謝三磊，文鳳云，李俊強，王 晴，梁 鈺，劉藝婷，李 磊，陳 藝

（河南科技大學動物科技學院，洛陽471003）

黑羽鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性及其與產蛋性狀的相關性分析

謝三磊，文鳳云＊，李俊強，王 晴，梁 鈺，劉藝婷，李 磊，陳 藝

（河南科技大學動物科技學院，洛陽471003）

摘 要：試驗旨在研究鵪鶉雌激素受體β亞基（ESRβ）基因外顯子多態(tài)性及其與產蛋性能的關聯性，為鵪鶉產蛋性能候選基因的確立及分子標記輔助選育提供理論依據。選取健康蛋用黑羽鵪鶉為研究對象，開產后進行生產性能的持續(xù)統(tǒng)計（60d），采用PCR－SSCP法對鵪鶉ESRβ基因多態(tài)性進行檢測，并運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行ESRβ基因多態(tài)性與生產性能的相關性分析。PCR－SSCP檢測結果發(fā)現，ESRβ基因外顯子1、3、4、5、6、7和8均存在單核苷酸多態(tài)性。相關性分析結果表明，在開產蛋質量上，外顯子3CD基因型與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）；在開產日齡上，外顯子5DD基因型與CD和CC基因型有顯著性差異（P＜0.05）；在平均蛋質量上，外顯子7CD基因型與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）。表明ESRβ基因與蛋用黑羽鵪鶉產蛋性狀有一定關聯性。

關鍵詞：鵪鶉；ESRβ基因；外顯子；SNPs；產蛋性能

鵪鶉蛋營養(yǎng)豐富，相比烏雞蛋和普通雞蛋，其蛋白質含量最高，且磷脂含量也較高［1］，故有“卵中佳品”之美稱［2］。鵪鶉還具有較高的藥用價值，對高血壓、結核和代謝障礙等疾病有一定的治療作用［3］。然而影響鵪鶉生產性能與繁殖性能的因素很多，其遺傳力低［4］，通過常規(guī)選育進展較為緩慢。在分子標記基礎上建立新一代分子育種技術已成為提高動物生產性能的重要研究方向之一。1940年，日本學者Shimakura首次對鵪鶉形態(tài)遺傳標記進行了研究，報道了鵪鶉的羽色突變遺傳現象。Masaoke－Tsudzuke［5］則對鵪鶉毛色、喙形、腳趾形狀及蛋殼顏色等形態(tài)標記進行了報道。付晶等［6］以北京白羽蛋用鵪鶉為研究對象，篩選出了能夠準確鑒定鵪鶉性別的CHD基因標記。王旭等［7］利用生物信息學方法開發(fā)出鵪鶉的6個EST－SSR新的分子標記，并在北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉中檢測其多態(tài)性，結果表明6個標記均可用于鵪鶉的遺傳多樣性分析。目前，在鵪鶉遺傳分析方面雖然取得了一些成果，但相比之下，中國對鵪鶉的遺傳研究報道數量仍然較少，且研究進展緩慢，研究內容尚不夠深入，尤其是在分子遺傳研究領域還存在大量的研究工作有待開展。

雌激素受體（estrogen receptor，ESR）基因廣泛存在于各種動物體中，是一種配體激活轉錄因子家族中的核酸受體［8］，能夠與特異激素應答DNA元件相結合，進而改變雌激素調控的基因轉錄，影響動物的繁殖性狀及其他生產性能［9］。ESR基因主要有3種亞型：ESRα、ESRβ和ESRγ，分別由不同的基因編碼［10］。本研究選擇與雌性繁殖周期中卵泡生長發(fā)育密切相關的ESRβ基因，以蛋用黑羽鵪鶉作為試驗動物，采用PCR－SSCP方法檢測單核苷酸多態(tài)性，建立鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產蛋性狀的相關性，旨在探討ESRβ基因是否為鵪鶉產蛋性狀的主效基因或主效基因的連鎖基因，從而利用ESRβ基因進行標記輔助選擇，為培養(yǎng)出產蛋性能更高的新型母本群體、提高其繁殖性能提供依據。

