袁忠濤，卿 晨，李曉進(jìn)，張學(xué)美，史明霞，黃 穎，李惠民△

(1．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院血液科 650021)

神經(jīng)元特異性烯醇化酶和U266細(xì)胞株對(duì)破骨樣細(xì)胞作用的研究*

袁忠濤1，卿 晨2，李曉進(jìn)3，張學(xué)美1，史明霞1，黃 穎1，李惠民1△

(1．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 650500； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院血液科 650021)

目的 探討神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞U266對(duì)人破骨樣細(xì)胞(OLC)功能的影響。方法 采用正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞加用細(xì)胞核因子κB受體激治蛋白配體(RANKL)+巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC；實(shí)驗(yàn)分3組，NSE組：將6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)14 d的OLC，分別加入100 ng/mL重組人NSE培養(yǎng)24、48、72 h；共培養(yǎng)組：將6孔Transwell小室下室中培養(yǎng)14 d的OLC，各上室分別加入1×105/孔U266細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)24、48、72 h；對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)的OLC。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較 NSE和U266細(xì)胞株對(duì)OLC的RANKL、擴(kuò)胃蛋白(OPG)、IL-6和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果 共培養(yǎng)組、NSE組和對(duì)照組RANKL、OPG、IL-6 mRNA在OLC均不表達(dá)；與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組、NSE組的TRAP mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；TRAP mRNA表達(dá)水平的升高尤其以48 h和72 h明顯。結(jié)論 本試驗(yàn)中OLC表達(dá)TRAP，NSE是促進(jìn)骨髓瘤骨病中OLC分化和成熟的因素，提示NSE能增強(qiáng)OLC的活性。

磷酸丙酮酸水合酶；骨髓瘤骨病；破骨細(xì)胞；酸性磷酸酶

骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)是影響多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者生存質(zhì)量和預(yù)后的主要因素[1]，MBD的發(fā)生、發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，MM細(xì)胞活化破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)，抑制成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)活性，導(dǎo)致骨代謝失衡是其主要的病理生理機(jī)制，其中OC為主要的效應(yīng)細(xì)胞[2]。細(xì)胞核因子κB(NF-κB)受體激活蛋白(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)/NF-κB受體激活蛋白配體(receptor activator of nuclear factor κB lisand，RANKL)/護(hù)骨蛋白(osteoprotegerin,OPG)系統(tǒng)是耦聯(lián)OB和OC功能最重要的方式，RANKL為Ⅱ型跨膜蛋白,主要由OB和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是介導(dǎo)OC分化和活化的關(guān)鍵因子[3]。RANKL在MM患者來源的漿細(xì)胞中高表達(dá)，而且有溶骨病變患者的表達(dá)水平明顯高于無溶骨病變者[4]。RANK屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，可表達(dá)于OC的前體細(xì)胞和成熟的OC表面。RANKL與RANK結(jié)合后促使OC前體細(xì)胞分化成OC而產(chǎn)生溶骨效應(yīng)，同時(shí)RANKL通過NF-κB和Jun N-終端激酶(JNK)途徑，直接活化成熟的OC，促進(jìn)骨的重吸收[5]。OPG是RANKL的可溶性誘導(dǎo)受體，可競(jìng)爭(zhēng)性阻止RANK與RANKL結(jié)合，抑制OC的分化和活化。MM細(xì)胞除影響RANKL的表達(dá)外，還可抑制OB和基質(zhì)細(xì)胞分泌OPG，從而減少骨髓微環(huán)境中的OPG。在MM患者中OPG產(chǎn)生明顯減少，RANKL/OPG比例失調(diào)，造成骨代謝失衡，促進(jìn)溶骨病變的同時(shí)也促進(jìn)瘤細(xì)胞本身的增殖，最終造成OC活化與骨髓瘤進(jìn)展的惡性循環(huán)[6]。MM細(xì)胞本身不表達(dá)OPG，但可通過細(xì)胞間的相互作用直接抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)OPG[7]。破骨樣細(xì)胞(osteoclast-like cell,OLC)功能與OC相似[8]，人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的OLC為研究提供了細(xì)胞來源。OLC能分泌并表達(dá)特異性標(biāo)志酶抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，TRAP能參與骨吸收的調(diào)節(jié)[8]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolas,NSE)在多種實(shí)體瘤和MM等血液腫瘤中均有表達(dá)[9-12]，且與溶骨性病變有關(guān)[13]，但NSE在MBD中如何起作用，對(duì)OC的影響如何尚不清楚。本研究旨在通過人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC，并通過NSE和人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266對(duì)OLC的作用，觀察NSE對(duì)OLC功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 外周血來源于8名健康志愿者，其中男3名，女5名，平均年齡(25.1士2.4)歲，血常規(guī)正常；人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266由第二軍醫(yī)大學(xué)上海長征醫(yī)院侯健教授惠贈(zèng)傳代培養(yǎng)。主要試劑：RANKL和人巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)購自英國PeproTech公司，TRAP染色試劑盒購自南京建成生物研究所，TRIzol試劑購自美國Roche公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，RANKL、OPG、IL-6和TRAP基因擴(kuò)增相關(guān)引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC

