沙日耐，俄廣鑫，王 晨，韓建林

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特010010；3.西南大學(xué)，重慶400416；4.中山大學(xué)，廣州510006）

牦牛KAP1家族基因長度多態(tài)研究

沙日耐1，2，俄廣鑫3，王 晨4，韓建林1＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特010010；3.西南大學(xué)，重慶400416；4.中山大學(xué)，廣州510006）

摘 要：試驗(yàn)旨在研究牦牛角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白1（keratin associated protein 1，KAP1）家族基因長度多態(tài)與重復(fù)序列特點(diǎn)。研究對(duì)牦牛和黃牛KAP1家族基因進(jìn)行測序，并與綿羊已知序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛KAP1家族位于19號(hào)染色體，根據(jù)綿羊KAP1家族基因在染色體上的位置與相似性，重新命名了牛KAP1家族基因B2D、B2A、KAP1－1和B2C為KAP1－4、KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3（按照染色體上的基因順序）。KAP1家族基因之間在3′和5′端區(qū)域高度保守，中間有重復(fù)序列長度差異，其中牦牛KAP1－KAP4基因發(fā)現(xiàn)有30bp的長度多態(tài)。研究其蛋白序列發(fā)現(xiàn)5個(gè)氨基酸為基序的重復(fù)序列B（CCQTS）A1（CCQPT），以及一個(gè)新的重復(fù)序列C（SIQTS）。本研究結(jié)果說明重復(fù)序列是KAP1家族基因間和基因內(nèi)的主要差異區(qū)域，這可能與其角蛋白結(jié)合螺旋數(shù)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：KAP1家族基因；牦牛；長度多態(tài)；重復(fù)序列

角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（keratin－associated proteins， KAPs）主要是與角蛋白相結(jié)合并共同形成毛發(fā)的主干［1］。基于其蛋白序列的相似性KAPs被分為23個(gè)家族［2］。KAP蛋白根據(jù)氨基酸特點(diǎn)又被分為3類［3－4］：第一類為高甘氨酸酪氨酸蛋白（HGT），由KAP6－8、KAP18－22家族編碼；第二類為高硫蛋白（HS，≤30mol%cysteine），由KAP1－3、KAP10－16和KAP23家族編碼；第三類為超高硫蛋白（UHS，＞30mol%cysteine），由KAP4、KAP5、KAP9和KAP17家族編碼［5－6］。KAP1、KAP2、KAP3、KAP11－1、KAP13、KAP15和KAP23等高硫角蛋白在皮質(zhì)層（cortex）中表達(dá)，KAP11和KAP13在角質(zhì)層（cuticle）中表達(dá)，還有KAP11的其他家族基因和KAP13在毛發(fā)基質(zhì)（matrix）中表達(dá)［7－8］。超高硫家族KAP4、KAP5、KAP8、KAP10、KAP12和KAP17，以及高甘氨酸酪氨酸家族蛋白KAP6－8、KAP9－12都在皮質(zhì)層中表達(dá)，KAP19在角質(zhì)層表達(dá)，KAP8還會(huì)在毛發(fā)基質(zhì)中表達(dá)［2］。

所有KAP基因都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，其基因大小一般都在1kb以內(nèi)，而且只有1個(gè)外顯子［9－12］，在不同物種中（除個(gè)別例外）同一個(gè)基因的大小相同［2，13－14］。但有些KAP家族基因有長度多態(tài)［12，15－16］，且這一家族基因并沒有統(tǒng)一的轉(zhuǎn)錄方向。KAP基因在染色體上的位置大部分集中在一個(gè)區(qū)域，排列成簇，這一排列的密度又與角蛋白的排列密度相似［17］。而角蛋白KAP1家族基因?qū)儆诟吡蚪堑鞍钻P(guān)聯(lián)蛋白，又名B2家族。人KAP1家族有4個(gè)基因成員：KAP1－1、KAP1－3、KAP1－4和KAP1－5［9］。綿羊KAP1家族也是4個(gè)基因，分別是KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因［18－21］，在人和綿羊上這一家族基因存在長度多態(tài)現(xiàn)象。本研究通過牛基因組序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)牦牛KAP1家族基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并預(yù)測了牦牛這4個(gè)基因的蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，再通過生物信息學(xué)方法與綿羊KAP1家族基因進(jìn)行比較，對(duì)牦牛和牛KAP1家族基因重命名以及對(duì)其蛋白特點(diǎn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1材料

