羅 娟，成國祥，袁渝萍，張愛民，劉雪芳，劉思國，邊 莉，陳建泉，張 磊，董向前，楊 剛，南 瓊，馬嵐青△

(1.云南省消化疾病研究所/昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032；2.杰隆生物工程有限公司，上海 200000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 650032)

重組人乳鐵蛋白對幽門螺桿菌抑菌作用的實驗研究*

羅 娟1，成國祥2，袁渝萍1，張愛民2，劉雪芳1，劉思國2，邊 莉3，陳建泉2，張 磊1，董向前1，楊 剛1，南 瓊1，馬嵐青1△

(1.云南省消化疾病研究所/昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650032；2.杰隆生物工程有限公司，上海 200000；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 650032)

目的 評估重組人乳鐵蛋白(rhLF)對幽門螺桿菌(H.pylori)的抑菌作用及其對細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)、尿素酶(Ure)和胃黏膜白細(xì)胞介素8(IL-8)的影響。方法 測定最低抑菌濃度(MIC)和不同藥物濃度對H.pylori增殖的影響。通過實時定量PCT和Western blot檢測rhLF對H.pylori CagA和Ure的mRNA和蛋白表達(dá)的影響。動物實驗，144只BABL/c小鼠，分為4組，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)+rhLF組(A組)、rhLF組(B組)、標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)組(C組)、生理鹽水組(D組)，組織病理學(xué)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察不同分組間胃黏膜炎性反應(yīng),ELISA法檢測各組胃組織IL-8水平。結(jié)果 MIC為0.5 mg/mL,且rhLF抑制細(xì)菌生長增殖呈現(xiàn)濃度依賴性過程。rhLF能降低H.pylori主要毒力因子CagA、Ure mRNA和蛋白的表達(dá)。A組胃黏膜組織炎癥積分和勻漿液IL-8水平與B、C、D組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 rhLF抑制H.pylori生長及增殖，并不同程度抑制H.pylori主要毒力因子CagA、Ure mRNA及蛋白的表達(dá)，削弱該菌的致病性，同時降低小鼠胃黏膜IL-8水平，減輕H.pylori相關(guān)性胃黏膜炎性反應(yīng)。

螺桿菌，幽門；乳鐵蛋白；細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A；尿素酶；白細(xì)胞介素8

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是引起慢性胃炎和消化性潰瘍的常見病原菌[1-2]，它的致病性與其分泌的許多毒力因子相關(guān)，包括尿素酶(Ure)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)和空泡毒素A等[3-5]。這些毒力因子在引起病變的過程中發(fā)揮不同的作用，其中CagA是H.pylori最重要的毒力因子之一[6]，由CagA基因編碼。CagA與胃上皮表面相互作用引起級聯(lián)反應(yīng)，強(qiáng)烈干擾細(xì)胞的信息傳導(dǎo)通路，通過各種機(jī)制引起病理性細(xì)胞應(yīng)答，如活力、程序性細(xì)胞凋亡和形態(tài)學(xué)的改變。實驗研究表明，慢性胃炎程度與CagA的陽性率相關(guān)，提示CagA與炎性細(xì)胞的浸潤有關(guān)[7]。Ure對H.pylori有保護(hù)作用[8]，但對宿主直接毒性作用造成胃黏膜屏障的損害，并且通過免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)引起損傷。CagA能誘導(dǎo)胃黏膜組織產(chǎn)生更多的白細(xì)胞介素8(IL-8)，從而加強(qiáng)H.pylori對胃黏膜損傷的作用。近年來H.pylori根除率呈逐年下降趨勢，其對抗菌藥物的耐藥率逐年增加[9-11]，故尋找非抗菌藥物的其他治療成為必要。

乳鐵蛋白(lactoferrin)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白[12]，具有抗炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和鐵離子結(jié)合功能。乳鐵蛋白被認(rèn)為是一種天然免疫因子和廣譜抗菌劑[13]，國外已有少數(shù)報道牛乳鐵蛋白抗H.pylori的效果，但乳鐵蛋白抗H.pylori作用的結(jié)論具有不確定性。本文旨在探討重組人乳鐵蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF)抗H.pylori作用及相關(guān)機(jī)制的研究，為rhLF聯(lián)合基礎(chǔ)方案治療H.pylori感染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及動物 H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504由上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科陸紅教授饋贈；健康成年BABL/c小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供。

1.1.2 實驗藥物及試劑 rhLF由杰隆生物工程有限公司提供；哥倫比亞培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基購自青島海博；胎牛血清購自美國Thermo Fisher 公司，微需氧產(chǎn)氣袋購自日本Mitsubishi公司，混合抗菌藥物購自北京寶生物公司，實時定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自日本Takara公司；抗-CagA抗體、抗-Ure抗體購自美國Santa公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 密閉厭氧盒(日本Mitsubishi公司)；超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；快速梯度PCR儀(德國Effendorf公司)；ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；真空凍干機(jī)(SP公司VirTis,2KBTES-55)

