智楠楠,宗 凱,楊捷琳,姚 劍,*,魏兆軍

(1.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心,安徽合肥 230032;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135;3.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

Illumina Miseq平臺深度測定酸奶中微生物多樣性

智楠楠1,3,宗 凱1,楊捷琳2,姚 劍1,*,魏兆軍3,*

(1.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心,安徽合肥 230032;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135;3.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

目的:建立Illumina Miseq深度測序篩查酸奶中微生物的方法,分析酸奶中微生物的多樣性。方法:以9種酸奶樣品為研究對象,提取酸奶中細(xì)菌基因組DNA,應(yīng)用高通量測序技術(shù)測定細(xì)菌的 16s rDNA v1-v3 變異區(qū)序列,得到9種樣品中微生物群體分布和豐度、以及不同樣品間的菌種差異與進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果:酸奶中微生物主要為厚壁菌門(Firmicutes),占據(jù)99.6%之高,其中厚壁菌門主要以鏈球菌屬(Streptococcus、87.1%)、乳桿菌屬(Lactobacillus、10.3%)、乳球菌屬(Lactococcus、0.3%)組成,9種酸奶中有3種同時含有鏈球菌屬和乳桿菌屬,其余6種樣品中鏈球菌屬幾乎占據(jù)全部(>97%)。結(jié)論:Illumina Miseq 深度測序技術(shù)可快速精確深入掌握酸奶中微生物多樣性,結(jié)果對比顯示不同酸奶菌種同質(zhì)化程度高,其中鏈球菌屬占絕對優(yōu)勢,同時發(fā)現(xiàn)部分酸奶標(biāo)簽標(biāo)示不符。

Illumina Miseq,酸奶,微生物,多樣性

乳酸菌(lactic acid becteria)是一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌添加到牛奶或羊奶中可發(fā)酵制得酸奶,具有改善腹瀉、改善人體腸道菌群平衡、提高營養(yǎng)物質(zhì)生物利用度、增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗癌的獨(dú)特功能[2-6]。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)目前市場上銷售的眾多酸奶中,在乳酸菌的標(biāo)示上問題較多[7],存在食品安全隱患,故對此類產(chǎn)品進(jìn)行菌群鑒別尤為重要。

表1 樣品及產(chǎn)地

鑒別酸奶乳酸菌的傳統(tǒng)方法是梯度稀釋平板培養(yǎng),觀察菌落形態(tài)、革蘭氏染色、KOH實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),測定氣體的形成等理化方法[8],但由于微生物的多樣性和復(fù)雜性,且有些具有不可培養(yǎng)性或培養(yǎng)后難以鑒別,故傳統(tǒng)方法無法準(zhǔn)確真實(shí)的捕捉微生物群落多樣性[9]。近年來隨著深度測序技術(shù)的發(fā)展,可從分子生物學(xué)角度出發(fā)來研究食品中的微生物群落組成,直接從樣品中提取全基因組用于Illumina Miseq 高通量深度測序,可以有效克服傳統(tǒng)方法中出現(xiàn)的問題[10-12]。

Illumina Miseq高通量深度測序技術(shù)在國外已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)、礦井、醫(yī)學(xué)、微生物等諸多領(lǐng)域,其中在醫(yī)學(xué)微生物方面主要用于對一些基質(zhì)復(fù)雜的樣本如人體腸道,皮膚表層等進(jìn)行菌群多樣性分析,以協(xié)助判斷治療由于菌群失調(diào)引起的某些疾病,取得顯著成果[13-14]。隨著此技術(shù)的推廣,近年來國內(nèi)出現(xiàn)利用此技術(shù)針對土壤、含菌空氣、植物果實(shí)、動物糞便等進(jìn)行菌群鑒別[15-19],獲得不同環(huán)境下相應(yīng)微生物的種群分布情況,測序結(jié)果精確可靠。本研究將Illumina Miseq高通量測序技術(shù)應(yīng)用于含菌食品中的微生物鑒別,旨在通過分析細(xì)菌16S rDNA的可變區(qū)序列獲得9種酸奶中微生物組成,初步探討目前市售酸奶中微生物多樣性及分布情況,為消費(fèi)者在選購酸奶方面提供理論依據(jù)及為生產(chǎn)廠家研制新型發(fā)酵酸奶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

常見的9種酸奶 采購市場,見表1;溶菌酶 上海勵瑞生物科技有限公司;蛋白酶k 上海勵瑞生物科技有限公司;TE緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;緩沖液GA 天根生化科技(北京)有限公司。