選取60頭牦牛：天?？h天祝白牦牛10頭（TZ）、甘南州甘南牦牛10頭（GN）、嘉黎縣安多縣嘉黎牦牛10頭（AD）、當(dāng)雄縣公塘鄉(xiāng)當(dāng)雄牦牛10頭（GT）、當(dāng)雄縣龍仁鄉(xiāng)當(dāng)雄牦牛10頭（LR），當(dāng)雄縣當(dāng)區(qū)卡鎮(zhèn)當(dāng)雄牦牛10頭（DQK），以及荷斯坦牛6頭（HST）。7個(gè)牛群體信息見表1。

表1　7個(gè)牛群體的信息Table 1 Sampling information of seven populations of yak

1.2主要試劑及儀器

Tris飽和酚購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、HCl、NaCl、NaOH、三氯甲烷、無水乙醇、氯仿、異戊醇均購自北京廣達(dá)恒益公司；蛋白酶K購自Promega公司；TranStrartTaq聚合酶購自全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自Biowest公司。

UV－1000凝膠成像系統(tǒng)購自北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司；超凈工作臺(tái)購自北京昌平長城空氣凈化工程公司；DYY－Ⅲ2穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀購自北京市六一儀器廠；TOMY SS－325型不銹鋼座式消毒器購自日本TOMY公司；ABI 9700PCR儀購自ABI公司；FX－320型電子天平購自日本AND公司；F100Icematic制冰機(jī)、1－15型低溫離心機(jī)均購自Sigma公司；HZS－D水浴振蕩器、可調(diào)式微量移液器均購自Eppendorf公司；超純水儀購自Pall Life Science公司；QL－901漩渦振蕩器購自北京海天友誠科技有限公司；NanoDrop－1000紫外分光光度計(jì)購自NanoDrop Technologies公司。

1.3 DNA提取

DNA通過全血酚抽提法提取，參考《分子克隆試驗(yàn)指南》［22］。使用NanoDrop－1000紫外分光光度計(jì)DNA／RNA測定儀測定DNA濃度，稀釋成100ng／μL，－20℃保存。取3μL DNA溶液和1μL上樣緩沖液混勻，上樣于1.0%瓊脂糖凝膠（含核酸染料）中進(jìn)行檢測。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

通過GenBank中牛KRTAP1－1（登錄號(hào)：NM＿001105369.1）、B2A（登錄號(hào)：XM＿870828.5）、B2C（登錄號(hào)：XM＿001255391.2）和B2D（登錄號(hào)：XM＿592928.6）基因序列在牛4.6.1版基因組中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)KAP1家族的4個(gè)基因位于19號(hào)染色體，參考基因組相應(yīng)區(qū)域片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物信息見表2。

表2　引物序列Table 2 Primer sequences

1.5PCR擴(kuò)增與測序

PCR擴(kuò)增體系：DNA 100ng／mL，上、下游引物1μL，10×Buffer 8μL，dNTP 6μL，Taq酶1μL，ddH2O補(bǔ)足50μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57.8℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化回收后由天三博和諾賽生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

利用Chromas軟件，將測序結(jié)果與測序峰圖進(jìn)行校對(duì)和編輯。利用NCBI MAP查找KAP1家族基因在綿羊與牛染色體上相應(yīng)的位置。利用Mega 5.0軟件包［23］的ClustalW程序進(jìn)行多重比對(duì)，翻譯成蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析。利用KELIGN在線比對(duì)同源性軟件（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／kalign／）對(duì)綿羊、牛和牦牛KAP1家族基因進(jìn)行同源性比對(duì)。通過Mega 5.0進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1、2可知，KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因擴(kuò)增長度分別為617、624、772和590bp，沒有出現(xiàn)雜帶，擴(kuò)增效果較為理想。

圖1　KAP1－2基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR products of yakKAP1－2gene in agarose gel

