劉祥琴，馬勛泰，杜 瓊，晏 寧

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610071;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 401331)

家族性偏癱性偏頭痛CACNA1A基因新突變的研究*

劉祥琴1，馬勛泰2，杜 瓊1，晏 寧3△

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610071;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 401331)

目的 探索家族性偏癱性偏頭痛(FHM)與CACNA1A基因突變的關(guān)系。方法 通過(guò)提取一家系患者和健康人及1 000例健康對(duì)照組DNA進(jìn)行CACNA1A基因測(cè)序研究，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 位于CACNA1A基因的8號(hào)外顯子的新突變位點(diǎn)(c.1168A>G)導(dǎo)致天門(mén)冬酰胺替換為天冬氨酸(N390D)。結(jié)論 CACNA1A基因突變N390D是新發(fā)現(xiàn)的引起FHM的致病突變因素。

先兆偏頭痛；基因,CACNA1A;點(diǎn)突變

偏頭痛是一種復(fù)雜的慢性血管紊亂性疾病，以發(fā)作性搏動(dòng)性頭疼為特征，表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)頭部跳痛，伴有惡心、嘔吐等植物神經(jīng)癥狀，是與心理、社會(huì)因素相關(guān)的常見(jiàn)心身疾病。家族性偏癱性偏頭痛(familial hemiplegic migraine,FHM)是一種比較少見(jiàn)的帶有先兆性的較嚴(yán)重疾病，它常呈單基因常染色體顯性遺傳。目前，已報(bào)道有CACNA1A、ATP1A2、SCN1A 3種基因突變與該病有關(guān)。CACNA1A 基因，定位于19p13,編碼P/Q 型鈣離子通道的1A亞單位,全世界范圍內(nèi)找到了18 個(gè)不同的錯(cuò)義突變,其中T666M 與R1347Q 突變是最常見(jiàn)的兩種突變[1-4]，由于CACNA1A基因是目前公認(rèn)的與FHM尤其是與伴小腦功能紊亂癥狀相關(guān)的致病基因[1,5-7]，本研究就在一家系樣本中針對(duì)該基因進(jìn)行研究，對(duì)CACNA1A基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)的新突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究家系來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集的一個(gè)FHM家系，該家系有3代4人患病，目前有3例患者存活，家系圖見(jiàn)圖1，所有病患表現(xiàn)有偶發(fā)的偏癱性偏頭痛發(fā)作，腦脊液淋巴細(xì)胞增多，除了先證者女兒(Ⅲ∶1)外，均有眼球震顫等小腦功能紊亂的表現(xiàn)。所有患者腦電圖未見(jiàn)有明顯異常，先證者的(Ⅱ∶1)還有共濟(jì)失調(diào)的表現(xiàn)，MRI檢查提示有小腦萎縮，其余患者未見(jiàn)小腦影像學(xué)改變。診斷符合2004年國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)頭痛分類(lèi)委員會(huì)制訂的《偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)》，并排除其他類(lèi)型頭痛、脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)、癲癇等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。健康對(duì)照組樣本采集于2015年1月至2015年6月，在四川省人民醫(yī)院健康體檢中心隨機(jī)選擇健康體檢者1 000例，年齡10～85歲，平均(46.5±12.1)歲，排除偏頭痛、偏癱及脊髓小腦型共濟(jì)失調(diào)、癲癇等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及這些神經(jīng)系統(tǒng)家族史。采集標(biāo)本前實(shí)驗(yàn)參與者均簽署了知情同意書(shū)，本研究通過(guò)四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 抽取家系中偏頭痛患者和健康對(duì)照組靜脈血5 mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，采用酚氯仿抽提乙醇沉淀法提取基因組DNA。

