張 森,鄧 艷,黃燕瓊,何淑華,戴 金,趙尚志,石 磊,柏建山,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510470;3.暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

恒溫實(shí)時熒光法快速檢測簡單異尖線蟲方法的建立

張 森1,2,鄧 艷2,黃燕瓊2,何淑華2,戴 金2,趙尚志2,石 磊3,柏建山2,*

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.廣州機(jī)場出入境檢驗(yàn)檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510470;3.暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

為了快速鑒定簡單異尖線蟲,本研究建立了一套檢測簡單異尖線蟲DNA的恒溫實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,根據(jù)LAMP方法原理,針對簡單異尖線蟲ITS2區(qū)域設(shè)計(jì)引物特異性識別靶標(biāo)基因。進(jìn)行了特異性、靈敏度、重復(fù)性和實(shí)際樣品的測試,并與傳統(tǒng)的PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明,該方法能夠特異性擴(kuò)增簡單異尖線蟲DNA,對含有簡單異尖線蟲ITS2目的基因片段的質(zhì)粒DNA檢測限為1 fg/μL,靈敏度比傳統(tǒng)的PCR方法高100倍,重復(fù)性良好,對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,與傳統(tǒng)的PCR測序方法結(jié)果相符。本研究建立的恒溫實(shí)時熒光快速檢測方法適用于特異性檢測簡單異尖線蟲。

恒溫實(shí)時熒光法,簡單異尖線蟲,快速檢測

異尖線蟲病是人感染異尖線蟲的第三期幼蟲引起的疾病,主要是由于食入生的或未熟的海魚,如壽司、生魚片等[1]。感染的異尖線蟲可以鉆入消化道,或移行到其它組織,從而引起人的急腹癥癥狀:如劇烈腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉等[1-4],還能導(dǎo)致人的過敏反應(yīng)[5-7]。至今,全世界已有超過3萬異尖線蟲病例[3],已報道的引起人異尖線蟲病的主要有6種[8-9],其中簡單異尖線蟲(Anisakis simplex)是引起人體異尖線蟲病的最主要病原[3-4],它廣泛存在于世界的各個地區(qū)[10-11],嚴(yán)重威脅了人類的健康。因此建立簡單異尖線蟲快速準(zhǔn)確的檢測方法至關(guān)重要。

表1 恒溫實(shí)時熒光法引物序列

目前,異尖線蟲幼蟲的鑒定主要通過形態(tài)觀察,并結(jié)合以PCR為基礎(chǔ)的測序方法確定蟲種[12],它提供了一種鑒定蟲種的方法標(biāo)準(zhǔn),但整個過程耗時耗力,還需要有笨重昂貴的儀器,很難再基層推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種體外的基因擴(kuò)增技術(shù)[13]。用4條特異性引物識別靶基因的6個區(qū)域,并加入兩條環(huán)引物(LF、LB)加速反應(yīng),利用一種具有鏈置換功能的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件(60～65 ℃)反應(yīng)30～60 min,即可完成反應(yīng)。已有的簡單異尖線蟲的LAMP檢測方法是利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)[14],觀察有無梯狀電泳條帶做出判斷,這種方法容易造成LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染。本研究將LAMP技術(shù)與實(shí)時熒光技術(shù)相結(jié)合,根據(jù)簡單異尖線蟲ITS2區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物[15],利用實(shí)時熒光技術(shù)可以將LAMP反應(yīng)可視化,進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,根據(jù)擴(kuò)增曲線判斷結(jié)果,并進(jìn)行了靈敏度、特異性和重復(fù)性驗(yàn)證。與傳統(tǒng)的LAMP技術(shù)相比,反應(yīng)時間更短,反應(yīng)的靈敏度和特異性更高,操作更為簡便,成本更加低廉,適合在基層推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

簡單異尖線蟲(Anisakissimplex)、短棘異尖線蟲(A.brevispiculata)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、典型異尖線蟲(A.typica)、Anisakisnascettii、宮脂線蟲(HysterothylaciumSpp.)、對盲囊線蟲(ContracaccumSpp.)、顎口線蟲(Gnathostomaspp.) 由廣州機(jī)場檢驗(yàn)檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在2011年至2015年進(jìn)境魚體中分離鑒定并保存;Bst DNA polymerase large fragment 美國New England Biolabs公司;甜菜堿 Betaine;MgCl2美國Sigma公司;SYBR Green I 熒光染料 Life Technologies公司;引物 上海英濰捷基貿(mào)易有限公司;DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、18-T載體克隆試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒、Tap酶、Mg2+、dNTPs、PCR10×Buffer反應(yīng)液 均購自寶生物工程(大連)有限公司。

