蒲 蕾，劉 欣，岳靜偉，張金山，王立剛，顏 華，侯欣華，高紅梅，張 恬，張躍博，武群清，3，張龍超＊，王立賢＊

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384；3.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙410128）

杜洛克豬HMGA1基因多態(tài)位點與生長、飼料利用性狀的關聯分析

蒲 蕾1，2，劉 欣1，岳靜偉1，張金山1，王立剛1，顏 華1，侯欣華1，高紅梅1，張 恬1，張躍博1，武群清1，3，張龍超1＊，王立賢1＊

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；2.天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384；3.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙410128）

摘 要：試驗對HMGA1基因的兩個SNPs位點進行分析，研究了HMGA1基因核苷酸多態(tài)性與生長、飼料利用性狀的關聯性。利用大白豬和民豬重測序結果比較發(fā)現了HMGA1基因的兩個SNPs位點（g.－543T＞C和g.1356C＞T），利用Sequenom質譜測序平臺對杜洛克豬g.－543T＞C和g.1356C＞T位點進行基因分型，并分析該位點多態(tài)性與生長、飼料利用性狀的關聯性。結果發(fā)現，杜洛克豬群體g.－543T＞C位點，CT與CC基因型相比，90日齡體重升高了2.15kg（P＜0.05），30kg體重日齡降低了3.21d（P＜0.05），斷奶重升高，剩余采食量降低，100kg體重日齡減少，30～100kg平均日增重、40～90kg平均日采食量、40～90kg平均日增重均降低。杜洛克豬群體g.1356C＞T位點，CC與TT基因型相比，90日齡體重升高了0.37kg（P＜0.05）；平均日采食量降低0.13kg／d（P＜0.05），100kg背膘厚降低0.43mm（P＜0.05），剩余采食量降低了70.42g（P＜0.05），30kg體重日齡降低了0.56d（P＜0.05）；40～90kg平均日采食量降低了0.17kg（P＜0.05），斷奶重升高，100kg體重日齡增大，30～100、40～90kg平均日增重均降低；CT與TT基因型結果與上結果類似。結果初步表明HMGA1基因兩個SNPs位點的突變有利于杜洛克豬的生長、飼料利用效率的提高。

關鍵詞：HMGA1基因；杜洛克豬；SNP；剩余采食量；飼料利用效率

飼料成本占養(yǎng)豬成本的60%以上，所以對飼料利用效率性狀的改良有利于降低養(yǎng)豬成本［1］。剩余采食量（residual feed intake，RFI）性狀是目前被關注的飼料利用效率指標之一［2］。與飼料轉化率（feed conversion ratio，FCR）不同，剩余采食量是用來描述動物實際采食量與用于維持和增重所需的預測采食量的差異，是用來評價動物遺傳背景決定的代謝差異［2］。

HMGA1屬于高遷移率蛋白家族成員（high mobility group protein，HMG）。研究證實，HMGA1與癌癥細胞的增殖分化有關，過表達HMGA1基因可以促進腫瘤細胞的轉移［3－6］；HMGA1基因在骨骼肌和脂肪組織中調控葡萄糖的轉運及胰島素信號通路［7－8］；HMGA1超表達可導致轉基因小鼠體重降低，脂質變?。?］。另有研究報道稱，HMGA1和黑皮質素受體4（melanocortin receptor 4，MC4R）基因的SNP互作與豬的生長、瘦肉量和脂肪含量均有一定關系［10－11］。機體三大物質（糖類、脂類和蛋白質）代謝的能力與豬的飼料利用效率有著密切關系［2］。而HMGA1基因在調節(jié)葡萄糖代謝和脂質代謝方面均有重要作用。因此，HMGA1可能與豬的飼料利用效率性狀有關。