1.2.2 CACNA1A基因測(cè)序 CACNA1A基因包含47個(gè)外顯子，其cDNA包含2 506個(gè)氨基酸，參考Ophoff RA的文獻(xiàn)結(jié)合引物設(shè)計(jì)軟件Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)，作者設(shè)計(jì)了43對(duì)引物[1]，采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序試劑為BigDye Terminator Cycle 測(cè)序試劑盒(Applied Biosystems)，按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，使用測(cè)序儀為ABI 3130xl，序列分析軟件采用Chromas1.62，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAman 8.0軟件進(jìn)行比對(duì)。

1.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)SIFT HOME(http://sift.jcvi.org/)和NCBI的HomoloGene進(jìn)行突變的初步生物信息學(xué)分析，序列的比對(duì)應(yīng)用DNAman 8.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序結(jié)果 在3位偏頭痛患者CACNA1A基因測(cè)序結(jié)果中均發(fā)現(xiàn)一新突變，該基因8號(hào)外顯子第1 168核苷酸A突變?yōu)镚雜合雙峰(c.1168A>G)，在1 000例健康對(duì)照組人群及家系中健康成員則未發(fā)現(xiàn)此突變，見(jiàn)圖2。

圖1 FHM家系圖

第8號(hào)外顯子第1 168位核苷酸顯示患者A/G雜合雙峰(箭頭所指)，表示在該位點(diǎn)A突變?yōu)镚。

圖2 CACNA1A基因突變位點(diǎn)DNA序列圖

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果 該CACNA1A基因新突變導(dǎo)致第390位氨基酸密碼子由AAT替換為GAT，編碼氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼酦390D。該突變位置氨基酸在各物種中相當(dāng)保守，通過(guò)9個(gè)物種比對(duì)未見(jiàn)該位點(diǎn)有變化。該突變經(jīng)SIFT軟件分析預(yù)測(cè)為“DAMAGE”突變(SIFT Score=0.02分)，見(jiàn)圖3。

結(jié)果顯示該段蛋白及突變點(diǎn)(紅色框內(nèi))氨基酸序列非常保守，突變可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

圖3 9個(gè)物種氨基酸序列比對(duì)

3 討 論

本研究在一個(gè)偏頭痛家系中發(fā)現(xiàn)由CACNA1A基因一個(gè)錯(cuò)義突變(c.1168A>G，N390D)引起的一系列偏癱性偏頭痛臨床表現(xiàn)，包括偶發(fā)的偏癱性偏頭痛發(fā)作，遲發(fā)性的小腦功能紊亂，輕度的腦脊液細(xì)胞增多。值得注意的是，雖然患者發(fā)生的偏癱次數(shù)不多，但這也符合《偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)ICHD-Ⅱ》對(duì)偏癱性偏頭痛的診斷[8]。

在此家系中，本研究認(rèn)為CACNA1A基因氨基酸的390位天門(mén)冬酰胺錯(cuò)義突變?yōu)樘扉T(mén)冬氨酸,導(dǎo)致偏癱性偏頭痛，主要有以下證據(jù)：(1)CACNA1A基因編碼形成一個(gè)由4個(gè)同源亞基組成的跨膜域這是已知功能的重要通道的電壓傳感器[6]，CACNA1A基因是目前公認(rèn)報(bào)道的與FHM尤其是伴小腦功能紊亂癥狀的致病基因[1,5-7]。(2)第390位天門(mén)冬酰胺、天門(mén)冬氨酸突變?cè)诒狙芯考蚁抵斜憩F(xiàn)出明顯的遺傳共分離現(xiàn)象；(3)該突變的區(qū)域位于CACNA1A基因的相當(dāng)穩(wěn)定的區(qū)域，從NCBI Gene Bank中查詢比對(duì)的9種由高級(jí)到低級(jí)的物種該區(qū)域的氨基酸都是一樣的，說(shuō)明該段序列在進(jìn)化上是相當(dāng)保守穩(wěn)定的，該突變勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[1]， 在本突變附近的第388、389位已有錯(cuò)義突變導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)的文獻(xiàn)報(bào)道[9-10]。(4)該突變區(qū)域位于同源結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間，負(fù)責(zé)與β亞基結(jié)合。(5)在1 000個(gè)健康人未發(fā)現(xiàn)有CACNA1A基因的此種氨基酸突變，故認(rèn)為此種突變有可能導(dǎo)致FHM的發(fā)生。