LAMP恒溫?cái)U(kuò)增檢測儀Deaou-308C 廣州迪澳生物科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc EQ 美國BIO-RAD公司;核酸濃度測定儀ND-2000 美國NanoDrop科技有限公司;微型離心機(jī)Mini-10K 廣州迪奧生物科技有限公司;微量振蕩器 MS2 德國IKA集團(tuán);高速離心機(jī)D-78532 德國Hettich科學(xué)儀器公司;梯度PCR儀T-gradient thermoblock 德國Biometra公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟲體基因組DNA提取 將蟲體從保存液中取出,置于1.5 mL離心管中,用蒸餾水反復(fù)浸泡清洗3次,每隔2 h換水1次,使用Takara公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒,按照說明書步驟提取異尖線蟲基因組DNA,用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)檢測基因組DNA的濃度,將基因組置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從GenBank中獲得簡單異尖線蟲ITS2(AB277823)序列,根據(jù)ITS2的保守區(qū),利用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)進(jìn)行LAMP引物的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)3套引物,將設(shè)計(jì)好的引物序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列特異性比對,并利用Oligo 7.0對引物之間的二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、錯配等情況進(jìn)行分析,引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。根據(jù)引物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取最優(yōu)引物,最終使用的引物為第一組引物(見表1)。

1.2.3 引物的篩選 本研究根據(jù)簡單異尖線蟲的ITS2 rDNA設(shè)計(jì)了3套引物,進(jìn)行引物篩選實(shí)驗(yàn),選取最優(yōu)引物作為實(shí)驗(yàn)引物。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建 用LAMP引物的外引物F3、B3對簡單異尖線蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒,按照說明書步驟進(jìn)行DNA片段的回收,使用Takara公司的pMDTM 18-T Vector Cloning Kit 試劑盒,按照說明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建,使用Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒,按照說明書步驟進(jìn)行質(zhì)粒的提取。用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒DNA的濃度,將質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.5 恒溫實(shí)時熒光法反應(yīng)體系的建立 本研究采用25 μL反應(yīng)體系,8 mmol/L dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、120 mmol/L MgSO4水溶液、F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、BIP 1.6 μmol/L、LF 0.8 μmol/L、LB 0.8 μmol/L、DNA聚合酶8 U、10×SYBR Green I熒光染料 0.5 μL、待檢樣品2 μL,用超純水補(bǔ)齊到25 μL,最后在體系表面加密封油防止污染,將配制好的反應(yīng)管混勻后離心,以簡單異尖線蟲DNA為陽性對照,超純水為陰性對照,于LAMP恒溫?cái)U(kuò)增檢測儀中63 ℃反應(yīng)30 min。

結(jié)果判讀方法:若有“S”型擴(kuò)增曲線,則判斷為陽性,若無“S”型擴(kuò)增曲線,則判斷為陰性。

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn) 用建立的恒溫實(shí)時熒光法對其它寄生蟲短棘異尖線蟲(A.brevispiculata)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、典型異尖線蟲(A.typica)、anisakisnascettii、宮脂線蟲(HysterothylaciumSpp.)、對盲囊線蟲(ContracaccumSpp.)、顎口線蟲(Ggnathostomaspp.)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.7 靈敏度實(shí)驗(yàn) 將含目的基因片段的質(zhì)粒DNA以10倍的梯度稀釋到1 ng/μL、100、10、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL、100、10 ag/μL,取10 pg/μL～10 ag/μL濃度的模板進(jìn)行恒溫實(shí)時熒光法擴(kuò)增。

1.2.8 與PCR方法比較 用外引物F3、B3作為PCR引物對10 pg/μL～1 fg/μL質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,體系為25 μL:2.5 μL 10×PCR buffer,2 mmol/L Mg2+,0.8 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L F3引物,0.4 μmol/L B3引物,1.25 U Taq酶(Takara),2 μL DNA模板,用超純水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s、60 ℃退火延伸1 min,40個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳20 min。