本試驗對大白豬和民豬群體的重測序數據分析發(fā)現了HMGA1基因的兩個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點，目前鮮有研究報道。采用質譜分型技術，對杜洛克豬群體進行HMGA1基因的兩個SNPs位點的基因分型，并對該多態(tài)位點與生長、飼料利用性狀進行關聯分析，為飼料利用效率相關性狀影響的功能研究及HMGA1的這兩個位點作為標記輔助選擇位點提供依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑

瓊脂糖（Agarose）購自TaKaRa公司；DEPC、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ、DNA MarkerⅡ均購自天根生化科技（北京）有限公司；GoldView購自北京賽百盛基因技術有限公司；Tris飽和酚、三氯甲烷、無水乙醇（Ethanol）均購自北京化工廠。

1.2數據采集

所有的杜洛克豬進入有FIRE美國OSBORN自動喂料系統(tǒng)的圈舍中，測定獲取日采食量及體重情況。所有的原始數據從FIRE軟件收集至Excel表中，FCR性狀為平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）與平均日增重（average daily gain，ADG）的比值。RFI性狀的計算參考美國愛荷華州立大學Onteru等［12］公式：

RFI＝ADFI－［b1×（OnBW－30）＋b2×（Off－BW－100）＋b3×MetamidBW＋b4×ADGA＋b5 ×OffBFA）

式中，ADFI，測定期間的日采食量；Metamid－BW（meta middle body weight），豬的中間體重時需要的代謝能，MetamidBW＝［（OnBW＋OffBW）／2］0.75；ADGA，90～180d內的平均日增重；OffBFA（adjust off test back fat），測試結束時10～11肋背膘厚度調整到100kg體重時的值，即100kg體重背膘厚（100kg backfat，100kg BF）；30kg體重日齡、100kg體重日齡和30～100kg平均日增重的校正公式來源于CCSI［13］。40～90kg平均日采食量和平均日增重均為檢測真實值。

1.3 基因組DNA提取

采集所有杜洛克豬的耳樣，將樣品放入75%乙醇中，－20℃保存，以備后續(xù)基因組DNA的提取?；蚪MDNA采用酚－氯仿法提取，具體提取步驟見試劑盒說明。

1.4HMGA1基因的g.－543T＞C和g.1356C＞T基因型的判定

通過對大白豬和民豬的基因組DNA重測序所得結果進行比較分析，發(fā)現HMGA1基因的兩個SNPs位點（g.－543T＞C和g.1356T＞C）。通過Ensemble軟件（http：／／asia.ensembl.org／index.html）比對分析突變位置，確定SNP位點。

1.5Sequenom質譜分型

利用Sequenom質譜檢測平臺對試驗樣品進行HMGA1基因g.－543T＞C和g.1356T＞C位點的基因分型。根據GenBank中豬HMGA1基因RNA序列（登錄號：NM＿001185154）和DNA序列（登錄號：NC＿010449.4），利用AssayDesigner 3.1軟件進行引物和探針設計，引物序列見表1。單管擴增引物稀釋至100μmol／L，單管延伸引物稀釋至500μmol／L。Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型步驟為：①PCR擴增反應；②SAP反應；③延伸反應；④樹脂純化；⑤上樣，質譜反應；⑥Mass Array分析，并輸出報告［14］。

表1　HMGA1基因SNPs位點質譜探針引物Table 1 Primers and probes for genotyping assay for SNPs ofHMGA1gene

1.6統(tǒng)計分析

對380頭杜洛克豬HMGA1基因SNP位點與生長、飼料利用性狀進行關聯分析。使用SAS 9.2［15］數據處理軟件中的廣義混合線性模型（general linear mixed model，GLMM），以最小二乘法展開基因型與生長、飼料利用性狀顯著性檢驗，獲得杜洛克豬群體中顯著關聯位點。使用的模型為：

式中，Y，測得性狀；μ，總體均數；G，基因型效應；S，性別固定效應；W，初測體重協變量；e，隨機誤差。

統(tǒng)計基因型，計算各群體中該位點的基因頻率和基因型頻率，并進行Hardy－Weinberg平衡檢測。計算多態(tài)信息含量（PIC）、群體雜合度（He）、有效等位基因數（Ne），并做卡方（χ2）檢驗。