1.2 方法

1.2.1 H.pylori的培養(yǎng)和鑒定 H.pylori菌株接種于制備好的哥倫比亞完全培養(yǎng)基中，均勻涂布，厭氧培養(yǎng)盒中微需氧產(chǎn)氣袋環(huán)境下,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行菌種鑒定，取對數(shù)生長期細(xì)菌，采用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后測細(xì)菌光密度(OD)600 nm值(OD=1×109CFU/L),調(diào)整細(xì)菌濃度為1×109CFU/L進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 測定rhLF對H.pylori最低抑菌濃度(MIC) 分別采用固體及液體法按照美國臨床實驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)制訂的倍比稀釋法經(jīng)預(yù)實驗了解rhLF抑菌的濃度范圍后，將rhLF以4 mg/mL開始作連續(xù)6次倍比稀釋，制備成各種濃度的培養(yǎng)基，使rhLF的終濃度為：2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063 mg/mL,取100 μL 1×109cfu/L對數(shù)生長期菌液接種于含不同藥物濃度的培養(yǎng)基中，每個濃度做3個復(fù)板，固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后觀察細(xì)菌生長情況，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后再接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。以無細(xì)菌生長平皿的最小藥物濃度作為該藥物的MIC。

1.2.3 rhLF、Fe3+對H.pylori生長的影響 H.pylori培養(yǎng)于含不同rhLF濃度的腦心浸液液體培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，固定培養(yǎng)板，37 ℃，180 r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)，分別于0、8、16、24、32、40、48、56、64 h測定細(xì)菌菌液OD600 nm并更換一次產(chǎn)氣袋，觀測rhLF對細(xì)菌生長曲線的影響。并在MIC環(huán)境中加入不同濃度的高氯酸鐵或檸檬酸鐵拮抗rhLF鐵結(jié)合能力，觀察H.pylori生長情況。

1.2.4 RT-PCR 使用Trizol試劑提取不同rhLF濃度作用下的H.pylori總RNA，測定各樣本的OD260 nm和OD280 nm，并行普通電泳檢測RNA質(zhì)量，選取OD260 nm/OD280 nm>1.8，RNA質(zhì)量佳者進(jìn)行后續(xù)實驗，用相當(dāng)于1 μg RNA采用primeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒，兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系及方法具體參照試劑盒說明書進(jìn)行。按照SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(Takara)說明書，每個樣本行3個副孔實驗，以cDNA為模板，16 s RNA為內(nèi)參，分析CagA、Ure表達(dá)水平，CagA引物為：正向5′-GGG CGT GTT TGA TGA GTC CT-3′，反向5′-TGT ATG TCG GTG GTG GTA GTG-3′，產(chǎn)物長度190 bp；Ure引物為：正向5′-AAC GGC TGG TGG TAT TGA C-3′，反向5′-TTC TTC TGC CTG GAG TGA TAG T-3′，產(chǎn)物長度為149 bp；16 s RNA引物為：正向5′-TGT GGG AGA GGT AGG TGG AA-3′，反向5′-CAT CGT TTA GGG CGT GGA CT-3′，產(chǎn)物長度為168 bp;應(yīng)用Applied Biosystems 7000 Fast RT-PCR system，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s 40個循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線取溶解曲線單峰所得Ct值，并利用其△Ct值進(jìn)行定量，得到處理組相對16s RNA PCR產(chǎn)物的濃度比值。

1.2.5 細(xì)菌總蛋白樣本制備 收集含不同藥物濃度的液體培養(yǎng)細(xì)菌及上清，真空凍干機(jī)(-60 ℃)隔夜處理后，使用RIPA裂解液(強(qiáng))+ PMSF(100 mmol/L)混合試劑提取不同rhLF濃度處理的H.pylori總蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測定樣本蛋白濃度，分裝，-80 ℃保存。

1.2.6 Western blot 取75 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，10%分離膠 80 V 20 min，5%濃縮膠 100 V，60 min。100 mA 恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉TBST封閉1 h，分別加入1∶3 000 CagA(Santa，sc-25766)、Ureα(Santa，sc-21016)、GAPDH(Thermo，GA1R)單抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次(5、15、10 min)，分別加入對應(yīng)的1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次(5、15、10 min)。取等量ECL發(fā)光液(Thermo，NCI4106)混勻，浸膜，曝光3～5 min，顯影3 min，定影1 min，所得條帶使用ImageJ軟件分析各條帶密度值，結(jié)果用目的蛋白/GAPDH密度值之比表示。