1.2.9 實(shí)際樣品的檢測 對廣州機(jī)場檢驗(yàn)檢疫局國家水產(chǎn)品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在2011年至2015年,從37批次魚體中檢出的異尖線蟲進(jìn)行檢測,每一批次中挑取一條代表性蟲體進(jìn)行恒溫實(shí)時熒光法檢測,并與PCR檢測方法進(jìn)行比較。PCR檢測方法依據(jù)中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T7210-2011,使用上游引物390(5′-ATCCGTGTTTCAAG ACGGG-3′)和下游引物391(5′-AGCGGAGGAAAA GAAACTAA-3′)對蟲體DNA進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系參照1.2.8,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸8 min。反應(yīng)產(chǎn)物大小為800 bp左右,送測序公司測序,將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對。

2 結(jié)果與討論

2.1 恒溫實(shí)時熒光法反應(yīng)條件的確定

用3套特異性引物對簡單異尖線蟲DNA進(jìn)行恒溫實(shí)時熒光法擴(kuò)增,篩選出最優(yōu)的特異性引物。結(jié)果顯示,3套引物均能擴(kuò)增,而第一套引物擴(kuò)增曲線最標(biāo)準(zhǔn),出峰時間最短(見圖1),所以選取第一套引物作為本研究的特異性引物。

圖1 恒溫實(shí)時熒光法引物反應(yīng)效率的檢測Fig.1 Efficiency of real-time LAMP primers

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

特異性實(shí)驗(yàn)表明,對于短棘異尖線蟲(A.brevispiculata)、抹香鯨異尖線蟲(A.physeteris)、典型異尖線蟲(A.typica)、anisakisnascettii、宮脂線蟲(Hysterothylaciumspp.)、對盲囊線蟲(Contracaccumspp.)、顎口線蟲(Ggnathostomaspp.)的DNA模板,未產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線,說明沒有目的片段擴(kuò)增,對于簡單異尖線蟲DNA模板,產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線,說明目的片段能夠擴(kuò)增(見圖2),表明建立的簡單異尖線蟲的恒溫實(shí)時熒光檢測方法具有嚴(yán)格的特異性。

圖2 簡單異尖線蟲恒溫實(shí)時熒光法特異性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Assessment of specificity of the real-time LAMP assay for A. simplex

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

含目的基因片段的質(zhì)粒濃度為29 ng/μL,將其稀釋到1 ng/μL、100、10、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL、100、10 ag/μL,選取10 pg/μL～10 ag/μL質(zhì)粒模板進(jìn)行恒溫實(shí)時熒光法擴(kuò)增,其檢測限為1 fg/μL(見圖3)。用PCR方法對10 pg/μL～1 fg/μL質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增,其檢測限為100 fg/μL(見圖4),恒溫實(shí)時熒光法的靈敏度比PCR方法高出兩個數(shù)量級。表明建立的簡單異尖線蟲恒溫實(shí)時熒光檢測方法具有很高的靈敏度。

圖3 簡單異尖線蟲恒溫實(shí)時熒光法的靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.3 Assessment of sensitivity of the real-time LAMP for A. simplex注:1～5分別表示10 pg/μL、1 pg/μL、100、10、1 fg/μL濃度的質(zhì)粒。

表2 實(shí)際樣品中恒溫實(shí)時熒光法和PCR方法檢測簡單異尖線蟲的結(jié)果

圖4 簡單異尖線蟲恒溫實(shí)時熒光法與PCR方法的比較Fig.4 Comprision with conventional PCR注:M表示DNA Marker,1～5分別表示10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL濃度的質(zhì)粒,6代表空白對照。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用恒溫實(shí)時熒光法對最低檢測限1 fg/μL的質(zhì)粒模板進(jìn)行15次重復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證本研究的重復(fù)性。對1 fg/μL質(zhì)粒模板的15次平行實(shí)驗(yàn),均產(chǎn)生“S”型擴(kuò)增曲線,說明全部擴(kuò)增,且出峰時間相差不大,擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn),重復(fù)性良好,陰性對照無擴(kuò)增,假陽性率為0(見圖5)。表明建立的簡單異尖線蟲的恒溫實(shí)時熒光檢測方法具有良好的重復(fù)性。

圖5 簡單異尖線蟲恒溫實(shí)時熒光法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Fig.5 Assessment of repeatability of the real-time LAMP for A. simplex

2.5 實(shí)際樣品的檢測

用恒溫實(shí)時熒光法對37批次實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,并與PCR檢測方法進(jìn)行比較。恒溫實(shí)時熒光法檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果完全一致,假陽性率為0(見表2)。說明本研究建立的LAMP檢測方法適用于簡單異尖線蟲實(shí)際樣本的檢測。