圖2　KAP1－4、KAP1－3和KAP1－1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR products of yakKAP1－4，KAP1－3andKAP1－1genes in agarose gel

2.2測序結(jié)果

測序結(jié)果以牦牛AD2號(hào)樣的KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因部分雜合位點(diǎn)為例，結(jié)果見圖3。由圖3可知，KAP1－1基因的這個(gè)突變位于CDS區(qū)域的322bp處，T→C會(huì)導(dǎo)致氨基酸變化，脯氨酸替換為絲氨酸；KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因中均沒發(fā)現(xiàn)突變，但其KAP1－4缺失30bp的純合子。說明測序結(jié)果可靠，無明顯雜峰，可以進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

圖3　牦牛AD2的KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of AD2yakKAP1－1，KAP1－2，KAP1－3andKAP1－4genes

2.3KAP1家族基因在染色體上定位與命名

由于還沒有牦牛的全基因組序列，所以根據(jù)?；蚪M序列，在染色體上定位KAP1家族基因，結(jié)果見圖4。由圖4可知，B2D基因位于42 180～42 181kb之間，B2A基因位于42 183～42 184kb，KAP1－1基因位于42 188～42 189kb之間，B2C基因位于42 195～42 197kb之間；綿羊KAP1家族基因在11號(hào)染色體上的41 022～41 038kb之間，根據(jù)染色體上的前后位置，綿羊KAP1－4基因?qū)?yīng)于牛的B2D基因，綿羊KAP1－1基因?qū)?yīng)于牛B2A基因，綿羊KAP1－2基因?qū)?yīng)于牛KAP1－1基因，綿羊KAP1－3基因?qū)?yīng)于牛的B2C基因。為確定對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的基因是不是同源基因，試驗(yàn)進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，綿羊KAP1－4與牛和牦牛B2D聚在一起，綿羊KAP1－3與牛和牦牛的B2C聚在一起，而綿羊KAP1－1和KAP1－2沒有與牛和牦牛的相應(yīng)基因聚類。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，綿羊KAP1家族與牛和牦牛在KAP1－4和KAP1－3基因高度同源，但是KAP1－1和KAP1－2基因上卻沒有那么明顯的差異（圖6）。最終根據(jù)染色體位置將牛KAP1家族基因重新命名，將B2A、KAP1－1、B2C和B2D基因命名為KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4基因。

圖4　牛和羊KAP1家族基因位置Fig.4 Position ofKAP1family genes on cattle and sheep chromosome

圖5　綿羊、牛和牦牛KAP1家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree ofKAP1family genes in sheep，cattle and yak

圖6　利用KELIGN分析綿羊、牛和牦牛KAP1家族基因同源性（%）Fig.6 The similarity ofKAP1family in sheep，cattle and yak using KELIGN analysis

2.3KAP1基因家族氨基酸長度與重復(fù)序列比對(duì)

通過測序發(fā)現(xiàn)牦牛KAP1－4有30bp的長度多態(tài)，所以外顯子分別為411、441及471bp，其KAP1－1、KAP1－2和KAP1－3CDS區(qū)域長度分別為471、501和429bp。在牛中沒有發(fā)現(xiàn)KAP1－4有長度多態(tài)，KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4 CDS區(qū)域長度分別為471、501、429和441bp。將牛和牦牛KAP1家族蛋白序列與綿羊序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖7。由圖7可知，綿羊蛋白序列從長到短是KAP1－4、KAP1－1（有長度多態(tài)，按最長的序列進(jìn)行比對(duì)）、KAP1－2、KAP1－3；牦牛蛋白序列從長到短是KAP1－2、KAP1－1、KAP1－4（有長度多態(tài)，也是按最長的序列進(jìn)行比對(duì)）和KAP1－3；牛蛋白序列從長到短是KAP1－2、KAP1－1、KAP1－4、KAP1－3，這里牛的KAP1－4要比牦牛的KAP1－4短10個(gè)氨基酸，在6個(gè)荷斯坦牛中KAP1－4未發(fā)現(xiàn)長度多態(tài)。綿羊、牦牛和普通牛KAP1家族蛋白比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N端和C端非常保守，在牛和牦牛上基本一致，只有在重復(fù)單元區(qū)域和重復(fù)單元兩邊有所區(qū)別。