1.2.7 動物實驗 取144只BABL/c小鼠分為4組，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)+rhLF組(A組)、rhLF組(B組)、標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)組(C組)、生理鹽水(D組)，H.pylori NCTC 11637灌胃建模，不同藥物處理7 d后處死小鼠，行組織病理學(xué)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察胃黏膜炎性反應(yīng)及ELISA法檢測胃組織IL-8水平。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌鑒定 (1)菌落形態(tài)：平板上的H.pylori菌落肉眼可見圓形、扁平、半透明灰白色小菌落；(2)形態(tài)學(xué)檢查：經(jīng)革蘭染色后，油鏡下觀察可見革蘭陰性、S形、弧形或海鷗型，散在或成簇排列；(3)生化鑒定：快速Ure實驗、觸酶實驗及氧化酶試驗均陽性，可確認(rèn)為H.pylori[14]。

2.2 rhLF對H.pylori生長抑制作用 本實驗采用瓊脂稀釋法和腦心浸液液體法測定rhLF對H.pylori的MIC，結(jié)果顯示其MIC均為0.5 mg/mL.

2.3 不同濃度rhLF及Fe3+對H.pylori生長的影響 本實驗檢測了不同濃度的rhLF對H.pylori生長增殖的影響，選取不同濃度的rhLF干預(yù)H.pylori生長，并以生理鹽水作對照組，結(jié)果顯示：rhLF抑制H.pylori生長繁殖呈現(xiàn)濃度依賴性，且進(jìn)一步驗證rhLF 0.5 mg/mL時H.pylori成完全抑制狀態(tài)，見圖1。同時加入不同濃度的Fe3+拮抗rhLF鐵結(jié)合作用后顯示：(1)培養(yǎng)基中加入25 μmol/L Fe3+后鐵達(dá)到飽和；(2)在培養(yǎng)基中鐵完全飽和的前提下，H.pylori生長仍未達(dá)到對照水平，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Fe3+及rhLF對H.pylori生長的影響

2.4 rhLF對CagA、Ure mRNA影響 采用不同濃度的rhLF干預(yù)細(xì)菌24 h，收集細(xì)菌菌體檢測CagA、Ure mRNA的表達(dá)水平，以加生理鹽水組為對照。結(jié)果顯示：與對照組相比，不同濃度rhLF能抑制H.pylori CagA及Ure的表達(dá)(P<0.05)，圖3。

A：CagA;B:Ure。

圖3 rhLF對H.pylori CagA、Ure mRNA的影響

2.5 rhLF對H.pylori CagA、Ure蛋白的影響 采用不同濃度的rhLF干預(yù)細(xì)菌24 h，收集細(xì)菌菌體及培養(yǎng)上清液檢測CagA、Ure 蛋白的表達(dá)水平，以加生理鹽水組為對照。結(jié)果顯示：與對照組相比rhLF能抑制H.pylori 毒力因子相關(guān)蛋白CagA及Ure的表達(dá)(P<0.05),見圖4、5。

1：0.4 mg/mL rhLF組;2：0.3 mg/mL rhLF組;3：0.2 mg/mL rhLF組;4：對照組。

圖4 rhLF對H.pylori CagA蛋白表達(dá)的影響

1：0.4 mg/mL rhLF組;2：0.3 mg/mL rhLF組;3：0.2 mg/mL rhLF組;4：對照組。

圖5 rhLF對H.pylori Ure蛋白表達(dá)的影響

2.6 動物實驗 與D組比較，A、B、C 3組炎癥程度積分明顯降低(P<0.05)；與B組比較，A、C組炎癥積分明顯降低(P<0.05)；與C組比較，A組炎癥積分明顯降低(P<0.05)，見圖6；ELISA檢測小鼠胃黏膜組織勻漿液中IL-8水平，結(jié)果見表1。

A:A組；B:B組；C:C組；D:D組。

圖6 各組胃黏膜組織HE染色鏡檢形態(tài)學(xué)比較(×300)

