粉末狀備用(0.167 kg,得率8.35%)。

1.2.2 發(fā)酵鵝肝肽的分離純化 Sephadex G-25層析分離純化得到不同分子量大小的鵝肝肽,流動(dòng)相用脫氣后的超純水,以10 mL/min的流速在220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。上樣質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL,上樣量0.75 mL/(mL葡聚糖凝膠)。收集峰的洗脫液,冷凍干燥后收集備用。

1.2.3 發(fā)酵鵝肝肽氨基酸含量組成分析 稱取50 mg分離純化后凍干的發(fā)酵鵝肝肽,加入5 mL 6 mol/L HCl,混勻,吹入氮?dú)獯諝馀艃艉蠓饪?。在烘箱?nèi)110 ℃消化24 h后,用超純水定容至50 mL容量瓶中,混勻后取1 mL移入玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無流動(dòng)水,再用1 mL 0.02 mol/L的HCl溶解,搖勻后用0.22 μm水系過濾器過濾,收集至樣品瓶中用氨基酸分析儀檢測(cè)。

1.2.4 發(fā)酵鵝肝肽的抗氧化特性研究

1.2.4.1 抗脂質(zhì)氧化能力測(cè)定 抗脂質(zhì)氧化能力測(cè)定方法參考[16]略有改動(dòng),取1.0 g玉米油,100 μL吐溫-20,100 mL蒸餾水加入燒杯混勻,在冰盒內(nèi)放置30 min后,均質(zhì)2 min制成水包油型乳化劑。取8 mL上述乳化劑、0.5 mL 0.2%的抗壞血酸、0.5 mL 200 ppm的Fe2+(FeSO4)和1 mL樣品(5 g/L)混勻后37 ℃孵育16 h。孵育結(jié)束后按丙二醛(MDA)試劑盒法依次加入試劑,渦旋,用封口膜封口并刺孔,95 ℃水浴40 min,取出后冰浴10 min,離心(4000 r/min)10 min,取上清在532 nm處測(cè)吸光值。硫代巴比妥酸(TBARS)值用每mL乳化劑中生成丙二醛的nmol數(shù)表示。

式(1)

式中,10為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,單位為nmol/L。

1.2.4.2 抑制羥自由基能力測(cè)定 羥自由基是活性氧的一種,主要由過氧化物負(fù)離子和過氧化氫反應(yīng)生成,可使組織遭受氧化性損傷和破壞。抑制羥自由基能力測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

羥自由基抑制率(%)=對(duì)照OD值-測(cè)定OD值/對(duì)照OD值×100

式(2)

1.2.4.3 Fe2+螯合活性測(cè)定[17]依次加入100 μL樣品(5 g/L)、1 mL蒸餾水和1 mL 10 ppm Fe2+(FeSO4)于10 mL離心管中,混勻后室溫孵育5 min,接著用900 μL 11.3%的TCA除去大蛋白,4000 r/min離心10 min后取1 mL上清液移入10 mL離心管,再依次加入1 mL蒸餾水,800 μL 10%的乙酸銨,200 μL鄰二氮菲亞鐵離子顏色指示劑,渦旋后孵育5 min,562 nm測(cè)吸光值,根據(jù)公式(2)計(jì)算Fe2+螯合率。

表1 發(fā)酵鵝肝肽的氨基酸組成及含量(mg/100 g)

式(3)

1.2.4.4 Cu2+螯合活性測(cè)定[18]依次加入1 mL 2 mM CuSO4,1 mL 10%的吡啶,20 μL 0.1%的鄰苯二酚紫和1 mL樣品(5 g/L)于10 mL離心管中,混勻后室溫孵育5 min,在632 nm測(cè)吸光度,根據(jù)公式(3)計(jì)算Cu2+螯合率。

式(4)

1.2.5 飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)P3的相對(duì)分子質(zhì)量分析 取1 μL P3樣品點(diǎn)至樣品靶上,自然干燥后,再取0.6 μL CHCA 基質(zhì)溶液點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥,用相同方法在樣品靶位相鄰位置點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品,在正離子模式下選擇線性方法對(duì)樣品測(cè)試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)范圍為:1.05、1.53、2.47、3.49 kD。校準(zhǔn)后在正離子模式下選擇線性方法測(cè)試樣品分子量。最后將質(zhì)譜數(shù)據(jù)及圖譜進(jìn)行處理,5800 MALDI-TOF/TOF產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導(dǎo)出。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)處理均做三個(gè)重復(fù),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所得數(shù)據(jù)使用SAS 8.0中one-way ANOVA的 Duncan’s Multiple Range Test 模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異顯著性水平p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 Sephadex G-25層析分離純化鵝肝肽