PTC-200PCR儀 美國BIO-RAD公司;Stratos冷凍高速離心機(jī)、ULT-1786-6V超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司;Illumina Miseq測序儀 美國Illumina公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型) 天根生化科技(北京)有限公司;Simplicity超純水儀 德國Merck Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品基因組DNA提取 取20 mL酸奶4000 r/min離心5 min,取全部上清12000 r/min離心10 min使菌體完全沉淀,向沉淀中加入200 μL緩沖液GA,振蕩至菌體徹底懸浮,加入溶菌酶37 ℃處理40 min,之后按提取試劑盒步驟操作進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 針對細(xì)菌16s rDNA v1-v3區(qū),選用特異性引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR條件是分別保持50 ℃ 2 min、95 ℃ 3 min,然后執(zhí)行95 ℃ 20 S、58 ℃ 30 S、72 ℃ 2 min共30個循環(huán),最后 4 ℃條件下保存。

1.2.3 Illuminna Miseq測序 將上述九種樣品的PCR產(chǎn)物送去上海昂樸生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。

2 結(jié)果分析

2.1 測序信息

本實(shí)驗(yàn)共測序樣品9個,每個樣本獲得的原始測序reads數(shù)目(raw-Reads)和去除嵌合體后每個樣本獲得的測序reads(clean-Reads)數(shù)目見表2。

表2 樣本reads分布統(tǒng)計

2.2 稀釋曲線

采用對測序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線,即稀釋性曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時,說明測序數(shù)據(jù)量合理,此時再測更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很小;反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此,通過作稀釋性曲線,可以得出樣品的測序深度情況。由圖1可知多數(shù)樣本在序列數(shù)在接近40000時,observed_species/OTU已經(jīng)接近飽和,說明再增加測序量對于發(fā)現(xiàn)新species/OTU的邊際貢獻(xiàn)很小。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 rarefaction curve analysis of nine samples注:橫坐標(biāo)為用于取樣的序列數(shù)目,縱坐標(biāo)為觀測到的speceis/OTU。

2.3 alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

可通過多項指數(shù)來評價樣品中微生物分布的alpha多樣性。其中衡量菌群豐度(Community rich-ness)的指數(shù)有:菌種豐富度指數(shù)(chao1)和觀測到的物種數(shù)(observed_species),其中chao1用來估計群落中的OTU數(shù)目。衡量菌群多樣性(Community diversity)的指數(shù)有香農(nóng)指數(shù)(shannon)和辛普森指數(shù)(simpson),其中香農(nóng)指數(shù)用于衡量群落的異質(zhì)性,辛普森指數(shù)代表隨機(jī)取樣的兩個體屬于不同種的概率,其值越大,代表樣品物種分布越均勻。由表3以四個衡量指數(shù)詳細(xì)列出了不同樣品中微生物的豐富度和多樣性分布情況,由香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)可以看出 9號樣品物種豐富度最高且物種分布最均勻。

表3 alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

表4 目層面上各樣品含菌百分比(%)

表5 屬層面上各樣品含菌百分比(%)

2.4 酸奶中微生物分布比較

所測序列片段通過物種注釋共可分為7門13綱21目62科104屬。在不同分類水平上相對豐度低于0.1%的合并為other。從門的分類水平來看主要為厚壁菌門(Firmicutes、99.6%),從綱的分類水平來看主要為芽孢桿菌綱(Bacill、99.3%)。從目的分類水平來看主要包括乳桿菌目(Lactobacillales、98.7%)、芽孢桿菌目(Bacillales、0.6%)、梭菌目(Clostridiales、0.2%)(表4)。由以上三個分類水平和alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計綜合分析可以看出市場上絕大多數(shù)酸奶中所含微生物基本都屬于厚壁門芽孢桿菌綱乳桿菌目,不同樣品間雖然物種均勻度相差較大,但相似度很高。

從屬的分類水平來看主要包括鏈球菌屬(Streptococcus、87.1%)、乳桿菌屬(Lactobacillus、10.3%)、乳酸乳球菌屬(Lactococcus、0.3%)、厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus、0.3%)(表5)。

另由表6可以看出,鏈球菌屬(Streptococcus)在每個樣品中都占絕對菌群優(yōu)勢,乳桿菌屬(Lactobacillus)除在7號、8號、9號樣品中分別占15.8%、33.0%、38.8%外,在其余六種樣品中含量極低。對于同一生產(chǎn)廠家的兩種不同產(chǎn)品3號和6號,所含菌種分布情況極為相似。另外與標(biāo)示菌種對比可以看出,部分產(chǎn)品標(biāo)有雙歧桿菌但未檢出,部分產(chǎn)品檢出未標(biāo)示的菌種,由此看出酸奶產(chǎn)品在標(biāo)簽問題上存在不規(guī)范現(xiàn)象。

表6 九種樣品中標(biāo)示菌種與檢測結(jié)果比較

2.5 物種分類學(xué)系統(tǒng)組成樹和豐度分布曲線分析

本實(shí)驗(yàn)在前述分類學(xué)分析中,已經(jīng)得到了每個OTU的豐度和對應(yīng)的分類學(xué)信息,然后將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中,可以從整個分類系統(tǒng)上全面了解九種樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異,如圖2所示分支為最為優(yōu)勢的為硬壁菌門(Firmicutes)分支中的鏈球菌屬(Streptococcus),圖中色柱的高低代表該樣品在該處豐度的高低。同時由豐度分布曲線(圖3)可以看出樣品9物種的組成最豐富且均勻程度最高。

