周 鑫 潘 泓 楊日榮 黃鼎銘 王守峰 徐 誼

(1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤科，南寧市 530021，E-mail：397567210@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學免疫學教研室，南寧市 530021)

論著·臨床研究

非小細胞肺癌患者腫瘤組織乳酸脫氫酶A和Sox-2基因的表達及其臨床意義

周 鑫1，2潘 泓1楊日榮3黃鼎銘1王守峰1徐 誼1，2

(1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤科，南寧市 530021，E-mail：397567210@qq.com；2 廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學免疫學教研室，南寧市 530021)

目的 探討非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織的乳酸脫氫酶A(LDHA)和正性別決定區(qū)Y框蛋白-2(Sox-2)基因的表達情況及其臨床意義。方法 選擇54例NSCLC患者，采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)檢測腫瘤組織及癌旁組織中LDHA和Sox-2基因的表達水平，分析腫瘤組織中LDHA和Sox-2基因的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系，以及腫瘤組織LDHA與Sox-2基因表達水平的關(guān)系。結(jié)果 NSCLC腫瘤組織的LDHA和Sox-2相對表達均高于癌旁組織(P<0.05)。腫瘤細胞分化程度低者腫瘤組織LDHA、Sox-2表達量高于分化程度高者(P<0.05)。腫瘤組織LDHA與Sox-2基因表達水平呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 NSCLC患者腫瘤組織中LDHA和Sox-2表達均有升高，兩者在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用。

非小細胞肺癌；乳酸脫氫酶A；正性別決定區(qū)Y框蛋白-2

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率均最高的惡性腫瘤之一[1]，且大多數(shù)患者確診時病情已處于晚期，錯過了最佳治療時期，肺癌患者5年生存率不足15%[2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)生、發(fā)展機制一直是腫瘤學的研究熱點。腫瘤細胞代謝速度遠遠高于正常細胞，主要表現(xiàn)為糖酵解明顯增強。乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase-A，LDHA)是糖酵解的關(guān)鍵酶之一，能夠催化丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸，并形成缺氧微環(huán)境，進而誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子-α(hypoxia inducible factor-α，HIF-α)生成，促進正性別決定區(qū)Y框蛋白-2(SRY related HMG box-2，Sox-2)等腫瘤干細胞因子表達升高，最終導(dǎo)致腫瘤干細胞的形成；腫瘤干細胞在腫瘤的發(fā)生、常規(guī)治療失敗及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[3]。本文采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)的方法檢測NSCLC患者腫瘤組織及癌旁組織LDHA和Sox-2基因的表達，探討二者表達水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有標本均來自于2014年11月至2015年12月在廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院就診、經(jīng)手術(shù)切除且病理證實為NSCLC的54例患者，其中男性32例、女性22例，年齡42～79歲，中位年齡59歲。所有患者病歷信息完整，術(shù)前均未行放化療。所有標本均在離體后立即置于冰盒中，并于30 min內(nèi)保存于-80℃冰箱中。每位患者的標本均包括腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁(距腫瘤邊緣5 cm)正常肺組織。

1.2 試劑與儀器 Trizol(RNAiso Plus NO.8109)、RNase處理水、SYBR熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMII NO.RR 820A)購于日本Taraka公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TOYOBO公司(NO.FSK-100)，RNase-Free DNaseⅠ 購于美國Promega公司(NO.M610A)，異丙醇、無水乙醇、氯仿購于天津致遠化學試劑公司。 RT-qPCR引物Sox-2、LDHA、β-肌動蛋白購于上海生工試劑公司。RNA濃度測量儀購自美國Thermo公司(NanoDrop 2000型)、多通道PCR儀購自德國Biometra公司(TProfessional型)，RT-qPCR儀購自美國安捷倫公司(Mx3000P型)。