圖7　利用Mega 5.0對(duì)綿羊、牛和牦牛KAP1家族蛋白進(jìn)行比對(duì)Fig.7 The alignment of protein sequence of KAP1family in sheep，yak and cattle using Mega 5.0

由圖7可知，牦牛KAP1家族基因有重復(fù)片段的長度多態(tài)，在綿羊、牦牛和牛的氨基酸序列中也發(fā)現(xiàn)了A1和B基序，在本研究中發(fā)現(xiàn)B基序通常以CXXS／T S／T（CXQTS）形式出現(xiàn)，而不都是CCXS／T S／T，但還出現(xiàn)了以SIQTS為基序的重復(fù)單元，暫定為C。牛和牦牛中KAP1－2的重復(fù)單元是：B（CCQTS）A1（CCQPT／I）C（SIQTS）A1（CCQPI／T）C（SIQTS）A1（CCQPI）；KAP1－1牛和牦牛的重復(fù)單元與KAP1－2的相比少了1個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPI）重復(fù)單元，且牦牛的B重復(fù)單元不是CCQTS，而是CRQTS；KAP1－4的全長KAP1－4（157個(gè)氨基酸）與KAP1－1的序列相比也是少了1個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPI）重復(fù)單元，KAP1－4（147個(gè)氨基酸）序列要再少1個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPT）重復(fù)，KAP1－4（137個(gè)氨基酸）再少1個(gè)B（CCQTS）A1（CCQPI），以至于再無重復(fù)區(qū)域。KAP1－3序列少了2個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPT）重復(fù)，且在非重復(fù)區(qū)域比其他這一家族蛋白少1個(gè)GSIG。

3 討 論

3.1KAP1家族蛋白特點(diǎn)

KAP1家族最早在綿羊上被稱為B2家族［13］，是高硫角蛋白家族成員，此家族中有4個(gè)成員，分別是KAP1－1、KAP1－2、KAP1－3和KAP1－4［9］。研究發(fā)現(xiàn)，KAPs中的高硫家族和超高硫家族都有重復(fù)序列。這一氨基酸重復(fù)單元由5個(gè)氨基酸殘基組成，有兩種形式，在人上，A重復(fù)序列是CCXPX，B是CCX S／T S／T。A組合也被分為了兩種：A1（CCQPX）、A2（CCRPX），其中X為任意一個(gè)氨基酸殘基。但在本研究中B重復(fù)序列CXX S／T S／T，并不是CC連續(xù)出現(xiàn)，出現(xiàn)了CL、CR、CG等組合，而且X S／T S／T主要是以QTS形成出現(xiàn)。由高硫氨酸和超高硫蛋白家族的重復(fù)基序特點(diǎn)可以推定其有多種蛋白結(jié)合形式。結(jié)合方式主要有二硫鍵（IF蛋白頭尾端半胱氨酸與A和B重復(fù)基序里的半胱氨酸形成二硫鍵）、離子互作（A2重復(fù)基序中的精氨酸與IF的酸性氨基酸殘基形成離子鍵）、氫鍵（IF中的多個(gè)位點(diǎn)可以和A1重復(fù)基序中的谷氨酰胺形成氫鍵）等［24］。在本研究中，牦牛和普通牛KAP1家族基因也發(fā)現(xiàn)A、B兩個(gè)重復(fù)單元，但還有個(gè)C重復(fù)單元（SIQTS），綿羊也發(fā)現(xiàn)了C重復(fù)序列。牛和牦牛中KAP1－2的重復(fù)單元組合是：BA1CA1CA1。牛和牦牛KAP1－1的重復(fù)組合為：BA1CA1，但牦牛B重復(fù)上有所不同，不是CCQTS而是CRQTS。KAP1－4的全長KAP1－4（157個(gè)氨基酸）與KAP1－1的序列相比少了1個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPI）重復(fù)單元，KAP1－4（147個(gè)氨基酸）序列要再少1個(gè)C（SIQTS）A1（CCQPT）重復(fù)，KAP1－4（137個(gè)氨基酸）再少1個(gè)B（CCQTS）A1（CCQPI），即無重復(fù)區(qū)域。根據(jù)這些重復(fù)特點(diǎn)以及與角蛋白結(jié)合方式可以推斷，牛和牦牛的KAPs與其角蛋白主要是以二硫鍵來結(jié)合，只有牦牛的KAP1－1蛋白的B重復(fù)單元中出現(xiàn)了精氨酸，所以離子互作不是主要的結(jié)合鍵。這就是為什么毛發(fā)在一般的高溫或遇水時(shí)不會(huì)發(fā)生理化性質(zhì)變化，因?yàn)槎蜴I不會(huì)在離子環(huán)境或水中解鏈［6，25］。

