胡雪飛，程 勇，文 星，王永飛，王 強(qiáng)，許喜生△

(1.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院燒傷整形科,湖南郴州 423000； 2.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院燒傷整形科 511500)

電場(chǎng)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移行為及形態(tài)的影響

胡雪飛1，程 勇2，文 星1，王永飛1，王 強(qiáng)2，許喜生1△

(1.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院燒傷整形科,湖南郴州 423000； 2.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院燒傷整形科 511500)

目的 探討外加電場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)遷移行為及形態(tài)的影響。方法 將體外培養(yǎng)的3～4代EPCs分別用場(chǎng)強(qiáng)為0 mV/mm(Ⅰ組)、100 mV/mm(Ⅱ組)、200 mV/mm(Ⅲ組)和300 mV/mm(Ⅳ組)的直流電場(chǎng)加以持續(xù)刺激3 h，活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞遷移軌跡及形態(tài)變化，分析外加電場(chǎng)對(duì)EPCs遷移行為及形態(tài)的影響。結(jié)果 Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ組細(xì)胞向陽(yáng)極定向遷移，Ⅰ組細(xì)胞顯示隨機(jī)運(yùn)動(dòng)。電刺激3 h時(shí)，細(xì)胞軌跡遷移速率(Vt)、位移速率(Vd)、電場(chǎng)方向遷移速率(Vx)分別為：Ⅳ組[(98.86±6.00)、(63.78±2.81)、(63.15±2.88)μm/h]、Ⅲ組[(88.06±8.83)、(35.90±1.22)、(34.20±1.57)μm/h]和Ⅱ組[(42.28±2.25)、(13.29±0.37)、(12.39±0.51)μm/h]，均顯著高于Ⅰ組的[(37.39±2.42)、(6.99±0.31)、(4.62±0.40)μm/h],均P<0.01,且Ⅲ組細(xì)胞Vt、Vd、Vx均顯著高于Ⅱ組、Ⅰ組(均P<0.01)。EPCs在電場(chǎng)刺激下發(fā)生明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞外觀變得狹長(zhǎng)，逐漸與電場(chǎng)方向平行排列。結(jié)論 外加直流電場(chǎng)可誘導(dǎo)EPCs向陽(yáng)極遷移并加快其遷移速率，且對(duì)EPCs的形態(tài)有明顯影響。

電場(chǎng)；內(nèi)皮祖細(xì)胞；趨電性；細(xì)胞遷移

內(nèi)源性生物電場(chǎng)(endogenous electric fields)對(duì)機(jī)體損傷愈合及功能恢復(fù)具有重要作用，使用藥物或外加極性相反的電場(chǎng)消除內(nèi)源性電場(chǎng)可阻礙上述進(jìn)程，而增強(qiáng)該內(nèi)源性電場(chǎng)可加快病變部位愈合速度和改善愈合質(zhì)量[1-2]。血管修復(fù)作為損傷修復(fù)的重要分支，探尋促進(jìn)血管修復(fù)的方法已被眾多科研工作者關(guān)注。已有研究表明，電刺激通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，對(duì)血管修復(fù)起著重要的積極作用[3]。然而，內(nèi)皮細(xì)胞作為終末分化類型的細(xì)胞，其對(duì)血管重建的作用十分有限[4]，這也限制了電刺激在血管修復(fù)方面的研究。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可在缺血、缺氧等誘導(dǎo)下向病損部位歸巢[5]，對(duì)于血管修復(fù)與形成的實(shí)現(xiàn)更有應(yīng)用價(jià)值。指導(dǎo)EPCs定向遷移對(duì)于促進(jìn)血管損傷修復(fù)與創(chuàng)面愈合具有重要臨床意義，因此，本研究觀察了外加電場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)的EPCs生物學(xué)行為的影響,為電刺激促進(jìn)血管修復(fù)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器來(lái)源 清潔級(jí)同種系雄性C57B/6J小鼠，6～8周齡，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(Gibco公司，澳大利亞)，小鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液(密度1.090，天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，中?guó))，胰蛋白酶、EDTA(Biosharp公司，中國(guó))，F(xiàn)ITC標(biāo)記的荊豆類凝集素(FITC-UEA,Sigma公司，美國(guó)),DiI-乙?；兔芏戎鞍?(DiI-acLDL,Molecular Probe 公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，美國(guó))，倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，活細(xì)胞工作站(Applied Precision公司，美國(guó))，Imaries 6.5 軟件(Bitplane公司，瑞士)。