1.2.1.1 分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞 抽取外周血20 mL，置于含1 mL無菌肝素鈉生理鹽水(1 000 U/mL)的50 mL離心管中，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，充分混勻，并分為兩等份(各20 mL)；另取兩支50 mL離心管，分別加入20 mL淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)，將裝有Ficoll液的離心管傾斜45°，用尖頭吸管將等體積的稀釋標(biāo)本沿管壁(距離液面1 cm處)緩慢加入離心管，使其輕鋪在Ficoll液上，2 000 r/min離心25 min，小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層置于新的離心管；加入5倍體積PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞2次(1 500 r/min離心10 min)，獲得單個(gè)核細(xì)胞；加入含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打均勻。取部分細(xì)胞懸液，加入適量NH4Cl裂解液裂解殘存的紅細(xì)胞，2 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吸取10 μL置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞濃度。

1.2.1.2 細(xì)胞的純化 將上述單個(gè)核細(xì)胞的密度重調(diào)，以1.5×106/mL種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入含10% FBS和100 IU/mL青、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液5 mL，置于在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h后輕輕倒去瓶中的上清液，用不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，去除未貼壁細(xì)胞。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)液，常溫消化1～3 min后置于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓，立即加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用。用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，待細(xì)胞脫離瓶壁，吸取細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心10 min，棄上清液。

1.2.1.3 OCL的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將上述分離的人外周血單個(gè)核細(xì)胞以1.5×106/mL種植于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行細(xì)胞純化；將純化的細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板(預(yù)先將牙質(zhì)片層鋪入培養(yǎng)板中)及1×106/mL的密度接種于6孔和24孔培養(yǎng)板，加入含重組人RANKL 100 ng/mL、M-CSF 50 ng/mL 和10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和分化。

1.2.1.5 OCL的鑒定 TRAP染色：取培養(yǎng)14 d左右的細(xì)胞爬片，經(jīng)洗滌、固定和清洗；按照TRAP染液說明書具體步驟進(jìn)行染色，并用蘇木素復(fù)染，清洗后自然風(fēng)干；水性封片劑封片后光鏡觀察TRAP陽性細(xì)胞，照相。骨吸收陷窩觀察：取出96孔培養(yǎng)板誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d OLC作用的牙質(zhì)片層，經(jīng)清洗、固定、風(fēng)干及乙醇梯度脫水等處理，掃描電鏡觀察OLC對(duì)牙質(zhì)片層的骨質(zhì)破壞情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 NSE組：將6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)14 d的OLC，分別加入100 ng/mL重組人NSE培養(yǎng)24、48、72 h；共培養(yǎng)組：將6孔Transwell小室下室中培養(yǎng)14 d的OLC，各上室分別加入1×105/孔U266細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)24、48、72 h；對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)的OLC。每孔設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OLC的RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況 按預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)收集NSE組、共培養(yǎng)組和對(duì)照組樣本,采用Trizol試劑盒，嚴(yán)格按照試劑操作說明提取單個(gè)核細(xì)胞的總RNA,紫外分光光度儀測(cè)定RNA 含量及純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參照對(duì)cDNA產(chǎn)物行PCR擴(kuò)增，各目的基因擴(kuò)增引物見表1。擴(kuò)增過程為95 ℃ 10 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s變性，59 ℃ 20 s退火，68 ℃ 50 s延伸，40個(gè)循環(huán)結(jié)束反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)：反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表達(dá)，由 ABI7300隨機(jī)軟件分析擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物熔解曲線，按照相對(duì)定量公式 2-△△Ct計(jì)算目的基因參照管家基因的相對(duì)含量，每一標(biāo)本設(shè)置3個(gè)平行管，以3個(gè)平行管所得到Ct值的均值計(jì)算，比較各組RANKL、OPG、IL-6和 TRAP基因的表達(dá)情況。