3.2牛和牦牛KAP1家族蛋白與綿羊?qū)?yīng)關(guān)系

試驗(yàn)是以與綿羊KAP1家族染色體上的對(duì)應(yīng)關(guān)系與同源性分析來重新命名牛和牦牛KAP1家族基因，但綿羊中有長度多態(tài)的是KAP1－1基因，而牦牛中有長度多態(tài)的為KAP1－4基因。由此可見這個(gè)家族基因存在的長度多態(tài)在物種間并不一致。人KAP1家族也是由4個(gè)基因編碼，其中KAP1－1和KAP1－3都有長度多態(tài)［26］。在美利奴綿羊KAP1家族的研究中發(fā)現(xiàn)KAP1－1基因有長度多態(tài)［14］，本研究中普通牛KAP1家族沒有發(fā)現(xiàn)長度多態(tài)，也可能因?yàn)闃悠妨可伲瑳]有檢測到。牦牛中發(fā)現(xiàn)KAP1－4基因有長度多態(tài)。所以在KAP1家族物種之間的差異比較大?？梢赃M(jìn)行一個(gè)推斷，KAP1家族有長度多態(tài)的基因可能不止一個(gè)，由于物種間差異，綿羊的KAP1－1基因保持了長度多態(tài)特性，而牦牛KAP1－4基因保持了長度多態(tài)性，以維持自己的毛發(fā)特性，但這些還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)牦牛KAP1家族中KAP1－4有長度多態(tài)，且發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的重復(fù)序列C（SIQTS），重復(fù)次數(shù)的功能尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 晉大鵬）

中圖分類號(hào)：S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3285－08

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.030

收稿日期：2016－05－13

基金項(xiàng)目："十一五"國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2008BADB2B01）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院對(duì)CAAS－ILRI聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的資助基金

作者簡介：沙日耐（1984－），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖，E－mail：sarinai＠163.com

通信作者：＊韓建林（1964－），男，甘肅蘭州人，博士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖，Tel：010－62829175；E－mail：h.jianlin＠cgiar.org

Study on Length Polymorphism ofKAP1Family Genes in Yak（Bosgurnniens）

SARNAI Arlud1，2，E Guang－xin3，WANG Chen4，HAN Jian－lin1＊
（1.InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.DepartmentofPsychosomaticMedicine，InnerMongoliaInternationalMongolianHospital，
Hohhot010010，China；3.SouthwestUniversity，Chongqing400416，China；4.SunYat－senUniversity，Guangzhou510006，China）

Abstract：This study was aimed to understand the characteristics of length polymorphism with repeat sequence of keratin associated protein 1（KAP1）family genes in yak.KAP1family genes of yak and cattle were sequenced，and compared with sheepKAP1family gene sequences.The results showed that cattleKAP1family genes were located in chromosome 19，according to location of sheepKAP1family genes in the chromosome and similarity with cattleKAP1family genes，renaming the cattle KAP1family（according to the gene location of chromosome）B2D，B2A，KAP1－1andB2Cgenes intoKAP1－4，KAP1－1，KAP1－2andKAP1－3gene，respectively.KAP1family genes in the 3′and 5′flank were highly conserved，the difference between family genes mainly in the the repeat sequence region，which yakKAP1toKAP4genes were found 30bp length polymorphism.There were B（CCQTS）A1（CCQPT）repeat sequence and a new repeat sequence C（SIQTS）.The results indicated that the repeat sequence was the key of the polymorphism ofKAP1family genes，which might be relate to combination with keratin protein.

Key words：KAP1family genes；yak；length polymorphism；repeat sequence