圖2 各樣品物種分類學(xué)系統(tǒng)組成樹Fig.2 The taxonomic system Composition tree of each sample

圖3 豐度分布曲線Fig.3 Rank-Abundance curve

3 討論

Illumina Miseq測序技術(shù)針對細(xì)菌16S rDNA可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測序并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,生成操作分類單元OTU,然后對微生物進(jìn)行分類學(xué)分析以掌握其多樣性及分布情況,使人們對復(fù)雜環(huán)境中微生物的認(rèn)識由物種水平上升到基因?qū)用?這一技術(shù)的出現(xiàn)解決了大多數(shù)微生物的不可培養(yǎng)性和基因組的多樣性問題,受到很多研究者青睞[20]。

同類研究中,焦晶凱等[19]測定干酪中最為優(yōu)勢的菌群為硬壁菌門(Firmicutes),這與本研究結(jié)果一致,楊捷琳等[7]調(diào)查發(fā)現(xiàn)益生菌制品中存在標(biāo)簽不符的問題,R Temmerman等[21]發(fā)現(xiàn)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)40%的乳制品標(biāo)簽出現(xiàn)錯誤,更值得注意的是國外一些調(diào)查研究表明,即使是從制造商處直接獲得的商業(yè)菌株,部分也會出現(xiàn)實(shí)際含菌種類與標(biāo)識不符的問題[22]。可見多數(shù)調(diào)查都顯示益生菌食品在標(biāo)簽上存在問題,因?yàn)閲鴥?nèi)相關(guān)產(chǎn)品眾多,新產(chǎn)品又層出不窮,甚至益生菌在醫(yī)藥和動物飼料行業(yè)也已廣泛應(yīng)用,故為保證食品藥品的安全性,未來全面對益生菌產(chǎn)品中所含微生物展開全面深度調(diào)查尤為重要。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用Illumina Miseq平臺對九個酸奶樣品進(jìn)行基因組測序,共得到微生物有效序列582573條,通過物種注釋得到7門13綱21目62科104屬,揭示了常見市售酸奶中微生物的群落結(jié)構(gòu)、豐度差異和進(jìn)化關(guān)系。針對不同酸奶所含菌種相似度非常高而標(biāo)簽顯示菌種各有不同的問題,也可能是添加的其它菌種在酸奶發(fā)酵、儲藏過程中由于環(huán)境相對苛刻不易存活,針對這一問題未來應(yīng)在生產(chǎn)時多注重溫度控制或添加一些利于乳酸菌生長的物質(zhì),以保證乳酸菌的活性及多樣化。與此同時,新型發(fā)酵菌劑的研究也至關(guān)重要。

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Microbial diversity of yogurt depth detected by Illumina Miseq platform

ZHI Nan-nan1,3,ZONG Kai1,YANG Jie-lin2,YAO Jian1,*,WEI Zhao-jun3,*

(1.Technology center of Anhui Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Hefei 230032,China; 2.Shanghai Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China; 3.School of food science and Engineering,HeFei University of Technology,Hefei 230009,China)

Establishing a method based on Illumina Miseq deep sequencing to analyze the microbial diversity of yogurt. Took 9 kinds of yogurt samples as the research objects and extracted the whole genome of bacteria of yogurt. The V1-V3 variation region of 16S rDNA were detected by High throughput sequencing technology to obtain the distribution and abundance of microbial community in 9 samples as well as the species difference and evolution relationship of bacteria among these samples. The results showed that the main microbes of the yogurt were Firmicutes(99.6%)which mainly composed by Streptococcus(87.1%),Lactobacillus(10.3%),and Lactococcus(0.3%).There were 3 kinds of yogurt containing Streptococcus and Lactobacillus with a high number,Streptococcus(97%)accounted for almost all in the other six samples.Using Illumina Miseq deep sequencing technology can master the microbial diversity of yogurt quickly and accurately. The results showed that the bacteria of yogurt were highly similar and streptococcus took a dominant position. At the same time,it was found that some yogurt labels didn’t match the analysis results well.

Illumina Miseq;yogurt;microorganism;diversity

2016-05-09

智楠楠(1993-)，女，碩士，研究方向：食品微生物，E-mail：zhinannan74@163.com。

*通訊作者:姚劍(1971-)，女，博士，研究方向：食品微生物，E-mail：msyao@126.com。 魏兆軍(1970-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品加工技術(shù)，E-mail：weizhaojun@163.com。

長三角地區(qū)功能性微生態(tài)制劑關(guān)鍵檢測技術(shù)及溯源體系的開發(fā)應(yīng)用(1503062007);長三角地區(qū)微生態(tài)制劑關(guān)鍵檢測技術(shù)及溯源體系的開發(fā)應(yīng)用(14495810200)。

TS252.4

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000