凝膠層析是一種能將不同分子量大小物質(zhì)分離的層析方法。其原理是:大分子只留在凝膠顆粒之間的流動(dòng)相中,因此率先流出層析柱,而小分子則能自由出入凝膠顆粒中,并很快在流動(dòng)相和靜止相之間形成動(dòng)態(tài)平衡,因此需較長(zhǎng)的時(shí)間流出柱床,從而使不同大小分子量的物質(zhì)得以分離。

由圖1可看出,整個(gè)層析過程中先后出現(xiàn)了3個(gè)明顯的峰P1、P2、P3。由此可看出SephadexG-25層析可將發(fā)酵鵝肝肽按分子量大小分離出三個(gè)組分,且分子量大小P1>P2>P3。

圖1 發(fā)酵鵝肝肽的Sephadex G-25層析圖Fig.1 Sephadex G-25 chromatography of peptides from fermented goose liver

2.2 發(fā)酵鵝肝肽氨基酸組成及含量

小分子肽的功能特性不僅與其相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān),還與其氨基酸含量、種類密切相關(guān)。由表1可知,P1、P2、P3均含有16種氨基酸,其中P3的必需氨基酸含量(70.32±5.35) mg/100 g明顯高于P1(40.06±2.04) mg/100 g、P2(55.39±2.56) mg/100 g。研究表明含硫氨基酸和疏水性氨基酸具有抗氧化活性[19-20],P3中含硫氨基酸(Met、Cys)含量和疏水性氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)含量分別占總氨基酸含量的17.78%和31.31%,均高于P1(8.18%,21.46%)、P2(6.63%,21.53%),這表明P3具有潛在的抗氧化活性。

2.3 發(fā)酵鵝肝肽體外抗氧化特性

2.3.1 發(fā)酵鵝肝肽的抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定 丙二醛是脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一,所以丙二醛含量越少,抗氧化活性越高。由圖2可知,抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品組P1、P2、P3的TBARS值均低于對(duì)照組,分別為0.605±0.013,0.305±0.032,0.2495±0.016,其中,P1的TBARS值約是對(duì)照組的70%,P2的TBARS值約是對(duì)照組的35%,P3的TBARS值約是對(duì)照組的28%,與 Abeyrathne[16]研究中添加卵黏蛋白酶解物組的TBARS值是對(duì)照組的33.30%的結(jié)果接近,均具有較高的抗脂質(zhì)氧化活性。

圖2 發(fā)酵鵝肝肽的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.2 Lipid peroxidation inhibition capacities of peptides from fermented goose liver 注:P1:G-25 P1收集液,P2:G-25 P2收集液,P3:G-25 P3收集液,Control:對(duì)照組;a、b、c、d不同字母代表差異顯著,p<0.05或p<0.01,圖2～圖5同。

2.3.2 發(fā)酵鵝肝肽抑制羥基自由基能力測(cè)定 由圖3可知,樣品組P1、P2、P3均具有較強(qiáng)的抑制羥基自由基能力,分別為45.73%±0.46%,55.20%±0.84%,75.75%±0.49%。其中,P3的羥自由基清除率略高于曾慶祝[21]扇貝邊枯草桿菌酶解產(chǎn)物中分子量為1.8 kD的肽(64.3%),與邱春江[22]貽貝酶解產(chǎn)物中1.4 kD的肽(76.15%,69.13%)相當(dāng)。

圖3 發(fā)酵鵝肝肽的抑制羥自由基能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ratios of peptides from fermented goose liver

2.3.3 發(fā)酵鵝肝肽的Fe2+螯合活性測(cè)定 由圖4可知,Fe2+螯合活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品組P1、P2、P3均有較高的Fe2+螯合活性分別為49.85%±0.75%,60.86%±0.44%,72.40%±0.80%,其中P3活性高于Abeyrathne[16]研究中卵黏蛋白酶解產(chǎn)物、黃鱔魚骨多肽[23]。由于具有高Fe2+螯合率的肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力[24],所以,研究具有高Fe2+螯合率的發(fā)酵鵝肝肽有助于其抗氧化活性的研究。

圖4 發(fā)酵鵝肝肽的Fe2+螯合活性Fig.4 Fe2+ chelating activity of peptides from fermented goose liver

2.3.4 發(fā)酵鵝肝肽的Cu2+螯合活性測(cè)定 由圖5可知,Cu2+-螯合活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品組P1、P2、P3均具有較好的Cu2+螯合活性,分別是44.80%±0.9%,50.91%±0.97%,69.04%±0.40%,均高于馬鈴薯水解肽(43.0%)[25]。

圖5 發(fā)酵鵝肝肽的Cu2+螯合活性Fig.5 Cu2+ chelating activity of peptides from fermented goose liver