1 材料與方法

1.1鵪鶉飼養(yǎng)及產蛋情況記錄

蛋用黑羽鵪鶉，共60只，由河南科技大學龐有志老師友情饋贈。鵪鶉飼養(yǎng)采取個體籠養(yǎng)方式。采用鯤鵬飼料有限公司提供的蛋用鵪鶉產蛋后期配合飼料飼喂。

鵪鶉孵化飼養(yǎng)，從開產（7周齡左右）時對鵪鶉群體進行產蛋記錄，持續(xù)記錄2個月（4月16日—6月16日），以獲取開產日齡、開產蛋質量、60d產蛋數和60d平均蛋質量等表型數據。

1.2基因組DNA提取

采用禽類全血基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國生物技術有限公司）提取蛋用黑羽鵪鶉全血基因組，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設計

根據GenBank中鵪鶉ESRβ基因全序列（登錄號：AF045149）信息，用在線軟件（http：／／genome.ucsc.edu／cgi－bin／hgBlat？command＝start）進行外顯子序列查找。應用Primer Premier 5.0設計引物，引物信息見表1。

表1　鵪鶉ESRβ基因各外顯子的引物序列Table 1 Primer sequences ofESRβgene exons in quail

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為20μL：模板DNA 1μL，10× Buffer 2μL，2.5mmol／L dNTP 1μL，上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O補足20μL。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性30s，退火（退火溫度見表1）45s，72℃延伸50s，30個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5PCR－SSCP分型

將鑒定正確的PCR產物，加入10μL變性上樣緩沖液，煮沸10min，迅速冰浴10min，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染，拍照保存結果。根據PCR－SSCP電泳圖譜，確定純合子及雜合子帶型。

1.6統(tǒng)計分析

統(tǒng)計鵪鶉ESRβ基因各外顯子的不同基因型檢出個數，計算基因頻率和基因型頻率。運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行基因型與產蛋性狀關聯分析，結果以平均值±標準誤表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR擴增

分別對鵪鶉ESRβ基因外顯子1、3、4、5、6、7、8序列進行PCR擴增，擴增片段與預期片段大小一致，部分擴增結果見圖1，PCR產物經瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化后直接進行PCR－SSCP電泳分析。

圖1　鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification ofESRβgene exons in quail

2.2鵪鶉ESRβ基因外顯子PCR－SSCP結果

鵪鶉ESRβ基因各外顯子基因型均有3種：CC、CD、DD。外顯子1的PCR－SSCP檢測結果見圖2。

圖2　鵪鶉ESRβ基因外顯子1PCR－SSCP結果Fig.2 PCR－SSCP result ofESRβgene exon 1in quail

2.3 鵪鶉ESRβ基因外顯子基因頻率與基因型頻率

鵪鶉ESRβ基因各外顯子基因頻率及基因型頻率計算結果見表2。由表2可知，ESRβ基因外顯子1兩個等位基因C和D頻率分別為0.56和0.44；外顯子4各基因型頻率基本相等；外顯子5中CD基因型頻率為優(yōu)勢基因型；外顯子3、6、7中等位基因C占絕對優(yōu)勢；外顯子8中等位基因C、D基因頻率分別為0.517和0.483。

經卡方檢驗表明，鵪鶉外顯子3、5達到顯著水平（P＜0.05），外顯子7達到極顯著水平（P＜0.01），處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。表明由于長期有目的的人工選育，使群體處于Hardy－Weinberg不平衡狀態(tài)。

表2　鵪鶉ESRβ基因外顯子基因頻率及基因型頻率Table 2 The gene frequency and genotype frequency ofESRβgene exons in quail

