艾佳晨，廖應養(yǎng)，熊靜悅，肖 英，石依坤，唐大軒，張 莉，譚正懷△

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院 610072；2.四川省中醫(yī)藥科學院藥理毒理研究所，成都 610041； 3.石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司，石家莊 050035)

基于多靶點防治AD策略的候選新藥腦智復的藥理作用及其機制研究*

艾佳晨1,2，廖應養(yǎng)3，熊靜悅2，肖 英1,2，石依坤1,2，唐大軒2，張 莉2，譚正懷2△

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院 610072；2.四川省中醫(yī)藥科學院藥理毒理研究所，成都 610041； 3.石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司，石家莊 050035)

目的 評價腦智復多靶點防治阿爾茨海默病(AD)的作用。方法 雌性小鼠去勢后30 d，海馬內注射Aβ1-42和鵝膏蕈氨酸(IBO)以復制AD模型，次日將造模小鼠分為模型組、腦智復低劑量組、腦智復中劑量組、腦智復高劑量組及吡拉西坦組并相應給藥，每天灌胃1次，連續(xù)4周，另設假手術組(對照組)進行跳臺、Morris水迷宮及生化指標的檢測。結果 與對照組比較，模型組小鼠跳臺試驗中的潛伏期顯著縮短(P<0.05)，錯誤次數(shù)增加(P<0.05)，在水迷宮中尋找逃逸平臺的逃避潛伏期延長(P<0.05)，進入逃逸平臺的次數(shù)減少(P<0.05)，在逃逸平臺周圍游泳的路程、在有效區(qū)域內的游泳時間及路程減少(P<0.05);腦組織的丙二醛水平明顯升高，乙酰膽堿水平及超氧化物歧化酶活力明顯下降(均P<0.05)。腦智復高、中劑量組中上述指標顯著改善。結論 腦智復具有體內多靶點防治AD的作用。

阿爾茨海默病；腦智復；Aβ1-42；鵝膏蕈氨酸

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種進行性記憶和認知功能損傷為特征的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。臨床主要表現(xiàn)為進行性認知障礙。病理學主要表現(xiàn)為老年斑大量出現(xiàn)、神經(jīng)原纖維纏結及神經(jīng)元缺失變性等[2]。流行病學調查表明，我國有AD患者約600萬，預計至2020年，我國的AD患者將達到2 000萬人[3]，目前全球醫(yī)藥工作者都在積極尋找能有效防治AD的藥物或方法。腦智復以具有良好抗氧化作用的燈盞乙素為母體，經(jīng)過系列結構加工、修飾，使其同時具有良好的抗氧化作用、抑制膽堿酯酶活性、金屬絡合作用，抑制Aβ的聚集等[4-6]，但其在體內是否同樣具有良好的抗AD作用，本文就此問題進行探討。

1 材料與方法

1．1 材料 實驗動物均為SPF級昆明種小鼠[四川省中醫(yī)藥科學院提供，生產(chǎn)合格證號SCXK(川)2013-19號]。DW-2000腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；全波長酶標儀(Thermo公司)；腦智復，由四川大學華西藥學院鄧勇教授課題組提供；Aβ1-42(Sigma公司)；鵝膏蕈氨酸(IBO,Sigma公司)；吡拉西坦片(華中藥業(yè)股份有限公司，批號20120513)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿(ACh)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及給藥 SPF級昆明種雌性小鼠80只，18～22 g，適應性喂養(yǎng)2 d后，用水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠，按照Hruska等[5]做法稍有改進，除假手術組(對照組)小鼠僅切除卵巢附近的脂肪外，其他各組小鼠均進行雙側卵巢摘除手術。卵巢摘除手術4周后，進行神經(jīng)毒性造模：Aβ1-42粉末0.2 mg溶于200 μL無菌的生理鹽水中，濃度為1 μg/μL，混勻，37 ℃恒溫箱孵育1周，使其轉為凝聚態(tài)，取IBO 0.1 mg溶于其中，配制成Aβ1-42和IBO的混合液。運用腦立體定位儀在小鼠大腦海馬區(qū)(以前囟后3 mm,中線右旁開2 mm，深2 mm為坐標)注射Aβ1-422 μL/只，次日將造模小鼠分為模型組、吡拉西坦組(陽性對照，800 mg/kg)、腦智復高劑量組(腦智復18 mg/kg)、腦智理智中劑量組(腦智復6 mg/kg)、腦智復低劑量組(腦智復2 mg/kg)，后4組灌胃給藥，每日1次，連續(xù)4周，模型組及對照組則給與等體積0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。給藥3周后，進行跳臺和Morris水迷宮實驗。末次給藥后24 h，取腦組織測定SOD、MDA、ACh水平。