2.4 功能特性較高組分P3的相對(duì)分子質(zhì)量分析

發(fā)酵鵝肝肽體外抗氧化特性研究表明,由Sephadex G-25層析分離純化得到的三組分中,P3組分抗氧化活性相對(duì)最佳,有必要對(duì)其進(jìn)行更深一步的鑒定?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜目前多用于生物大分子檢測(cè)、微生物篩選鑒別、蛋白和多肽等物質(zhì)鑒定等。如Zhao等[26]用MALDI-TOF-MS測(cè)定了植物乳桿菌素JLA-9的分子質(zhì)量為1.04 kD;Agrawal等[27]利用MALDI-TOF-MS鑒定了珍珠粟水解物中抗氧化肽的氨基酸序列;由圖6可知MALDI-TOF鑒定P3的分子質(zhì)量范圍在1.02 kD以下,與苜蓿葉蛋白水解物[28]中抗氧化肽分子量小于1.0 kD結(jié)果一致。對(duì)于發(fā)酵鵝肝抗氧化肽肽段結(jié)構(gòu)的鑒定以及構(gòu)效關(guān)系研究還需要對(duì)其進(jìn)一步純化并做相應(yīng)的細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

圖6 P3相對(duì)分子質(zhì)量分析結(jié)果Fig.6 Molecular weight analysis of P3

3 結(jié)論

水解動(dòng)植物蛋白制備生物活性肽是近年來研究的熱點(diǎn),以農(nóng)副產(chǎn)品如玉米蛋白粉、大豆蛋白等為原料制備生物活性肽的研究較多。近年來陸續(xù)出現(xiàn)以動(dòng)物下腳料如胎盤[29]、魚鱗膠原蛋白30]等為原料制備生物活性肽。但對(duì)于鵝肝源生物活性肽的制備鮮有報(bào)道。

本研究采用微生物發(fā)酵法制備發(fā)酵鵝肝肽,經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析依次分離純化出P1、P2、P3三個(gè)組分,抗氧化特性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明三者均具有較強(qiáng)的抗氧化活性,金屬螯合活性,其中P3活性最高。此結(jié)果與2.2發(fā)酵鵝肝肽氨基酸分析結(jié)果P3相對(duì)P1、P2具有較高含量的抗氧化活性氨基酸結(jié)果一致。MALDI-TOF鑒定P3的分子質(zhì)量范圍在1.02 kD以下,表明分子量<1.02 kD的發(fā)酵鵝肝肽抗氧化活性最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)獲得了較高活性的發(fā)酵鵝肝肽,為其進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定及構(gòu)效關(guān)系探索奠定了研究基礎(chǔ)。

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Isolation and antioxidant activity of fermentation peptides from goose liver

SHU Yan-yan,HU Bing-xue,PAN Dao-dong*,ZENG Xiao-qun,SUN Yang-ying,WU Zhen,CAO Jin-xuan

(Department of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Fermented peptides from goose liver were prepared using Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus licheniformis,and lactobacillus acidophilus. The fermented peptides were separated and purified by Sephadex G-25 gel filtration chromatography. The composition and content of amino acids were analysed by Amino Acid analyzer,and then functions(antioxidant activity and metals-chelating activity)of P1、P2、P3 were studied. The relative molecular weight of high-active fraction was determined by MALDI-TOF/TOF. Three peptide peaks were obtained after Sephadex G-25 gel filtration chromatography. The content of essential amino acid of P3(70.32±5.35)mg/100 g was significantly higher than P1(40.06±2.04)mg/100 g,and P2(55.39±2.56)mg/100 g;Proportions of sulfur-containing amino acids(Met、Cys)and hydrophobic amino acids(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)in total amino acids of P3(17.78%,31.31%)were higher than those of P1(8.18%,21.46%)and P2(6.63%,21.53%). P1、P2 and P3 all possessed strong antioxidant activity. The TBRAS of P3(0.2495±0.016)was significantly smaller than P1、P2(p<0.01),the hydroxyl radical scavenging ratio75.75%±0.49%、Fe2+chelating activity(2.40%±0.80% and Cu2+chelating activity69.04%±0.40%was significantly higher than P1、P2(p<0.01,p<0.05,p<0.05).The relative molecular weight of P3 was determined to be lower than 1.02 kD by MALDI-TOF/TOF.

fermented peptide from goose liver;purification;antioxidant activity;metal chelating activity

2016-06-30

舒沿沿( 1989-) ，女，在讀碩士，研究方向:功能性因子，E-mail:shuyanyan900707@163.com。

*通訊作者:潘道東(1964-)，男，博士，教授，研究方向:畜產(chǎn)品加工，E-mail:daodongpan@163.com。

水禽肉品質(zhì)及其深加工技術(shù)研究(ZX2012000380)。

TS251

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000