2 結果與分析

2.1生長、飼料利用性狀表型分析

本試驗中杜洛克豬群體各生長、飼料利用性狀數據表型統(tǒng)計結果見表2。由表2可知，杜洛克豬群體豬的初生重為1.79kg；斷奶重為7.78kg。90日齡體重為29.49kg；平均日采食量為1.74kg／d；平均日增重為0.66kg／d；100kg背膘厚為7.41mm；剩余采食量為－0.42g／d；飼料轉化率為2.70%；30kg體重日齡為90.80d；100kg體重日齡為196.47d；300～100kg平均日增重為0.67kg／d；40～90kg平均日采食量為1.93kg／d；40～90kg平均日增重為0.78kg／d。

2.2HMGA1基因的多態(tài)性基因型頻率分析

HMGA1基因5′－flank區(qū)域內發(fā)現了1個SNP位點（g.－543T＞C）；內含子區(qū)域發(fā)現1個SNP位點（g.1356C＞T）。群體基因型頻率和等位基因頻率見表3。由表3可知，在g.－543T＞C位點，C和T等位基因頻率分別為90.79%和9.21%；在c.1356C＞T位點，C和T等位基因頻率分別為21.84%和78.16%。g.－543T＞C和g.1356 C＞T多態(tài)位點的多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）及卡方（χ2）檢驗的分析結果中，杜洛克豬群體中該位點均達到Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；均表現出低度到中度多態(tài)性（中度0.25＜PIC＜0.5；低度PIC＜0.25）。根據等位基因頻率和雜合度分析，發(fā)現兩個位點均為低等雜合度SNP位點。

表2　飼料利用效率相關性狀的描述性統(tǒng)計Table 2 Statistical description of data set for feed efficiency related traits

表3　杜洛克豬HMGA1基因的SNPs多態(tài)信息Table 3 The polymorphism information ofHMGA1gene SNPs in Durocs pigs

2.3SNPs與生長、飼料利用性狀的關聯分析

將HMGA1基因的兩個SNPs位點基因型與杜洛克豬生長、飼料利用性狀進行關聯分析，結果見表4、5。由表4可知，杜洛克豬g.－543T＞C位點，TT與CC基因型個體相比，90日齡體重降低了2.63kg（P＜0.05），30kg體重日齡升高了4.11d（P＜0.05），100kg體重日齡升高了16.21d（P＜0.05），40～90kg平均日采食量降低了0.25kg（P＜0.05），斷奶重升高，剩余采食量、30～100kg平均日增重、40～90kg平均日增重均降低；CT與CC基因型相比，90日齡體重升高了2.15kg（P＜0.05），30kg體重日齡降低了3.21d（P＜0.05），斷奶重升高，剩余采食量降低，100kg體重日齡減少，30～100kg平均日增重、40～90kg平均日采食量、40～90kg平均日增重均降低。

由表5可知，杜洛克豬g.1356C＞T位點，CC與TT基因型相比，90日齡體重升高了0.37kg（P＜0.05）；平均日采食量降低0.13kg／d（P＜0.05），100kg背膘厚降低0.43mm（P＜0.05），剩余采食量降低70.42g（P＜0.05），30kg體重日齡降低了0.56d（P＜0.05）；40～90kg平均日采食量降低了0.17kg（P＜0.05），斷奶重升高，100kg體重日齡增大，30～100、40～90kg平均日增重均降低；CT與TT基因型相比，90日齡體重升高了0.99kg（P＜0.05）；30kg體重日齡降低了1.54d（P＜0.05），斷奶重升高，100kg體重日齡增大，30～100、40～90kg平均日增重均降低。

表4　HMGA1基因g.－543T＞C位點基因型與生長、飼料利用性狀的關聯分析Table 4 Association ofHMGA1gene g.－543T＞C genotype with different feed efficiency related traits

