翁敬錦 司勇鋒 鄧卓霞 覃揚達 韋嘉章 寧樂平 陸錦龍 江 河 韓 星

(1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科、鼻咽癌研究所，南寧市 530021，E-mail：wengjingjin@163.com；2 廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧市 530021；3 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南寧市 530021)

論著·臨床研究

鼻咽癌復發(fā)患者EB病毒DNA及抗體的表達情況及其臨床意義▲

翁敬錦1，2司勇鋒1鄧卓霞1覃揚達1韋嘉章1寧樂平3陸錦龍1江 河1韓 星1

(1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科、鼻咽癌研究所，南寧市 530021，E-mail：wengjingjin@163.com；2 廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧市 530021；3 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南寧市 530021)

目的 探討鼻咽癌復發(fā)患者治療前后EB病毒(EBV)-DNA、病毒衣殼蛋白抗原-IgA(VCA-IgA)和早期抗原-IgA(EA-IgA)的表達情況及其臨床意義。方法 選擇鼻咽癌復發(fā)患者124例為復發(fā)組，其中手術組77例，采用鼻內鏡手術或鼻內鏡手術聯合放、化療；放化療組47例，采用放療和(或)化療。另選取30例鼻咽癌治療后放射性顱底骨壞死患者(無復發(fā))為對照組。在治療前及治療結束時，檢測所有患者血清VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNA陽性表達情況。結果 治療前，復發(fā)組、對照組EBV-DNA陽性率分別為51.61%、0，兩組VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。治療前，局部、頸部、局部及頸部復發(fā)的鼻咽癌患者間EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期復發(fā)鼻咽癌患者中，EBV-DNA陽性率隨臨床分期增高而增高(P<0.05)，但VCA-IgA及EA-IgA陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療前，手術組與放化療組EBV-DNA、VCA-IgA、EA-IgA陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后，手術組EBV-DNA轉陰率高于放化療組(P<0.05)，且手術組EBV-DNA陽性率低于放化療組(P<0.05)，但兩組VCA-IgA及EA-IgA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 檢測EBV-DNA可能有助于判斷鼻咽癌復發(fā)和分期，手術治療有助于清除機體的EBV。但在鼻咽癌治療后放射性顱底骨壞死患者中仍可檢出VCA-IgA、EA-IgA，建議對患者的抗體水平進行動態(tài)觀察。

鼻咽腫瘤；EB病毒；DNA；病毒衣殼蛋白抗原-IgA；早期抗原-IgA；手術；放射治療；化學治療

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的惡性腫瘤之一。由于對放射線敏感，放射治療是初治鼻咽癌治療的主要手段。放療后失敗的主要原因包括復發(fā)和遠處轉移，復發(fā)率約為10%[1]。由于首程放療后鼻咽部纖維化增生、血供較差、乏氧細胞增多等原因，單純再程放療療效不佳。已有研究證實手術在治療殘留和復發(fā)鼻咽癌中具有重要作用[2]。由于鼻咽部解剖結構復雜，以往常常通過上頜骨切開外旋切除復發(fā)病灶；隨著鼻內鏡技術的發(fā)展，目前不少機構開展了鼻內鏡手術切除鼻咽癌復發(fā)病灶并取得較好的療效[3-4]。相關研究證實EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)-DNA水平是監(jiān)測復發(fā)鼻咽癌患者療效的有效指標[5]。目前，有關復發(fā)鼻咽癌患者鼻內鏡手術前后EB病毒DNA和EB病毒抗體水平的研究報道罕見。本研究通過檢測復發(fā)鼻咽癌患者治療前后血漿EBV-DNA水平及血清病毒衣殼蛋白抗原-IgA(viral capsid antigen-IgA，VCA-IgA)和早期抗原-IgA(early antigen-IgA，EA-IgA)水平，探討其變化特點及其與臨床指標的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月至2016年1月在我院治療的鼻咽癌復發(fā)患者。納入標準：(1)我院確診復發(fā)并且無遠處轉移鼻咽癌，未經治療的患者；(2)距離首程末次放療結束日3個月以上；(3)有可測量及評價療效的病灶；(4)卡氏評分≥70分；(5)患者同意對治療后復發(fā)病灶再治療，包括手術和(或)放化療，并在知情同意書上簽字。共納入124例(復發(fā)組)，男95例，女29例，年齡22～70歲，中位年齡49歲；均經組織病理檢查確診。其中手術組77例，采用鼻內鏡手術或鼻內鏡手術聯合放、化療；放化療組47例，采用放和(或)化療。兩組病例的性別、年齡、T分期、N分期、臨床分期比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。選擇同期30例鼻咽癌治療后放射性顱底骨壞死患者(無復發(fā))作為對照組，其中男25例，女5例，年齡20～69歲，中位年齡55歲，與復發(fā)組比較，兩組的性別和年齡差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 手術組和放化療組的臨床資料比較(n，%)