1.3 實驗方法 使用Trizol試劑利用酸性酚抽提法提取新鮮組織中總RNA，并使用脫氧核糖酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)進行去基因組處理。DNaseⅠ處理總RNA后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。在基因庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中檢索獲得LDHA、Sox-2基因全長，使用引物設(shè)計Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，在Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上進行引物驗證，引物由上海生工公司合成。引物序列分別為：LDHA-上游：5′-GGACTTGGCAGATGAACTTG-3′，LDHA-下游：5′-TCAGAGAGACACCAGCAACA-3′；Sox-2-上游：5′-CGATGCCGACAAGAAAACTT-3′，Sox-2-下游：5′-CAAACTTCCTGCAAAGCTCC-3′。利用SBYR熒光定量試劑盒進行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，共40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束后讀取熒光信號；所有循環(huán)結(jié)束后，讀取溶解曲線；電腦自動分析讀取的熒光信號并將其轉(zhuǎn)換Ct值。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以(x±s)表示，均數(shù)比較采用t檢驗，LDHA和Sox-2表達量關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)性分析及直線回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 LDHA和Sox-2的溶解、擴增曲線 RT-qPCR的溶解曲線顯示，采用SBYR熒光染料對LDHA和Sox-2基因進行實時熒光定量檢測，均出現(xiàn)單一的溶解峰，提示特異性好，見圖1、圖2。

擴增曲線 溶解曲線

圖1 LDHA基因RT-qPCR熒光擴增曲線圖及反應(yīng)溶解曲線

擴增曲線 溶解曲線

圖2 Sox-2基因RT-qPCR熒光擴增曲線圖及反應(yīng)溶解曲線

2.2 腫瘤組織和癌旁組織LDHA和Sox-2的表達情況 腫瘤組織LDHA相對表達量高于癌旁組織(2.08±2.04)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.954，P=0.006)，其中腫瘤組織LDHA表達量最高為癌旁組織的17.63倍。腫瘤組織Sox-2相對表達量高于癌旁組織(2.19±2.22)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.760，P=0.010)，其中腫瘤組織Sox-2表達量最高為癌旁組織的14.04倍。2.3 腫瘤組織LDHA、Sox-2表達和NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤細胞分化程度低者LDHA和Sox-2的相對表達量高于分化程度高者(P<0.05)；不同性別、年齡、組織類型及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移者的LDHA和Sox-2的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4 腫瘤組織LDHA和Sox-2表達量的關(guān)系 腫瘤組織LDHA表達與Sox-2表達呈正相關(guān)(r=0.579，P<0.001)。進一步分析發(fā)現(xiàn)LDHA和Sox-2表達關(guān)系符合y=1.396+0.567x線性回歸方程，方程有統(tǒng)計學意義(F=15.597，P<0.001)。

表1 不同臨床病理特征患者腫瘤組織的LDHA、Sox-2表達情況(x±s)

3 討 論

LDHA是糖無氧氧化中關(guān)鍵酶之一，其基因定位于11p15.4，是一種由4個亞基聚合而成的四聚體酶，能夠催化糖酵解終末產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。與正常組織細胞不同，腫瘤細胞在有氧情況下仍呈現(xiàn)出糖酵解代謝增強，即Warbug效應(yīng)。増強的糖醇解產(chǎn)生的大量乳酸和多種糖代謝中間產(chǎn)物能夠用于合成氨基酸、核酸等細胞增殖必需的原料，并能夠維持組織缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-α等微環(huán)境因子促進腫瘤細胞的生長和增殖，而這些腫瘤生長誘導(dǎo)因子反過來促進LDHA的合成，形成一個惡性循環(huán)[4-5]。研究表明LDHA在多種腫瘤中都有不同程度的過度表達，發(fā)揮類似癌基因的作用[6]。有學者報告，NSCLC患者腫瘤組織中LDHA以及HIF-α的表達較癌旁組織明顯升高，且LDHA與HIF-α高表達者比低表達者更容易對化療、放療等常規(guī)治療產(chǎn)生耐藥，生存期更短，預(yù)后更差[7]。本研究結(jié)果也顯示，腫瘤組織LDHA基因的相對表達量較癌旁組織明顯升高(P<0.05)，進一步發(fā)現(xiàn)臨床病理特征分析，腫瘤細胞分化程度低者表達量明顯高于腫瘤細胞分化程度高者(P<0.05)。