表5　HMGA1基因g.1356C＞T位點基因型與生長及飼料利用效率性狀的關聯分析Table 5 Association ofHMGA1gene g.1356C＞T genotype with different feed efficiency related traits

3 討 論

研究發(fā)現，HMGA1蛋白可以從細胞核轉移至線粒體，與線粒體DNA的D－loop環(huán)結合，影響線粒體基因的轉錄和功能維持［16］，且HMGA1的表達水平也影響了線粒體的功能和線粒體DNA的損傷修復效率［17］。機體能量消耗是通過線粒體的能量轉化完成的，有研究稱飼料利用效率高的動物體內線粒體的電子偶聯比其他動物好，能更好地利用能量［18］。HMGA1是視黃醇結合蛋白4（retinol－binding protein 4，RBP4）基因的重要調節(jié)子，cAMPHMGA1－RBP4通路在葡萄糖的體內內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［11］。另外，HMGA1在胰島β細胞的功能維持和胰島素的生產方面發(fā)揮重要作用［19］。HMGA1基因在白色脂肪和棕色脂肪的形成中發(fā)揮重要作用，它可以抑制脂肪細胞分化，降低脂肪量［9］。HMGA1基因的多態(tài)性與肌肉組織的脂肪酸的成分比例顯著關聯［11］。豬的剩余采食量性狀與豬的背部脂肪含量和瘦肉率具有很強的相關性［20］。所以HMGA1可能在調控飼料利用效率方面發(fā)揮一定作用。

通過對大白豬和民豬重測序結果進行比較分析，發(fā)現了HMGA1基因的兩個SNPs位點：g.－543T＞C和g.1356C＞T，且HMGA1基因的這兩個SNPs位點與豬生長、飼料利用性狀的相關性鮮有報道。由于g.－543T＞C位點的TT基因型個體只有兩個，所以統(tǒng)計的代表性不強，故此部分結果并不做深入分析。本研究結果分析發(fā)現，杜洛克豬HMGA1基因g.－543T＞C位點的CT與CC基因型相比90日齡體重更大，30kg體重日齡、100kg體重日齡和40～90kg平均日采食量更小，但該位點3種基因型與40～90kg平均日增重均無顯著相關性。即對HMGA1基因g.－543T＞C位點CT基因型進行選擇可能對90日齡體重、30kg體重日齡、100kg體重日齡和40～90kg平均日采食量產生積極的影響，并不顯著影響40～90kg平均日增重。杜洛克豬HMGA1基因g.1356C＞T位點CT、CC基因型與TT基因型相比，90日齡體重更大，平均日采食量更小，30kg體重日齡更小，并不顯著影響平均日增重的大小。由于g.1356 C＞T位點CC基因型個體較CT和TT基因型個體表現出更薄的背膘厚、更低的剩余采食量和40～90kg平均日采食量，并不影響40～90kg平均日增重的大小。即這兩個位點的突變可以使杜洛克豬在不影響平均日增重的同時降低同期間內的平均日采食量，可以使90日齡體重更重，30kg體重日齡和100kg體重日齡更小，尤其g.1356C＞T位點還可以使杜洛克豬有更薄的背膘厚和更低的剩余采食量。

另有研究發(fā)現，HMGA1基因的其他SNP位點與豬的生長、飼料利用性狀有關。研究報道，HMGA1基因的SNP位點與MC4R基因的SNP位點有一定關聯互作關系，此互作關系與豬的生長、瘦肉量和脂肪含量有一定相關性［10］。HMGA1基因的c187－170C＞T位點的多態(tài)性在低剩余采食量選擇系和對照組在大白豬群體中突變頻率差異極顯著，但并沒有發(fā)現此位點與飼料利用及其他肉質性狀有相關性［21］。HMGA1基因的c.576C＞T多態(tài)性位點與背膘厚呈現顯著相關性，與平均日增重和瘦肉率并無顯著相關性［10］。將HMGA1基因c.576C＞T位點與MC4R基因（Asp298Asn）的突變位點進行綜合關聯分析，發(fā)現c.576C＞T位點與大白豬的平均日增重顯著相關［10］。本研究中，HMGA1基因g.1356C＞T位點與背膘性狀有一定相關性，但與上研究不同的是HMGA1基因g.－543T＞C和g.1356C＞T位點與杜洛克豬群體各個階段的平均日增重均無顯著相關性。