1.2 復發(fā)鼻咽癌的治療方法 (1)手術：全麻成功后，使用腎上腺素棉片收縮鼻腔黏膜3次，使用0度鼻內鏡常規(guī)切除鼻中隔后1/3，沿腫瘤周邊正常黏膜切開，通常切除深度達顱底骨質，依據腫瘤的位置及侵犯情況做相應范圍切除。(2)放療：采用調強放療，依據MRI顯示的腫瘤影像邊界勾畫靶區(qū)，其中腫瘤靶區(qū)(gross tumor volume，GTV)2.0～2.2 Gy/次，計劃靶區(qū)(planning target volume，PTV)1.8～2.0 Gy/次，5 d/周，GTV總劑量為50～60 Gy，PTV為45～60 Gy。(3)化療：TP(紫杉醇+順鉑)或者PF(順鉑+氟尿嘧啶)方案化療2～4周期。TP方案：多西紫杉醇75 mg/m2，第1天使用，靜脈滴注60 min；順鉑30 mg/m2，第1～3天使用，靜脈滴注，每21 d為1周期；PF方案：順鉑30 mg/m2，于第1～3天靜脈滴注；氟尿嘧啶2 000 mg/m2，持續(xù)120 h泵入，每21 d為1周期。

1.3 標本收集 所有患者于治療前及出院當天分別取肘靜脈血2.0 ml，分別置于1個乙二胺四乙酸抗凝管和1個促凝管中；其中抗凝管以3 000 r/min離心5 min后分離上層血漿，用于提取DNA，促凝管以3 000 r/min離心5 min后分離血清，-20℃下保存待測。

1.4 檢測儀器 采用瑞士Tecan公司Freedom EVO? 酶聯免疫吸附測定(ELISA)酶標儀和Roche公司的LightCycler?480熒光定量PCR儀。

1.5 檢測方法 (1)分別使用北京新興四寰生物技術有限公司(批號：201508002)和歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份公司(批號：E150924AS)提供的ELISA試劑盒測定VCA-IgA和EA-IgA，按試劑說明書操作規(guī)程進行操作，用酶標儀定性檢測，得吸光度值(A值)。結果判斷：VCA-IgA比值>1.0判定為陽性，EA-IgA比值>1.1判定為陽性。(2)熒光定量PCR測定EBV-DNA水平：試劑盒由中山大學達安基因診斷中心提供(編號：Cat.#DA-D065)，所擴增的目的基因來自EB病毒的BamHI-W片段，按說明書操作規(guī)程進行操作。結果判斷：擴增結果>0 copy/ml判定為陽性。

1.6 統計學分析 應用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗或確切概率法，趨勢變化分析采用χ2趨勢檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 復發(fā)組和對照組治療前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較 復發(fā)組鼻咽癌患者血漿EBV-DNA陽性率為51.61%，而對照組無EBV-DNA陽性患者，復發(fā)組EBV-DNA陽性率高于對照組(P<0.05)；兩組VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 復發(fā)組和對照組的治療前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較

注：*采用確切概率法。

2.2 不同復發(fā)類型鼻咽癌患者治療前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較 不同復發(fā)類型其EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 不同復發(fā)類型鼻咽癌患者EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較

2.3 復發(fā)鼻咽癌患者治療前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA與臨床分期的關系 在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期患者中，治療前EBV-DNA陽性率隨復發(fā)鼻咽癌臨床分期增高而增高(P<0.05)；不同臨床分期患者VCA-IgA及EA-IgA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA陽性率比較