2.4鵪鶉ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產蛋性狀的相關性

通過SPSS 13.0軟件對黑羽鵪鶉的開產日齡、開產蛋質量、60d平均蛋質量等產蛋相關性狀進行分析，獲得黑羽鵪鶉不同基因型與早期產蛋性狀間相關分析結果見表3。由表3可知，ESRβ基因外顯子1、4、6和8多態(tài)性位點在開產蛋質量、平均蛋質量、蛋形指數及開產日齡上，3種基因型均沒有顯著差異（P＞0.05）；外顯子3多態(tài)性與鵪鶉產蛋性狀的關系中，CD基因型開產蛋質量與CC和DD基因型有顯著性差異（P＜0.05）；外顯子5多態(tài)性與鵪鶉產蛋性狀關系中，DD基因型在開產日齡上與CD和CC基因型有顯著性差異（P＜0.05）；外顯子7多態(tài)位點與鵪鶉產蛋性狀關系中，CD基因型在平均蛋質量上與CC和CD基因型有顯著性差異（P＜0.05）。另外，外顯子1在開產日齡上DD基因型較CC和CD基因型占優(yōu)勢；外顯子3在平均蛋質量上CD基因型略大于CC和DD基因型，但差異不顯著（P＞0.05）；外顯子4在開產蛋質量上CD基因型略大于CC和DD基因型，而外顯子6在開產蛋質量上則是DD基因型略大于CC和CD基因型，但差異均不顯著（P＞0.05）；外顯子8在開產日齡上為DD基因型占有優(yōu)勢，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3　ESRβ基因外顯子多態(tài)性與鵪鶉產蛋性狀相關性分析Table 3 Association between polymorphisms and laying performance ofESRβgene exons in quail

3 討 論

為了從分子水平上揭示朝鮮鵪鶉、中國黃羽鵪鶉和中國黑羽鵪鶉3個群體遺傳結構和親緣關系，白俊艷等［11］對3個群體進行了微衛(wèi)星標記的多態(tài)性分析，結果發(fā)現，中國黃羽鵪鶉群體遺傳多樣性最為豐富。龐有志等［12］對北京白羽鵪鶉群體的9個微衛(wèi)星標記遺傳多樣性分析結果表明，在9個微衛(wèi)星標記中共存在43個等位基因，有8個微衛(wèi)星基因座為高度多態(tài)性標記，可作為北京白羽鵪鶉群體遺傳多樣性分析的有效遺傳標記。吳勝軍等［13］利用微衛(wèi)星標記技術對朝鮮鵪鶉群體的9個微衛(wèi)星座位進行了遺傳多樣性分析，結果共檢測出了44個等位基因，表明朝鮮鵪鶉也是遺傳多樣性較為豐富的群體?；騿魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因組中單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性［14］。SNP作為第3代分子標記在分子遺傳學方面發(fā)揮著重要的作用［15］。SNP具有數量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點［16］，與人類的許多疾病、動物的生產性能［17］等密切相關。本研究通過對蛋用黑羽鵪鶉ESRβ基因外顯子進行SNP分析，統(tǒng)計鵪鶉的產蛋性狀，探討鵪鶉ESRβ基因外顯子與黑羽鵪鶉產蛋性能的相關性，為新型蛋用鵪鶉品系的培育工作提供理論依據。