干細胞核心轉(zhuǎn)錄因子Sox-2是屬于Sox基因超家族的重要成員，基因定位在3q26.33，在胚胎發(fā)育中維持干細胞的自我更新、多向分化等功能，具有不可代替的作用[8]。學者研究發(fā)現(xiàn)Sox-2與Oct-4、Nanog等干細胞標志物存在協(xié)同作用，而其缺失、突變可導(dǎo)致干細胞失去多向分化能力甚至死亡[9-10]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中Sox-2表達量升高，如肺癌、乳腺癌、胃癌等。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中Sox-2表達量高于癌旁正常組織(P<0.05)，分化程度較低者Sox-2表達量更高(P<0.05)。Li等[11]也發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中Sox-2表達較癌旁組織明顯升高，且腫瘤細胞分化程度低者較分化程度高者表達量高。許偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)Sox-2在NSCLC腫瘤組織中表達量上升，且其表達量和腫瘤體積呈正相關(guān)。以上研究結(jié)果與本研究的相似，這提示Sox-2可能與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

NSCLSC的發(fā)生機制是近年來腫瘤研究的熱點之一，但鮮有關(guān)于其代謝方面的研究。體外研究表明，過表達的LDHA能夠產(chǎn)生大量的乳酸及糖酵解中間產(chǎn)物以促進腫瘤細胞的生長，并且能夠形成適于腫瘤細胞的缺氧微環(huán)境，而缺氧能夠誘導(dǎo)HIF-α的生成，進而促進Sox-2等腫瘤干細胞標志物表達量升高[13-14]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤組織中LDHA和Sox-2的表達水平呈正相關(guān)(P<0.05)。我們推測腫瘤組織中LDHA表達量升高，在腫瘤組織中形成缺氧微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-α的生成，進而促進腫瘤干細胞轉(zhuǎn)錄因子Sox-2的生成，最終導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生、侵襲和進展等一系列生物學變化。在臨床病理特征分析中，我們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞分化程度低者腫瘤組織的LDHA、Sox-2表達量升高，這也提示腫瘤分化程度越低，其干細胞特性越強，代謝越快，腫瘤細胞越容易缺氧，形成缺氧微環(huán)境，進而誘導(dǎo)腫瘤干細胞標志物表達量的上升[12，15]。

總之，NSCLC患者腫瘤組織中LDHA和Sox-2表達均有升高，且兩者表達呈正相關(guān)，在一定程度揭示了腫瘤細胞生長、代謝的相關(guān)機制。

[1] Ramalingam SS,Owonikoko TK,Khuri FR.Lung cancer:new biological insights and recent therapeutic advances[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):91-112.

[2] Edwin SBS,Roald NGMD.Cancer statistics [J].CA Cancer J Clin,2008,20(1):10-23.

[3] Tirino V,Camerlingo R,Bifulco K,et al.TGF-β1 exposure induces epithelial to mesenchymal transition both in CSCs and non-CSCs of the A549 cell line,leading to an increase of migration ability in the CD133+ A549 cell fraction[J].Cell Death Dis,2013,4:e620.

[4] Kayser G,Kassem A,Sienel W,et al.Lactate-dehydrogenase 5 is overexpressed in non-small cell lung cancer and correlates with the expression of the transketolase-like protein 1[J].Diagn Pathol,2010,5(1):22.

[5] Bao B,Azmi AS,Ali S,et al.The biological kinship of hypoxia with CSC and EMT and their relationship with deregulated expression of miRNAs and tumor aggressiveness [J].Biochim Biophys Acta,2012,1826(2):272-296.

[6] Miao P,Sheng S,Sun X,et al.Lactate dehydrogenase A in cancer:a promising target for diagnosis and therapy[J].IUBMB Life,2013,65(11):904-910.