注：*采用χ2趨勢檢驗。

2.4 不同治療方案組治療前后EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA的動態(tài)變化 治療前，手術組與放化療組EBV-DNA、VCA-IgA、EA-IgA陽性率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表5。手術組38例EBV-DNA陽性患者中，術后轉陰35例(92.11%)，放化療組26例EBV-DNA陽性患者中，放化療后轉陰18例(69.23%)，手術組EBV-DNA轉陰率高于放化療組(χ2=4.182，P<0.05)。治療結束時，手術組EBV-DNA陽性率低于放化療組(P<0.05)，但兩組VCA-IgA及EA-IgA陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表5 不同治療方案組治療前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA比較

表6 不同治療方案組治療后EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA比較

3 討 論

鼻咽癌是我國廣西和廣東地區(qū)常見的惡性腫瘤。鼻咽癌的病因學研究表明，EB病毒可導致鼻咽部上皮細胞永生化，從而進一步使其發(fā)生惡變[6]。在鼻咽癌高發(fā)區(qū)，大部分患者的病理類型為未分化非角化性癌(WHO Ⅲ型)，其與EB病毒感染有關，約70%的患者EB病毒抗體陽性[7]。目前有關鼻咽癌的臨床診斷研究較多且較肯定的EBV抗原主要有VCA和EA。EBV VCA-IgA抗體可出現于鼻咽癌確診前，持續(xù)監(jiān)測VCA-IgA有助于發(fā)現早期鼻咽癌[8]。有研究證實，EA-IgA的出現為機體EBV復制的標志之一，在鼻咽癌中有著較高的特異性[9]。在初治鼻咽癌中，EBV-DNA與腫瘤的分期、體積以及預后均有關。已有研究證實，首診鼻咽癌治療結束時通常檢測不到EBV-DNA，如患者血液中檢測到EBV-DNA，通常提示殘留或復發(fā)[10]。本研究結果也顯示，鼻咽癌復發(fā)患者的EBV-DNA陽性率為51.61%，而無復發(fā)的鼻咽癌放射性顱底骨壞死患者中無1例檢出EBV-DNA。本研究中，無復發(fā)的鼻咽癌顱底骨壞死患者EA-IgA陽性率為30.00%，而VCA-IgA則高達56.67%，提示鼻咽癌治療后部分無復發(fā)和轉移患者仍可檢測到VCA-IgA和EA-IgA，因此尚不能得出監(jiān)測VCA-IgA和EA-IgA有助于發(fā)現復發(fā)鼻咽癌的結論。但有學者發(fā)現持續(xù)高水平的抗體水平被認為與復發(fā)和轉移有關[11]，而本研究僅從VCA-IgA和EA-IgA的陽性率進行比較，依據既往學者的研究結果，我們建議對患者的抗體水平進行動態(tài)觀察，推薦聯合EBV-DNA與VCA-IgA及EA-IgA檢測，可能有助于提高復發(fā)鼻咽癌的檢出率。

本文結果顯示，治療前EBV-DNA陽性率隨復發(fā)鼻咽癌臨床分期增高而增高(P<0.05)，而其他學者也認為EBV-DNA水平與患者臨床分期有關[12]，這均提示檢測EBV-DNA可能有助于臨床分期的判斷。有學者發(fā)現頸部復發(fā)的鼻咽癌患者的EBV-DNA載量水平高于局部復發(fā)患者[13]，認為這與頸部復發(fā)灶其腫瘤負荷大于局部復發(fā)灶有關。而目前鮮有有關局部和頸部均復發(fā)的鼻咽癌患者EBV-DNA水平的研究報道，這可能與這類疾病發(fā)生率較低有關。本研究結果顯示，局部和頸部均復發(fā)患者EBV-DNA陽性率與頸部復發(fā)患者相當，并均高于局部復發(fā)，但3者差異無統計學意義(P>0.05)。由于臨床分期由局部分期、頸部分期以及遠處分期構成，本研究雖然收集了3類復發(fā)患者，但后兩者例數偏少，因此目前尚不能得出頸部復發(fā)患者其EBV-DNA陽性率高于局部復發(fā)患者。