ESR具有轉錄調控蛋白質的功能［18］，影響著雌激素基因在雌性脊椎動物組織的表達與調控，在胚胎的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用［19］。美國IOWA州立大學Rothschild研究組發(fā)現，ESRβ基因的PvuⅡ酶切位點多態(tài)性，BB基因型比AA基因型母豬產活仔數／胎多0.44～1.15頭［9］，陳克飛等［20］也得到同樣的研究結果。徐寧迎等［21］發(fā)現，ESR基因和催乳素受體基因（prolactin receptor，PRLR）對金華母豬所有胎次的總產仔數和產活仔數有顯著的交互作用，對經產的初生仔重有極顯著的交互作用。Wu等［22］研究結果也表明，ESR基因可以作為長白豬同胎產仔數的選育標記。對小尾寒羊ESR基因的研究結果也提示，ESR基因可能是控制小尾寒羊多胎性能的一個主效基因或與之存在緊密的遺傳連鎖［23］。在家禽方面，ESR基因也表現出與生產性能密切的關聯性。周俊等［24］對ESR基因與綠殼蛋雞早期產蛋性能相關性研究發(fā)現，ESR基因5′側翼調控區(qū)的CC和CD基因型36周平均產蛋量差異顯著。王洪才等［25］對莊河大骨雞研究結果表明，ESR基因各基因型在產蛋數和蛋料比上存在顯著差異。于吉英等［26］對文昌雞繁殖性狀與ESR基因多態(tài)性關系研究結果表明，ESR基因多態(tài)性與300日齡產蛋數相關性顯著，與個體平均連產天數的相關性極顯著。湯青萍等［27］在海南文昌雞的研究中得到一致結果，ESR基因多態(tài)與產蛋性狀中的300日齡產蛋數顯著相關，與平均連產天數極顯著相關，與400日齡產蛋數、雙黃蛋數相關性不顯著。以上研究結果表明，ESR基因存在單核苷酸多態(tài)性，且與畜禽生產性狀密切相關。本研究結果發(fā)現，ESRβ基因外顯子3與開產蛋質量顯著相關；外顯子5各基因型與開產日齡顯著相關；外顯子7與平均蛋質量顯著相關。表明ESRβ基因對蛋用黑羽鵪鶉產蛋性狀有一定作用。但由于試驗個體數目及統(tǒng)計時長等的局限性，僅僅關聯性分析的結果還不能確定該基因是否可以作為影響鵪鶉產蛋性狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標記基因而起作用，有待進一步研究證實。

4 結 論

本研究在蛋用黑羽鵪鶉群體中分析ESRβ基因外顯子多態(tài)性與產蛋性能的相關性，發(fā)現ESRβ基因與鵪鶉產蛋性能有一定的相關性，但是否可以利用ESRβ基因進行標記輔助選擇，還需要進一步驗證。

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（責任編輯 晉大鵬）

中圖分類號：S813.3

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3293－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.031

收稿日期：2016－05－18

基金項目：國家自然科學基金（31301940）；河南科技大學研究訓練計劃（SRTP）項目（2009100）

作者簡介：謝三磊（1987－），男，河南許昌人，學士，研究方向：獸藥殘留的快速檢測，E－mail：xiesanlei＠163.com

通信作者：＊文鳳云（1979－），女，陜西咸陽人，博士，講師，研究方向：動物生物化學與分子生物學，Tel：0379－64282341；E－mail：newwfyun＠163.com

Single Nucleotide Polymorphisms inESRβGene of Black Plumage Quail and Its Association with Egg Production

XIE San－lei，WEN Feng－yun＊，LI Jun－qiang，WANG Qing，LIANG Yu，LIU Yi－ting，LI Lei，CHEN Yi
（CollegeofAnimalScienceandTechnology，HenanUniversityof ScienceandTechnology，Luoyang471003，China）

Abstract：This study aimed to investigate the correlation betweenESRβgene exon polymorphism and egg production of Black plumage egg quail，and provide the theoretical foundation for molecular selection.The healthy Black plumage egg quail were selected as research object，and the egg production were analyzed using SPSS 13.0software.Estrogen receptorβ（ESRβ）subunit gene was selected as candidates gene to screen the genomic variation by PCR－SSCP，and the association of theESRβgene polymorphisms with egg production were analyzed.The results of polymorphisms detection showed that exon 1，exon 3，exon 4，exon 5，exon 6，exon 7and exon 8ofESRβ gene all had nucleotide variation.The association analysis results ofESRβgene exons and egg production showed that the egg weight of first laying of exon 3CD genotype were significantly higher than that of CC and DD genotypes（P＜0.05）.The age at first laying of exon 5was also significant difference between DD and CC，CD genotypes（P＜0.05）.Moreover，the average egg weight of exon 7CD genotype was significant higher than that of CC and DD genotypes（P＜0.05）.These data suggested thatESRβgene could significantly affect egg production of Black plumage egg.

Key words：quail；ESRβgene；exon；SNPs；egg production