1.2 電場(chǎng)刺激裝置細(xì)胞培養(yǎng)小室的制備 直流電場(chǎng)模擬生理電場(chǎng)干預(yù)裝置參照Song等[6]的方法進(jìn)行改良制作，原理圖見圖1。制作簡(jiǎn)述如下：使用康道寧絕緣硅脂硅基復(fù)合物4(DC4)將蓋玻片(50.00 mm×12.00 mm×0.15 mm)比照?qǐng)D紙(圖1A)粘貼至培養(yǎng)皿(直徑10 cm)內(nèi)，使其與培養(yǎng)皿底面緊密接觸，再用DC4 將密封條和培養(yǎng)皿內(nèi)緣連接，阻斷培養(yǎng)基自由流動(dòng)，即制作成趨電小室，密封條間形成50.00 mm×20.00 mm×0.15 mm的區(qū)域維度用于接種細(xì)胞，該區(qū)域可使場(chǎng)強(qiáng)和電流均勻分布。再將其與鹽橋、Steinberg 緩沖液、銀絲、電線、輸出電源構(gòu)成完整的趨電裝置(圖1B)。

A：趨電小室示意圖；B：內(nèi)源性生物電場(chǎng)模擬趨電裝置示意圖。

圖1 內(nèi)源性生物電場(chǎng)模擬裝置

1.3 方法

1.3.1 EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 具體方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 電場(chǎng)刺激 將3～4代骨髓來(lái)源小鼠EPCs均勻接種于趨電小室，培養(yǎng)24 h后,更換培養(yǎng)基，分別用強(qiáng)度為100 mV/mm(Ⅱ組)、200 mV/mm(Ⅲ組)和300 mV/mm(Ⅳ組)的電場(chǎng)連續(xù)電刺激3 h，活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)記錄電場(chǎng)刺激下細(xì)胞遷移軌跡及形態(tài)，0 mV/mm組(Ⅰ組)細(xì)胞作為對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 EPCs鑒定 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：分別于接種后0、1、3、7、14 d在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，原代EPCs培養(yǎng)約48 h開始貼壁，3 d后換液可見貼壁細(xì)胞呈圓形、短梭形或多角形，7 d時(shí)克隆上基本無(wú)圓形細(xì)胞附壁，10～15 d細(xì)胞約70%融合，局部密集區(qū)呈鋪路石樣排列。雙吞實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞表型：通過(guò)熒光顯微鏡鑒定發(fā)現(xiàn)，同時(shí)攝取DiI-acLDL和FITC-UEA的雙染陽(yáng)性細(xì)胞的比例達(dá)90%，表明貼壁細(xì)胞為正在分化的EPCs。

圖2 細(xì)胞遷移方向及速率的量化方法示意圖

2.2 電場(chǎng)下EPCs遷移能力檢測(cè) Ⅰ組EPCs遷移方向是隨機(jī)的(圖3A、B、E)；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組EPCs向陽(yáng)極定向遷移，且細(xì)胞逐漸變得狹長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)軸逐漸與電場(chǎng)方向平行(圖3C、D、F)。細(xì)胞定向遷移能力與場(chǎng)強(qiáng)呈正相關(guān)(圖3G)，場(chǎng)強(qiáng)越大，cosθ值越大，定向遷移越明顯，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組cosθ值均較Ⅰ組大，Ⅳ組cosθ值亦均較Ⅲ組、Ⅱ組大(P<0.01),見表1。EPCs遷移速率Vt、Vd、Vx均與場(chǎng)強(qiáng)呈正相關(guān)(圖3H)，與Ⅰ組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組Vt、Vd、Vx均明顯升高(P<0.01)；Ⅲ組Vt、Vd、Vx均高于Ⅱ組(P<0.01)，Ⅳ組細(xì)胞Vt、Vd、Vx均顯著高于Ⅲ組和Ⅱ組(P<0.01)，見表2。EPCs受電場(chǎng)刺激后，細(xì)胞出現(xiàn)伸長(zhǎng)反應(yīng)，其外觀呈狹長(zhǎng)梭形,逐漸與電場(chǎng)方向平行排列，見圖3C、D。其細(xì)胞長(zhǎng)短軸比值在Ⅳ組電場(chǎng)中1、2、3 h分別為2.966±0.059、4.183±0.068和6.243±0.098,與Ⅰ組0 h時(shí)細(xì)胞比值(2.219±0.084)相比明顯增加(均P<0.01)。