表1 擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)6～7 d,有個(gè)別單個(gè)核細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)融合現(xiàn)象,形態(tài)多為圓形或橢圓形，14 d左右可觀察到圓形、橢圓形、長條形、漏斗形或不規(guī)則形的多核巨細(xì)胞，見圖1。

2.2 TRAP染色結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，取出細(xì)胞爬片進(jìn)行TRAP染色，可觀察到圓形、橢圓形、長條形、漏斗形或不規(guī)則形的細(xì)胞，體積較大，細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見酒紅色顆粒沉積，部分細(xì)胞質(zhì)中可見大小不等空泡,核數(shù)個(gè)，呈淡黃色，細(xì)胞核清晰，大小不一,聚積在細(xì)胞中央或排列在細(xì)胞周邊。蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核染呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)仍為酒紅色，見圖2。

2.3 牙質(zhì)片層掃描電鏡結(jié)果 誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC 28 d，骨片表面可見形態(tài)不規(guī)則的吸收陷窩，常規(guī)培養(yǎng)組(未進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng))對(duì)照組骨片表面未見骨吸收陷窩，見圖3。

A：3 d；B：7 d；C：12 d；D：14 d。

圖1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)RANKL+M-CSF誘導(dǎo)下不同時(shí)間段的細(xì)胞形態(tài)(×200)

A：TRAP染色(×200);B：TRAP染色(×400);C：TRAP染色+蘇木素復(fù)染(×200);D：TRAP染色+蘇木素復(fù)染(×400)。

圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d TRAP染色的細(xì)胞形態(tài)

A：對(duì)照組(SEM×1 000);B：誘導(dǎo)培養(yǎng)組(SEM×1 000)。

圖3 骨吸收陷窩掃描電鏡觀察

a:P<0.01,與對(duì)照組比較；b:P<0.01,與24 h比較。

圖4 3組不同時(shí)間TRAP mRNA表達(dá)水平的變化趨勢(shì)圖

2.4 各組OLC時(shí)RANKL、OPG、IL-6和TRAP mRNA表達(dá)情況 共培養(yǎng)組、NSE組及對(duì)照組RANKL、OPG、IL-6 mRNA均不表達(dá)；共培養(yǎng)組、NSE組與對(duì)照組相比，TRAP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。共培養(yǎng)組、NSE組48 h和72 h TRAP mRNA的表達(dá)水平高于24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組48 h和72 h TRAP mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組24、48、72 h TRAP mRNA的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖4。

3 討 論

正常情況下，骨形成和骨吸收處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這是骨重塑過程。OC和OB是這一過程中的主要細(xì)胞，協(xié)調(diào)成骨與破骨的動(dòng)態(tài)平衡，從而維持骨的相對(duì)穩(wěn)定[14]。OC是體內(nèi)生理狀態(tài)下惟一有骨吸收功能的細(xì)胞，在生理性骨重建和病理性骨吸收中起重要作用[15]。OC在受到MM細(xì)胞或骨髓微環(huán)境中其他細(xì)胞的刺激下，可致細(xì)胞數(shù)量增多，功能活躍，出現(xiàn)溶骨增強(qiáng)[16]。

OC是高度分化的終末細(xì)胞，體外分離的細(xì)胞只能存活7～14 d，且獲得的細(xì)胞數(shù)量有限。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的OLC在功能上與OC相似，相對(duì)容易獲得、純度較高。本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[17-19]，采用正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞加用RANKL+M-CSF的方法誘導(dǎo)培養(yǎng)OLC，為MBD的體外研究提供可靠的細(xì)胞來源。