2.5 討論

自1960年van Thiel在荷蘭發(fā)現(xiàn)并報道了異尖線蟲病例后,國際上感染并報道的異尖線蟲病例越來越多。所以異尖線蟲日益受到各界的重視,我國已將異尖線蟲列為二類禁止入境的寄生蟲。我國在2013年報道了首例異尖線蟲病病例[16]。

在所有的蟲種中,簡單異尖是最主要的致病種。為了能夠更好的檢測簡單異尖線蟲,有效控制其傳播和感染,快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法是必不可少的。LAMP方法已經(jīng)應(yīng)用于檢測食源性病原的多個領(lǐng)域,如:細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲[17-18],但在蠕蟲檢測上的應(yīng)用還很少,影響了蠕蟲病病原檢測技術(shù)的發(fā)展。以往,LAMP檢測方法的結(jié)果判定有凝膠電泳法、顯色法、濁度法。凝膠電泳法需要開蓋才能完成,可能產(chǎn)生氣溶膠污染,而造成假陽性,榮研公司也推薦不開蓋原則;顯色法是最經(jīng)濟(jì)的方法,不需要在反應(yīng)過程中收集信號,只需恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng),但顯色法需要反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入顯色液,也容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染;濁度法包括焦磷酸鎂沉淀觀察法和實(shí)時濁度法,不需要添加額外的試劑,不需要開蓋,但焦磷酸鎂沉淀觀察法存在人為判斷的主觀性,實(shí)時濁度法也因渾濁顆粒不均一和反應(yīng)液存在不透明顆粒等因素導(dǎo)致較低的靈敏度。為了克服上述方法的不足,恒溫實(shí)時熒光法不斷被發(fā)開并應(yīng)用于實(shí)際的樣品檢測中,它是一種新型的可視化方法,將LAMP技術(shù)與實(shí)時熒光檢測技術(shù)有機(jī)的結(jié)合,可以對擴(kuò)增過程進(jìn)行及時判讀,在保證高敏感性的同時,使檢測結(jié)果數(shù)據(jù)化、形象化,不同于終點(diǎn)判讀方法,可以在反應(yīng)過程中對出峰時間、擴(kuò)增曲線以及擴(kuò)增效率進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,使反應(yīng)時間更短,在一定程度上避免了假陽性的存在。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)簡單異尖線蟲的ITS2特異性基因,建立了簡單異尖線蟲的恒溫實(shí)時熒光檢測法,該方法具有靈敏度高、特異性好、方便和快速等優(yōu)點(diǎn),靈敏度可達(dá)1 fg/μL,反應(yīng)時間短,30 min內(nèi)便可完成反應(yīng),而傳統(tǒng)的PCR方法至少需要2～3 h。該檢測方法具有廣泛的實(shí)用性和良好的應(yīng)用前景,特別適合于在基層進(jìn)行推廣和應(yīng)用。

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A real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification method for the detection ofAnisakissimplex

ZHANG Sen1,2,DENG Yan2,HUANG Yan-qiong2,HE Shu-hua2,DAI Jin2,ZHAO Shang-zhi2,SHI Lei3,BAI Jian-shan2,*

(1.School of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.State key Testing Laboratory of Aquatic Products,Guangzhou Airport Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510470,China; 3.Research Institute of Food Safety and Nutrition,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

We established a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification(LAMP)approach for the sensitive,rapid and reliable detection ofAnisakissimplex. The method was based on LAMP reaction. Three sets of the specificity and sensitivity of primers were designed from ITS2 rDNA. The specificity and sensitivity were tested. Specific amplification products were obtained withA.simplex,while no amplification products were detected with DNA of related parasites,demonstrating the specificity of the assay. The capable detection of plasmid DNA in the method was 1 fg/μL. The real-time fluorescence LAMP assay was proved to be 100 times more sensitive than a conventional polymerase chain reaction for detection ofA.simplex. 37samples testing by the real-time fluorescence LAMP method and PCR method showed that,the result of the LAMP method was the same with PCR method. The established real-time fluorescence LAMP method was suitable for specifically detectingA.simplex.

real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification;Anisakissimplex;rapid detection

2016-03-11

張森(1988-),男,在讀研究生,主要從事水生動物病原檢測,E-mail:525922989@qq.com。

*通訊作者:柏建山(1976-),男,高級獸醫(yī)師,主要從事水生動物病原檢測,食品微生物病原檢測,E-mail:bjslinyi@ sina.com.cn。

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK055);廣東省科技項(xiàng)目(2014A040401063)。

TS207.4

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000