表1 4組EPCs各時(shí)相點(diǎn)cosθ值比較(±s)

a：P<0.01,與Ⅰ組比較；b：P<0.01，與Ⅱ組比較；c：P<0.01，與Ⅲ組比較。

表2 4組EPCs遷移速率的比較(±s，μm/h)

a：P<0.01,與Ⅰ組比較；b：P<0.01，與Ⅱ組比較；c：P<0.01，與Ⅲ組比較。

A、B、E：無(wú)電場(chǎng)時(shí)EPCs前后3 h的形態(tài)及遷移軌跡；C、D、F：電場(chǎng)下EPCs前后3 h的形態(tài)及遷移軌跡，原點(diǎn)(0，0)為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的起點(diǎn)；G：不同場(chǎng)強(qiáng)下及各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的cosθ值；H：不同場(chǎng)強(qiáng)作用3 h時(shí)細(xì)胞的平均移行速率；a：P<0.01，與Ⅰ組比較；b：P<0.01，與Ⅱ組比較，c:P<0.01，與Ⅲ組比較。

圖3 電場(chǎng)作用下EPCs的遷移

3 討 論

生物電現(xiàn)象普遍存在于生命體內(nèi)，胚胎發(fā)育、組織再生、創(chuàng)面愈合等都需要生物電的參與。細(xì)胞膜兩側(cè)正負(fù)離子的流動(dòng)產(chǎn)生跨細(xì)胞電勢(shì)差，當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞因生理或病理因素產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變時(shí)，原有電勢(shì)差改變，產(chǎn)生內(nèi)源性電場(chǎng)[9]。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，通過(guò)外加一定強(qiáng)度的電場(chǎng)增強(qiáng)內(nèi)生電場(chǎng)，可加快病變部位愈合速度和改善愈合質(zhì)量[1-2，10-11]。血管乃全身的命脈系統(tǒng)，機(jī)體的各種創(chuàng)傷、缺血損傷無(wú)不伴隨血管的損傷，同時(shí)也伴隨生物電的改變。因此，通過(guò)外加電場(chǎng)調(diào)整病灶部位內(nèi)生物電場(chǎng)進(jìn)行血管修復(fù)不失為一種有效的方法。目前，電刺激在血管修復(fù)方面的研究已取得了不少成績(jī)，其研究的對(duì)象主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞，電刺激可能通過(guò)作用于內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)調(diào)控血管生成[12]。通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞電刺激研究發(fā)現(xiàn)，適宜的電刺激強(qiáng)度可促進(jìn)血管再生與修復(fù)。然而，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為終末分化類型的細(xì)胞,其遷移、增殖能力十分有限，不能滿足血管修復(fù)與再生的需要；EPCs 作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，其強(qiáng)大的增殖分化潛能已被眾多科學(xué)家所關(guān)注[13]。EPCs存在于骨髓和外周血中，可向損傷部位遷移或歸巢[14]。許多因素調(diào)控著EPCs向損傷血管或血管生成部位歸巢，具體機(jī)制尚不清楚。趨化因子和細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，影響EPCs的數(shù)量和遷移[14-15]。發(fā)展促進(jìn)EPCs遷移的有效方法及對(duì)EPCs向損傷和血管形成部位歸巢具體機(jī)制的認(rèn)識(shí)具有重要臨床意義。