a:P<0.05，與A組比較。

3 討 論

H.pylori為慢性胃炎和十二指腸潰瘍的主要致病因素，同時與胃潰瘍關(guān)系密切。目前針對H.pylori的主要治療為以抗菌藥物為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)或四聯(lián)治療方案[15-16]為主，隨著根除治療的普及和抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，H.pylori對抗菌藥物耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重[17]，對抗菌藥物的耐藥成為根除失敗的首要因素[18]。這也促使人們轉(zhuǎn)換思維，從新的視角去審視H.pylori的治療方案。rhLF是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的，既解決了來源問題，并能特異結(jié)合胃內(nèi)人乳鐵蛋白受體，更符合人體利用的分子特點。國外已有少許研究觀察了牛乳鐵蛋白抗H.pylori的作用，Dial等[19]的研究顯示牛乳鐵蛋白抗與H.pylori共培養(yǎng)，其濃度大于或等于0.5 mg/mL可抑制H.pylori的增殖，對人乳鐵蛋白抗H.pylori的研究方面，Miehlke等[20]體外實驗發(fā)現(xiàn)對13株臨床分離菌株具有抑制作用。本研究觀察到rhLF對H.pylori具有明顯生長抑制作用，其MIC與Dial等[19]研究結(jié)果相符，結(jié)果顯示rhLF對H.pylori抑制作用呈濃度依賴型作用效果。已有研究顯示乳鐵蛋白通過螯合Fe3+限制細(xì)菌生長所必需的金屬離子[13]，此為其抗菌作用的基礎(chǔ)，本實驗觀察了其抑菌作用是否僅為其鐵結(jié)合能力所致，結(jié)果顯示，在提供充足的鐵以拮抗rhLF鐵結(jié)合力后，H.pylori仍然受到不同程度的抑制，提示rhLF抗H.pylori作用為多種機(jī)制參與的結(jié)果。

本研究繼續(xù)在CagA、Ure等H.pylori主要毒力因子形成的mRNA及蛋白表達(dá)水平上進(jìn)一步論述了rhLF抗H.pylori的可能作用機(jī)制，結(jié)果顯示，rhLF對菌體及其分泌的CagA、Ure mRNA和蛋白具有不同程度的抑制作用,從而可能減弱了H.pylori致病性。

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，rhLF聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法可以降低小鼠胃黏膜HE染色炎癥程度的積分，減輕胃黏膜炎性損傷程度，且減輕胃黏膜炎性損傷作用優(yōu)于單獨使用rhLF或標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法。H．pylori主要通過微生物Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typesecretion system，TISS)將CagA基因編碼的毒力蛋白過度表達(dá)與分泌，進(jìn)而將大量嗜中性粒細(xì)胞趨化到胃黏膜部位，并導(dǎo)致炎性反應(yīng)的加重[21]，注入胃黏膜上皮細(xì)胞中，并誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞IL-8 過度表達(dá)與分泌。本研究顯示：rhLF可以降低IL-8在H.pylori感染的小鼠胃黏膜表面的水平，從而減輕胃黏膜炎性反應(yīng)。

雖然本研究顯示rhLF對H.pylori具有抑制生長、減弱致病性，同時保護(hù)胃黏膜、減輕炎性反應(yīng)等特點，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究?？傊?，其在治療消化道疾病方面的價值值得開發(fā)研究。

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Experimental study on bacteriostatic effect of recombinant human lactoferrin on Helicobacter pylori*

LuoJuan1，ChengGuoxiang2,YuanYuping1，ZhangAiming2，LiuXuefang1，LiuSiguo2，BianLi3，ChenJianquan2，ZhangLei1，DongXiangqian1，YangGang1，NanQiong1，MaLanqing1△

(1.YunnanProvincialResearchInstituteofDigestiveDiseases/DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China；2.JielongBioengineeringCo.,Ltd.,Shanghai200000,China; 3.DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To evaluate the bacteriostatic effect of recombinant human lactoferrin(rhLF) on Helicobacter(H.) pylori and its influence on CagA,Ure and gastric mucosal IL-8.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)and the influence of different drug concentrations on the proliferation of H.pylori were detected.The effects of rhLF on the mRNA and protein expressions of CagA and Ure in H.pylori were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.The animal study:Balb/c mice were adopted and assigned randomly into four groups，including the standard triple+rhLF(group A),rhLF(group B),standard triple(group C) and normal saline(group D).The histopathological HE staining was used to observe the gastric inflammation and ELISA was used to detect the IL-8 level of gastric tissue in each group.Results MIC was 0.5 mg/mL,moreover rhLF inhibited the bacterial growth and proliferation with a concentration-dependent manner.rhLF could reduce the expression of H.pylori major virulence factor CagA,mRNA and protein of Ure.Comparing the group A with the group B,C and D,the gastric mucosal inflammation score and the IL-8 levels of gastric tissue homogenates had statistically significant differences(P<0.05).Conclusion rhLF inhibits the growth and proliferation of H.pylori,moreover inhibit the expression of major virulence factor CagA in H.pylori,mRNA and protein of Ure in different degrees,weakens its pathogenicity,meanwhile reduces the IL-8 level in mice gastric mucosa,and alleviates H.pylori related gastric mucosal inflammatory response.

helicobacter pylori；lactoferrin;cytotoxin associated gene A；urease；interleukin-8

云南省聯(lián)合專項基金資助項目(2012FB027)。

羅娟(1985-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化內(nèi)科基礎(chǔ)和臨床研究。
△

，E-mail:malanqing@aliyun.com。。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.10.002

R573

A

1671-8348(2016)10-1302-04

2015-12-18

2016-01-25)