[7] Hoang T,Dahlberg SE,Sandler AB,et al.Prognostic models to predict survival in non-small-cell lung cancer patients treated with first-line paclitaxel and carboplatin with or without bevacizumab[J].J Thorac Oncol,2012,7(9):1 361-1 368.

[8] Ellis P,Fagan BM,Magness ST,et al.SOX2,a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells,the embryo or the adult[J].Dev Neurosci,2004,26(2-4):148-165.

[9] Xiang R,Liao D,Chen MT,et al.abstract 4232:Tumor-associated macrophages are responsible for EGF-R triggered upregulation of the Sox-2 signaling pathway in CSCs,which enhance tumorigenicity and tumor metastasis[J].Cancer Res,2011,70(8 Supplement):4 232-4 232.

[10]Liang S,Furuhashi M,Nakane R,et al.Isolation and characterization of human breast cancer cells with SOX2 promoter activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,437(2):205-211.

[11]Li X,Wang J,Xu Z,et al.Expression of Sox2 and Oct4 and their clinical significance in human non-small-cell lung cancer[J].Int J Mol Sci,2012,13(6):7 663-7 675.

[12]許 偉,位云艷,譚瑤曦,等.干細胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2在肺癌中的表達和意義[J].中國肺癌雜志,2013,16(11):591-595.

[13]Semenza GL,Jiang BH,Leung SW,et al.Hypoxia response elements in the aldolase A,enolase 1,and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1[J].J Biol Chem,1996,271(51):32 529-32 537.

[14]Bhagat M,Palanichamy JK,Ramalingam P,et al.HIF-2α mediates a marked increase in migration and stemness characteristics in a subset of glioma cells under hypoxia by activating an Oct-4/Sox-2-Mena(INV) axis[J].Int J Biochem Cell Biol,2016,74:60-71.

[15]Danner BC,Didilis VN,Wiemeyer S,et al.Long-term survival is linked to serum LDH and partly to tumour LDH-5 in NSCLC[J].Anticancer Res,2010,30(4):1 347-1 351.

Expressions of lactate dehydrogenase-A and SRY-related HMG box-2 in tumor tissues of patients with non-small cell lung cancer and its clinical significance

ZHOUXin1,2,PANHong1,YANGRi-rong3,HUANGDing-ming1,WANGShou-feng1,XUYi1,2

(DepartmentofThoracicTumor,AffiliatedCancerHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;3DepartmentofImmunology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the expressions of lactate dehydrogenase-A(LDHA) and SRY-related HMG box-2(Sox-2) in tumor tissues of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC) and its clinical significance. Methods Fifty-four patients with NSCLC were enrolled.Real-time quantitative polymerase chain reaction method was used to detect the expression levels of LDHA and Sox-2 in tumor tissues and paracarcinoma tissues.The relationship of LDHA and Sox-2 expressions in tumor tissues with clinicopathological features was analyzed.The relationship of LDHA expression with Sox-2 expression in tumor tissues was also analyzed.Results The relative expression levels of LDHA and Sox-2 in tumor tissues were higher than those in paracarcinoma tissues(P<0.05).And the expressions of LDHA and Sox-2 in tumor tissues were higher in the patients with poor differentiation compared to the patients with well differentiation(P<0.05).The expression level of LDHA positively correlated with the expression level of Sox-2 in tumor tissues(P<0.05). Conclusion The expressions of LDHA and Sox-2 in tumor tissues are higher among the patients with NSCLC.A synergistic effect exists in LDHA and Sox-2 during the occurrence and development of tumor.

Non-small cell lung cancer,Lactate dehydrogenase-A,SRY-like HMG box-2

周鑫(1989～)，男，在讀碩士研究生，研究方向：胸部腫瘤綜合治療。

潘泓(1968～)，男，博士，教授，研究方向：胸部腫瘤綜合治療，E-mail：pan_hong1999@aliyun.com。

R 734.2

A

0253-4304(2016)11-1529-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.11.14

2016-06-06

2016-07-19)