本研究通過(guò)建立外源性電刺激裝置模擬內(nèi)源性生物電場(chǎng)，探討電刺激下EPCs遷移行為的改變。研究結(jié)果顯示，EPCs可在外源性電場(chǎng)的刺激下向陽(yáng)極定向遷移，場(chǎng)強(qiáng)越大，定向遷移越明顯，而對(duì)照組遷移方向隨機(jī)；各電刺激組細(xì)胞的遷移速率均較對(duì)照組顯著增強(qiáng)，且遷移速率隨電場(chǎng)刺激強(qiáng)度的增強(qiáng)而加快；各電刺激組細(xì)胞形態(tài)變得狹長(zhǎng)，其長(zhǎng)軸與電場(chǎng)方向平行，且場(chǎng)強(qiáng)越大，狹長(zhǎng)形態(tài)越明顯，而對(duì)照組形態(tài)變化不明顯。提示內(nèi)源性生物電場(chǎng)具有促進(jìn) EPCs向陽(yáng)極定向遷移的能力并能提高遷移速率，并能改變細(xì)胞形態(tài)。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)EPCs不能耐受大于300 mV/mm的電場(chǎng)強(qiáng)度，350 mV/mm的場(chǎng)強(qiáng)對(duì)其進(jìn)行刺激時(shí)，即開始出現(xiàn)部分EPCs死亡的現(xiàn)象。提示本實(shí)驗(yàn)條件下，300 mV/mm的場(chǎng)強(qiáng)刺激時(shí)，EPCs定向遷移最明顯，遷移速率最快，同時(shí)細(xì)胞可以耐受。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，300 mV/mm的場(chǎng)強(qiáng)為促進(jìn)EPCs遷移的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示電刺激能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的 EPCs向陽(yáng)極定向遷移，且遷移速率與一定范圍內(nèi)的場(chǎng)強(qiáng)強(qiáng)度呈正相關(guān)，300 mV/mm的場(chǎng)強(qiáng)為促進(jìn)EPCs遷移的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度；EPCs在電場(chǎng)下形態(tài)逐漸變得狹長(zhǎng)，其細(xì)胞長(zhǎng)軸與電場(chǎng)方向平行。產(chǎn)生此種現(xiàn)象的具體機(jī)制尚不明確。細(xì)胞遷移是血管新生的前提，電場(chǎng)促進(jìn)EPCs定向遷移有望促進(jìn)血管生成。電刺激下EPCs生物學(xué)特性改變的研究促進(jìn)了電刺激促進(jìn)血管新生的相關(guān)研究，最終可為電刺激在血管損傷如缺血、創(chuàng)傷等病變中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，同時(shí)也可為其他治療方法中EPCs的應(yīng)用提供新思路。

然而，在血管生成中，電場(chǎng)對(duì)EPCs分化形成血管的能力是否存在影響也值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)初步探討了電場(chǎng)對(duì)EPCs遷移的影響，電場(chǎng)是否同時(shí)存在對(duì)細(xì)胞分化能力的影響。已有研究表明，電場(chǎng)能夠促進(jìn)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，促進(jìn)神經(jīng)干/祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化[16]，促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[17]，提示電場(chǎng)可能是促進(jìn)細(xì)胞分化的重要因素。因此，電場(chǎng)對(duì)EPCs分化形成血管能力的影響值得進(jìn)一步探索。

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Influence of electric fields on migration behavior and morphology of endothelial progenitor cells

HuXuefei1,ChengYong2,WenXing1,WangYongfei1,WangQiang2,XuXisheng1△

(1.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,AffiliatedChenzhouMunicipalFirstPeople′sHospital,UniversityofSouthChina,Chenzhou,Hunan423000，China;2.DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,People′sHosptialofQingyuan,Qingyuan,Guangdong511500,China)

Objective To investigate the influence of external electric fields on migration behavior and morphology of endothelial progenitor cells (EPCs) cultured in vitro.Methods The in vitro cultured 3-4 generation EPCs were continuously stimulated by direct-current electric field with the field intensity of 0 mV/mm(group Ⅰ),100 mV/mm(group Ⅱ),200 mV/mm(group Ⅲ) and 300 mV/mm(group Ⅳ)for 3 h.The live cell station was used to real time record the cell migration track and morphology change of EPCs.The influence of external electric field on the EPCs migration behavior and morphology was analyzed.Results Under the stimulation of the direct-current electric field with the intensity of group Ⅳ,group Ⅲ and group Ⅱ,the cells were directly migrated to anode,while the cells under group Ⅰ displayed the random motion.The track migration velocity(Vt)、displacemnt velocity(Vd) and electric field direction migration rate(Vx) were(98.86±6.00),(63.78±2.81),(63.15±2.88)μm/h for the group Ⅳ,(88.06±8.83),(35.90±1.22),(34.20±1.57)μm/h for the groupⅢ,(42.28±2.25),(13.29±0.37),(12.39±0.51)μm/h for the groupⅡ,which were significantly higher than(37.39±2.42),(6.99±0.31),(4.62±0.40)μm/h for the groupⅠ(P<0.01),moreover Vt,Vd and Vx in the group Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅱ andⅠ(P<0.01).EPCs had obvious morphological changes under the electric field action,such as elongation and the cellular long axis parallel to the electric field direction.Conclusion External direct current electric fields may induce the directed migration of EPCs towards the anode,accelerates the migration rate,moreover has obvious influence on EPCs morphology.

electric fields;endothelial progenitor cells;galvanotaxis;cell migration

胡雪飛(1987-),在讀碩士，主要從事燒傷外科學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:13762590230@163.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.006

R622

A

1671-8348(2016)10-1316-04

2015-12-18

2016-01-25)