4 小 結

HMGA1基因g.－543T＞C和g.1356C＞T位點突變可以使杜洛克豬在不影響平均日增重的同時降低同期間內的平均日采食量，可以使90日齡體重更重，30kg體重日齡和100kg體重日齡更小。尤其g.1356C＞T位點還可以使杜洛克豬有更薄的背膘厚和更低的剩余采食量。HMGA1基因的這兩個SNP位點可作為分子標記，利用基因輔助選擇的方法選擇有利的基因型留種，提高育種改良效率。

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（責任編輯 晉大鵬）

中圖分類號：S813.3

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3268－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.028

收稿日期：2016－05－04

基金項目：中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP－IAS02）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2015BAD03B02－2）；國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS－36）

作者簡介：蒲 蕾（1987－），女，陜西西安人，博士，研究方向：豬遺傳育種，E－mail：pulei87＠126.com

通信作者：＊張龍超，男，河北定州人，副研究員，研究方向：豬分子遺傳育種，E－mail：zhlchias＠163.com王立賢，男，山西朔州人，研究員，研究方向：豬遺傳育種，E－mail：iaswlx＠263.net

Study onHMGA1Gene Polymorphism Site and Its Association with Feed Efficiency Related Traits in Duroc Pigs

PU Lei1，2，LIU Xin1，YUE Jing－wei1，ZHANG Jin－shan1，WANG Li－gang1，YAN Hua1，HOU Xin－h(huán)ua1，GAO Hong－mei1，ZHANG Tian1，ZHANG Yue－bo1，WU Qun－qing1，3，ZHANG Long－chao1＊，WANG Li－xian1＊
（1.InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，TianjinAgriculturalUniversity，Tianjin300384，China；3.CollegeofAnimalScienceTechnology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China）

Abstract：The objective of this study was to analyze two SNPs ofHMGA1gene，and investigate its association with feed efficiency related traits in Duroc populations.HMGA1gene SNPs（g.－543T＞C and g.1356C＞T）in Large White pig and Min pig were detected by re－sequencing technology，SNP genotyping of g.－543T＞C and g.1356C＞T sites in Duroc populations were performed using Sequenom mass spectrometry，and the association ofHMGA1gene SNPs with growth and feed efficiency related traits in Duroc populations were analyzed.The results in－dicated that the individuals of CT genotype in g.－543T＞C increased 2.15kg on 90dbody weight（P＜0.05），decreased 3.21dat 30kg weight age（P＜0.05），weaning weight was increased and 100kg age were decreased，residual feed intake，30to 100kg average daily gain（ADG），40to 90kg average daily feed intake（ADFI）and 40to 90kg ADG were decreased，comparing with CC individuals.Moreover the individuals of CC genotype in g.1356C＞T had significantly increased 90dbody weight（0.37kg，P＜0.05），ADFI（less 0.13kg，P＜0.05），back fat（BF，less 0.43mm，P＜0.05），RFI（less 70.40g，P＜0.05），30kg age（less 0.56d，P＜0.05）and 40to 90kg ADFI（less 0.17kg，P＜0.05）were significantly decreased；Weaning weight and 100kg age were increased；30to 100kg ADG，40to 90kg ADG were decreased than TT genotype individuals.And the CT genotype individual in g.1356C＞T had the similar results with CC genotype individuals that compared with TT genotype individuals.All in all，the two SNPs ofHMGA1gene would be helpful in feed efficiency related traits in Duroc population.

Key words：HMGA1gene；Duroc pig；SNP；residual feed intake；feed utilization efficiency