電壓依賴(lài)的鈣通道調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)入興奮的細(xì)胞,參與激素或神經(jīng)遞質(zhì)釋放、肌肉收縮和基因表達(dá)等各種鈣依賴(lài)過(guò)程。鈣通道復(fù)合體由α1、β、α2、δ,γ亞基組成，其中起主要作用的是α1亞基，其余亞基主要起調(diào)節(jié)作用。各種不同類(lèi)型的鈣通道主要是α1亞基不同(包括α1A、α1B、α1C、α1D、α1E和α1S)，CACNA1A基因編碼電壓門(mén)控鈣離子通道上的孔道形成蛋白α1A亞基。CACNA1A表達(dá)在與偏頭痛相關(guān)的大腦皮質(zhì)、三叉神經(jīng)節(jié)及腦干神經(jīng)核等神經(jīng)組織。這個(gè)基因的突變與FHM和共濟(jì)失調(diào)有關(guān)。神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、神經(jīng)元的興奮都由位于神經(jīng)元、突觸前膜及樹(shù)突通道鈣離子通過(guò)電壓門(mén)控鈣離子通道進(jìn)入突觸后膜而調(diào)節(jié)。

在本研究中，該突變區(qū)域位于同源結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ之間，該區(qū)域負(fù)責(zé)與β亞基結(jié)合，推測(cè)該突變可能會(huì)導(dǎo)致α1A亞基與β亞基結(jié)合的調(diào)節(jié)異常，而引起CACNA1A蛋白這一P/Q型離子流的密度和門(mén)控特性的改變，致使鈣通道的功能改變，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的過(guò)度興奮及持續(xù)去極化，繼發(fā)皮層擴(kuò)布性抑制(cortical spreading depression，CSD)的闊值降低，引發(fā)偏頭痛[11-12]。該家系病患發(fā)生的遲發(fā)性進(jìn)展性的小腦綜合征也是偏癱性偏頭痛的臨床表現(xiàn)之一，據(jù)報(bào)道約有40%～50%的CACNA1A突變患者有小腦綜合征表現(xiàn)[7]。

綜上所述，本研究在一個(gè)偏頭痛家系中發(fā)現(xiàn)CACNA1A基因一個(gè)新的錯(cuò)義突變(N390D)，該突變可導(dǎo)致FHM，可能還與小腦綜合征的發(fā)生有關(guān)。該研究的發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)大了偏頭痛致病基因突變譜，而且更加肯定了CACNA1A基因突變會(huì)導(dǎo)致FHM、小腦功能紊亂，共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。但該突變導(dǎo)致該疾病的發(fā)生機(jī)制還有待通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建進(jìn)行下一步的研究。

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Study on novel mutation of CACNA1A gene in familial hemiplegic migraine*

LiuXiangqin1,MaXuntai2,DuQiong1,YanNing3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610071,China;2.DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.DepartmentofNeurology,UniversityTownHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

Objective To investigate the relationship between familial hemiplegic migraine (FHM) with the mutation of CACNA1A gene.Methods Total genomic DNA of a family affected members and 1 000 normal controls was extracted for conducting the CACNA1A gene sequencing research and the bioinformatics analysis.Results The novel mutation site c.1168A>G of exon located in CACNA1A gene led to Asn to be replaced with Asp (N390D).Conclusion The mutation(N390D) of CACNA1A gene is a newly found novel pathogenic mutation lead to familial hemiplegic migraine.

migraine with aura; genes,CACNA1A; point mutation

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(cstc2012jjA10093)；四川省人民醫(yī)院青年基金項(xiàng)目[省醫(yī)行(2014)94號(hào)]。

劉祥琴(1978-)，主管技師，碩士，主要從事分子遺傳學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:852188765@qq.com。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.016

R277.7

A

1671-8348(2016)10-1348-02

2015-12-08

2016-01-26)