1.2.2 跳臺實驗 于給藥3周后進行跳臺試驗，將動物放入反應箱內適應3 min，然后立即通以36 V交流電。訓練5 min，并記錄每次小鼠受到電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))，并由此作為學習成績。24 h后進行測試，每只小鼠測定 5 min，記錄小鼠第1次跳下平臺的潛伏期及5 min內的錯誤次數(shù)。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 跳臺實驗結束后，采用Morris水迷宮系統(tǒng)測定小鼠的學習記憶能力。水池直徑120 cm，高60 cm，平臺直徑12 cm。實驗前將水池分為1、2、3、4 4個象限，然后將安全平臺置于其中一個象限內，向水池內注入水，水溫(23±2)℃，加入適量奶粉，使水池成為不透明的白色。(1)定位航行實驗：隱藏平臺，使水面沒過平臺2 cm，將小鼠進行隱藏平臺實驗，并記錄90 s內小鼠從入水到爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期。允許動物90 s內找到平臺，并在平臺上保持10 s，若動物在入水游泳90 s以內仍未能找到水池中的平臺或未能爬上平臺時,則將動物引導置于平臺上站立保持10 s,動物每天訓練3次，連續(xù)3 d。(2)空間探索實驗：定位航行試驗結束24 h后，撤除站臺。然后任選一相同入水點將小鼠放入水中，記錄小鼠在90 s內的游泳路徑，記錄有效區(qū)域運動時間、有效區(qū)域運動距離、有效區(qū)域進入逃逸平臺次數(shù)等。

1.2.4 生化指標 將腦組織用生理鹽水制成10%的組織勻漿，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測試MDA、SOD、ACh水平。用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度。

2 結 果

2.1 跳臺實驗結果 由表 1可見，在跳臺實驗中，與對照組比較模型組小鼠的潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，吡拉西坦組，腦智復高劑量、中劑量組小鼠潛伏期、錯誤次數(shù)顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦智復低劑量組亦可顯著延長癡呆小鼠潛伏期，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但其減少錯誤次數(shù)的作用較弱，與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 水迷宮實驗結果 由表2可見，模型組小鼠無論在定向航行還是空間探索實驗中找到逃逸平臺的潛伏期均明顯長于對照組(P<0.05)，各藥物組均可顯著縮短癡呆小鼠找到逃逸平臺的潛伏期，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由表3可見，在空間探索實驗中，模型組小鼠進入逃逸平臺次數(shù)及在平臺周圍游泳的路程均明顯少于對照組(P<0.05)，各藥物組均能顯著增加癡呆小鼠進入逃逸平臺次數(shù)及在逃逸平臺周圍游泳的路程，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦智復高、中劑量小鼠進入逃逸平臺的次數(shù)與吡拉西坦組比較明顯增多(P<0.05)。

表1 腦智復對AD小鼠在跳臺實驗中各項指標的影響(±s)

a:P<0.01，b,P<0.05,與模型組比較。

表2 腦智復對AD小鼠在定向航行及空間探索實驗找到逃逸平臺逃逸潛伏期的影響(±s)

d1、d2、d3、d4分別為水迷宮試驗第1、2、3、4天；b：P<0.01，a：P<0.05，與模型組比較。

由表4 可見，在空間探索實驗中，模型組小鼠在有效區(qū)域內的游泳時間及路程均明顯少于對照組(P<0.05)。吡拉西坦組也可一定程度增加有效區(qū)域內的運動時間及路程，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而腦智復各劑量組均能明顯增加AD小鼠在有效區(qū)域內的游泳時間及路程(P<0.05)。與吡拉西坦組相比，腦智復各劑量組在有效區(qū)域內的游泳路程明顯增加(P<0.05)。

表3 腦智復對AD小鼠進入逃逸平臺的次數(shù)及在其周圍游泳路程的影響(±s)

a:P<0.05,與模型組比較；b:P<0.05，與吡拉西坦組比較。

2.3 生化指標變化 如表 5 所示，與對照組比較，模型組腦組織MDA水平明顯升高，SOD活力明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，腦智復高劑量組MDA水平顯著降低，腦智復中劑量組ACh水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 腦智復對AD小鼠在有效區(qū)域內游泳時間及路程的影響 (±s)

a：P<0.05,與模型組比較;b:P<0.05，與吡拉西坦組比較。

表5 腦智復對AD小鼠腦組織中SOD、MDA、ACh水平的影響(±s)

a：P<0.05,b：P<0.01,與模型組比較。

3 討 論

AD發(fā)病機制復雜、涉及諸多假說，包括Aβ沉積學說、膽堿能神經(jīng)異常假說、氧化應激與自由基損傷假說、tau蛋白磷酸化學說及雌激素缺乏學說等[6]。目前已經(jīng)上市的AD治療藥物大部分屬于單靶向藥物，可以一定程度緩解輕度、中度的AD癥狀，但不能阻止或者逆轉AD的進一步發(fā)展。近年來研究者嘗試多靶點治療AD，以期找到更有效的藥物[7]。