OC從發(fā)育、成熟、活化再到發(fā)揮骨吸收功能經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜、多級(jí)的調(diào)節(jié)過程，而OC的分化和成熟是調(diào)控整個(gè)骨吸收過程的重要靶點(diǎn)，RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)在介導(dǎo)OC分化和成熟方面起到關(guān)鍵的作用。RANKL與OC和破骨前體細(xì)胞膜表面表達(dá)的RANK結(jié)合，能促進(jìn)OC的分化、成熟，增強(qiáng)其活性，抑制凋亡[20]。本研究中OLC不表達(dá)RANKL，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。成熟的OC和OLC分泌并高表達(dá)TRAP，且具有噬骨功能[8]。本試驗(yàn)中OLC表達(dá)TRAP，并能在牙質(zhì)片層片上形成骨吸收陷窩，也驗(yàn)證了本研究誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞為OLC；而且試驗(yàn)結(jié)果顯示共培養(yǎng)組和NSE組TRAP的表達(dá)上調(diào)，提示在體外MM細(xì)胞和NSE能增強(qiáng)OLC的活性。

烯醇化酶是參與糖酵解途徑中2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇式丙酮酸的限速酶，它由α、β、γ亞基以二聚體形式組成免疫性質(zhì)不同的αα、ββ、γγ、αγ、αβ 5種同工酶；其中γγ、αγ主要存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，稱為NSE[22]。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)正常的T和B淋巴細(xì)胞在特定發(fā)展階段也表達(dá)NSE[23]，這說明NSE不是神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的。Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)在體外NSE能促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，并認(rèn)為NSE是一種神經(jīng)細(xì)胞生存和營養(yǎng)因子。MM細(xì)胞株U266表達(dá)NSE，MM患者血清中也發(fā)現(xiàn)NSE水平明顯升高，且與臨床分期、骨損害程度及治療效果存在相關(guān)性。應(yīng)用NSE處理OLC，TRAP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)，提示NSE促進(jìn)OLC的分化和增殖；NSE具有U266細(xì)胞對(duì)OLC的類似作用；推測(cè)NSE可能通過細(xì)胞代謝或作為營養(yǎng)因子起作用，但是否有其他某種方式的參與尚不清楚，目前國內(nèi)外亦無這方面研究的報(bào)道，值得進(jìn)一步探討。

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Study on effect of NSE and U266 cell line on osteoclast-like cells*

YuanZhongtao1,QingChen2,LiXiaojin3,ZhangXuemei1,ShiMingxia1,HuangYing1,LiHuimin1△

(1.DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China; 2.CollegeofPharmacy,KeyLaboratory,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500,China; 3.DepartmentofHematology,FourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650021,China)

Objective To explore the functions of neuron-specific enolase(NSE) and human multiple myeloma U266 cells on osteoclast-like cells(OLC) function.Methods Normal human peripheral blood mononuclear cells were induced and cultured by adding RANKL and M-CSF to get OLC;the experiment was divided into 3 groups,the NSE group:OLC were cultured in the 6-well culture plate for 14 d and added with 100 ng/mL recombinant human NSE to culture for 24,48,72 h;the co-culture group:OLC were cultured in the lower well of 6-well Transwell chamber for 14 d,then added with 1×105/well U266 cells in each upper well and conducted the co-culture for 24,48,72 h;the control group:OLC were cultured alone.The influences of NSE and U266 cell line on RANKL,OPG,IL-6 and TRAP mRNA transcriptional level of OLS were compared by using real-time fluorescent quantitative PCR.Results RANKL,OPG,IL-6 mRNA had no expression on OLC in the co-culture group,NSE group and control group;compared with control group，the TRAP mRNA expression level in the co-culture group and the NSE group was increased,the difference was statistically significant(P<0.01);the increase of TRAP mRNA expression level was obvious especially at 48,72 h.Conclusion OLC expressing TRAP and NSE may be one of the factors for promoting OLC differentiation and maturation in myeloma bone disease,prompting that NSE could increase the OLC viability.

phosphopyruvate hydratase;myeloma bone disease;osteoclast;acid phosphatase

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2007C0037R)。

袁忠濤(1974-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事血液腫瘤研究。
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，E-mail:lihuimin@medmail.com.cn。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.004

R783.5

A

1671-8348(2016)10-1309-04

2015-12-15

2016-01-22)