由于二程放療患者對放射線抗拒，目前通常認為復發(fā)患者首選手術治療，患者采用手術為主的綜合治療其預后優(yōu)于采用非手術治療[3]。對于可切除病灶而言，手術的優(yōu)點在于一次性完全消除所見腫瘤。有研究表明血液中的EBV主要來源于腫瘤細胞[10，14]。通常認為血漿中EBV水平與腫瘤細胞產生量和血液循環(huán)清除率有關，手術切除腫瘤后機體EBV-DNA水平迅速下降，中位清除時間為139 min[15]。有學者發(fā)現，治療前EBV-DNA高水平的患者預后差[5]，但另有學者認為EBV-DNA的清除率才是預后的獨立危險因素[14]。本研究中，治療前手術組和放化療組EBV-DNA陽性率無差異(P>0.05)，治療后，手術組EBV-DNA轉陰率高于放化療組(P<0.05)，且手術組EBV-DNA陽性率明顯低于放化療組(P<0.05)。此外，在本研究中，手術組不僅納入了早、中期復發(fā)鼻咽癌患者，還包括了22例Ⅳ期復發(fā)鼻咽癌患者。以往認為T3和rN3手術難于完全切除，最近中山大學腫瘤防治中心及我們的前期研究結果均表明上述患者仍可手術治療[16-17]。這進一步提示手術治療較放化療更有助于清除機體的EBV，減少EBV再激活的概率，推斷這可能是其療效優(yōu)于常規(guī)放化療的原因之一。至于EBV-DNA可否為影響預后的獨立危險因素，則有待進一步生存分析研究以證實。

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Expression of Epstein-Barr virus DNA and antibody in patients with recurrent nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance

WENGJing-jin1,2,SIYong-feng1,DENGZhuo-xia1,QINYang-da1,WEIJia-zhang1,NINGLe-ping3,LUJin-long1,JIANGHe1,HANXing1

(1DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckOncology&InstituteofNasopharyngealCarcinomaResearch,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China;2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;3DepartmentofLaboratory,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the expressions of Epstein-Barr virus(EBV)-DNA,viral capsid antigen-IgA(VCA-IgA) and early antigen-IgA (EA-IgA) in patients with recurrent nasopharyngeal carcinoma(NPC) before and after treatment,and its clinical significance.Methods A total of 124 patients with recurrent NPC were enrolled as recurrent group,including 77 cases treated with nasal endoscopic surgery or nasal endoscopic surgery combined with chemoradiotherapy(surgery group) and 47 cases treated with radiotherapy or chemotherapy(radiochemotherapy group).And 30 non-recurrent NPC patients with skull base osteoradionecrosis(ORN) after radiotherapy were enrolled as control group.Before and after treatment,the positive expressions of serum VCA-IgA,EA-IgA and EBV-DNA were detected.Results Before treatment,the positive rates of EBV-DNA in the recurrent group and control group were 51.61% and 0 respectively,and there were no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA between the two groups(P>0.05).No significant differences in the positive rates of EBV-DNA,VCA-IgA and EA-IgA were observed among the NPC patients with local recurrence,neck recurrence and local and neck recurrence before treatment(P>0.05).Among the recurrent NPC patients with stage Ⅰ,stage Ⅱ,stage Ⅲ and stage Ⅳ,the positive rate of EBV-DNA increased with the increase of clinical staging(P<0.05),but no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA were observed(P>0.05).Before treatment,there were no statistical differences in the positive rates of EBV-DNA,VCA-IgA and EA-IgA between the surgery group and the chemoradiotherapy group(P>0.05).After treatment,the seroconversion rate of EBV-DNA was higher and the positive rate of EBV-DNA was lower in the surgery group compared to the chemoradiotherapy group(P<0.05),but there were no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA between the two groups(P>0.05).Conclusion The detection of EBV-DNA may be helpful for assessing the recurrence and staging of NPC,and surgical treatment may be helpful for the removal of EBV.But VCA-IgA and EA-IgA remain detectable in NPC patients with ORN after radiotherapy,therefore,it is suggested that dynamic observation on the levels of antibodies should be performed among patients. 【Key words】 Nasopharyngeal tumor,Epstein-Barr virus,DNA,Viral capsid antigen-IgA,Early antigen-IgA,Surgery,Radiotherapy,Chemotherapy

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科攻1355005-3-9)；廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2013402)

翁敬錦(1983～)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：鼻咽癌的基礎和臨床研究。

司勇鋒(1957～)，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：鼻咽癌的基礎和臨床研究，E-mail：syfklxf@126.com。

R 739.63

A

0253-4304(2016)10-1355-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.05

2016-04-21

2016-07-16)