本課題組采用去勢小鼠單側海馬內注射Aβ1-42和IBO的混合液導致的復合模型，以模擬Aβ沉積、膽堿能神經(jīng)損傷及雌激素缺乏等多種因素復合引起的AD。結果表明，在去勢小鼠海馬注射Aβ1-42和IBO后，小鼠的學習、記憶能力均明顯降低，小鼠腦組織MDA水平明顯升高，SOD活力及ACh水平明顯下降，這表明側腦室注射Aβ1-42和IBO及雌激素缺乏誘導氧化應激產(chǎn)生游離的自由基,破壞膽堿能系統(tǒng)，使學習記憶能力下降。基底前腦注射IBO，會破壞腦內膽堿能系統(tǒng)，使膽堿能神經(jīng)元丟失，破壞膽堿能神經(jīng)元的功能，或使其功能喪失，降低ACh[8-9]，Aβ1-42或者IBO單獨注射僅能使注射部位周邊的神經(jīng)元退化損傷，Aβ1-42和IBO聯(lián)合注射不僅使注射部位神經(jīng)元劇烈丟失，還能使海馬CA1、CA4區(qū)的神經(jīng)元細胞丟失，這種損傷與IBO有劑量依賴。而且Aβ和IBO聯(lián)合注射能強烈損傷微管結合蛋白-2的免疫反應[10]。氧自由基增加既是雌激素缺乏的結果[11],也是Aβ的毒性效應之一，增加神經(jīng)細胞中自由基的濃度，可誘發(fā)脂質過氧化，使Ca2+內流，進而使線粒體功能損傷，誘導神經(jīng)元凋亡。腦組織的氧化應激還可使Aβ斑塊的沉積加速，沉積的Aβ斑塊可作為活性氧供體從而加劇氧化應激，因此，應用抗氧化劑可以阻斷氧化應激和Aβ斑塊之間的正反饋[12-13]，進而使得神經(jīng)元細胞避免受Aβ的毒害。這可能也是本實驗發(fā)現(xiàn)吡拉西坦對復合因素致AD小鼠具有一定預防作用的重要原因。吡拉西坦是GABA(γ-氨基丁酸)的衍生物，與谷氨酸受體有最大親和力，可直接激活谷氨酸受體；清除腦內氧自由基，減慢脂質過氧化；抗大腦皮質缺氧，增加氧血流量，促進能量轉化，和腦蛋白質合成及促進腦半球間的信息傳遞，增加腦細胞的能量儲存和腦細胞活性，從而改善學習記憶能力，是常用的神經(jīng)保護劑[14-15]。

本實驗中，經(jīng)過腦智復治療后，腦組織中的ACh水平升高，SOD活性升高，MDA水平降低，AD小鼠的學習記憶能力明顯改善，其學習記憶能力強于吡拉西坦組，提示腦智復在體內同樣具有良好的抗氧化作用及抑制膽堿酯酶活性的作用，展示了部分多靶點作用的特性，其他多靶點策略的體現(xiàn)還有待進一步深入研究和評價。

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Study on pharmacological effects and mechanism of Naozhifu as a new drug candidate for prevention and treatment of Alzheimer′s disease base on multiple targets strategy*

AiJiachen1,2,LiaoYingyang3,XiongJingyue2,XiaoYing1,2,ShiYikun1,2,TangDaxuan2,ZhangLi2,TanZhenghuai2△

(1.ColledgeofPharmacyChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610072,China; 2.InsituteofPhamacologyToricdogy,SichuanAcademyofChineseMedicineScience,Chengdu,Sichuan610041,China； 3.ZhongqiPharmaceuticalTechnology(Shijiazhuang)Co.,Ltd.,CSPCPharmaGroup,Shijiazhuang,Hebei050035,China)

Objective To evaluate the effect of Naozhifu as a multifunctional agents for the prevention and treatment of Alzheimer’s disease(AD).Methods On 30th after castration,female mice were received intrahippocampal injection of Aβ1-42and ibotenic acid for replicating the AD model.On the next day,these modeled mice were randomly divided into model group，low dose of Naazhifu group，middle dose of Naozhifu group，high dose of Naozhifu group and piracetam group,sham operated mice were set as control group.Then the gavage was given once a day for 4 consecutive weeks.Furthermore the step-down passive avoidance test,morris water maze test and biochemical indicators detection were performed.Results In step-down passive avoidance test,the latent period in model group was significantly shortened(P<0.05),the fault frequency was increased when compared with control group(P<0.05).During the Morris Water Maze test,the latent period for seeking escape from platform in AD mice were obviously extended(P<0.05),the times of passing through the platform was shortened(P<0.05),the swimming path length around the escape from platform,swimming time and distance in the effective area in AD mice were increased(P<0.05),meanwhile the level of MDA in brain tissue was significantly increased,while the levels of Ach and SOD were significantly decreased(P<0.05).These indicators in middle and high dose of Naofuzhi group obviously improved.Conclusion Naofuzhi has the multi-target prevention and treatment effect on AD.

Alzheimer′s disease;Naozhifu;Aβ1-42;ibotenic acid

四川省科技廳資助項目(A-2014N-6)。

艾佳晨(1991-)，在讀碩士，主要從事老年癡呆研究。
△

，E-mail:tanzhh616@163.com。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.005

R285

A

1671-8348(2016)10-1313-03

2015-12-18

2016-01-16)