高 倩，胡言青，唐懿挺，牟玉蓮

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備與鑒定

高 倩，胡言青，唐懿挺，牟玉蓮＊

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

摘 要：本研究旨在構(gòu)建Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，并對Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行RNA水平上的篩選，為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制提供一種動物模型。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）獲得小鼠組織的cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收，然后進(jìn)行擴(kuò)增片段和空載體的雙酶切，將酶切后膠回收得到的Wip1基因全長與載體pcDNA3.1（＋）進(jìn)行連接，獲得Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體，最終得到Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因原代小鼠，并利用Southern blotting方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對小鼠進(jìn)行鑒定篩選。試驗(yàn)獲得Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因原代小鼠30只，利用Southern blotting方法鑒定出陽性小鼠11只，陽性率為36.67%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率為32.84%。以上結(jié)果表明，試驗(yàn)成功構(gòu)建了Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體，并且經(jīng)過Wip1基因在小鼠組織DNA和RNA水平上的鑒定篩選，成功獲得了Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。

關(guān)鍵詞：Wip1；過表達(dá)；小鼠模型

野生型P53誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶1（wild－type p53－induced phosphatase，Wip1）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶，屬于PP2C（serine／threonine specific protein phosphatase type 2c，PP2C）家族，并由PPM1D（protein phosphatase magnesium－dependent 1delta，PPM1D）基因編碼［1］，在小鼠上，該基因位于11號染色體上，而人的Wip1基因位于17q23／q24處，其蛋白分子質(zhì)量約為61ku［2］。

絲／蘇氨酸蛋白磷酸酶家族中與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有直接關(guān)系的成員極少，但Wip1就是該家族中一個(gè)真正具有致癌作用的基因，是一種新的原癌基因［3］。Wip1具有多方面的功能，在細(xì)胞生長發(fā)育、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生殖、疾病等狀態(tài)中均起著重要的調(diào)節(jié)功能。有許多文獻(xiàn)都指出Wip1基因敲除能夠?qū)е鲁衫w維細(xì)胞的生長速度減慢，也能夠?qū)е录?xì)胞早衰［4－6］，在DNA的損傷修復(fù)過程中，Wip1基因承擔(dān)著抑制劑或者是調(diào)控子的角色。Wip1致癌基因在侵略性成神經(jīng)管細(xì)胞瘤變體的發(fā)生和侵襲中也起到了促進(jìn)作用［7］。Wip1能夠在正常的無應(yīng)激存在的情況下使得由p53來維持的細(xì)胞／組織達(dá)到內(nèi)穩(wěn)態(tài)［8］。此外，小鼠在敲除Wip1基因后，表現(xiàn)出了生殖器官的缺陷、免疫功能降低以及細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂［2］。目前，除了上述研究Wip1基因與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生、生殖的關(guān)系以外，也有關(guān)于Wip1基因與動脈粥樣硬化間關(guān)系的研究。動脈粥樣硬化的發(fā)生起始于自由基對低密度脂蛋白分子（low density lipoprotein，LDL）的氧化［9］，巨噬細(xì)胞攝入被氧化了的低密度脂蛋白分子（oxidized low density lipoprotein，oxLDL），會使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇以脂滴的形式得以累積，然后形成泡沫細(xì)胞［10］。新加坡科學(xué)家Le等［11］證明，Wip1缺失能夠抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，證實(shí)了自噬、肥胖和動脈粥樣硬化均受到細(xì)胞自噬活性的調(diào)節(jié)，均依賴Wip1的調(diào)節(jié)，Wip1通過ATM－mTOR途徑抑制細(xì)胞自噬活性，進(jìn)而調(diào)控脂肪的堆積以及動脈粥樣硬化的形成。據(jù)此，推測Wip1基因的過表達(dá)可能會加速動脈粥樣硬化的形成。

目前，已經(jīng)有一些大動物的動脈粥樣硬化模型［12－13］，如果能成功構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化模型，會為研究動脈粥樣硬化提供更便利的條件和更全面的參考。本試驗(yàn)擬通過建立Wip1過表達(dá)小鼠模型，為進(jìn)一步構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化模型及研究動脈粥樣硬化的形成提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動物 野生型C57小鼠及Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠均飼養(yǎng)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所豬基因工程與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室SPF級鼠房中。

1.1.2主要試劑 RNA PCR試劑盒（該試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶是由AMV分離而來）、T4DNA Ligase、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、PrimeSTARTMHS DNA Polymerase、DNA Marker及5×Buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit Spin Protocol試劑盒及E.Z.N.A.EndoFree Plasmid Mini Kit均購自O(shè)mega Bio－Tek公司；Trizol及SYBR熒光試劑均購自Life Technologies公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；高純RNA快速提取試劑盒、E×Taq酶及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Tris－飽和酚、Taq酶、DIG Easy Hyb、CDP－Sta、PCR DIG Probe Synthesis Kit及陽性尼龍膜均購自Roche公司。

1.2方法

1.2.1Wip1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增 根據(jù)小鼠Wip1基因cDNA全序列（GenBank登錄號：NM＿016910.3），通過SignalP軟件和DNAMAN 6.0軟件分析擴(kuò)增片段內(nèi)部所含酶切位點(diǎn)，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0和Oligo 6.0設(shè)計(jì)1對特異引物，對Wip1基因的CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增，用DNAMAN對序列內(nèi)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行檢查，排除內(nèi)部酶切位點(diǎn)，并于上、下游引物中分別加入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物（Wip1F）：5′－CCCAAGCTTATGGCGGGGCTGTACTCGCTG－3′；下游引物（Wip1R）：5′－CGGGATCCTCAGCACACACACACTGG－3′，預(yù)期擴(kuò)增目的片段長度為1 814bp。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。按照RNA提取試劑盒說明書提取小鼠睪丸組織的總RNA，以O(shè)ligo－dT為引物，使用AMV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用上、下游引物進(jìn)行編碼區(qū)的擴(kuò)增。

1.2.2擴(kuò)增片段的回收、擴(kuò)增片段和連接載體的雙酶切 按照E.Z.N.A.Gel Extraction Kit Spin Protocol試劑盒的操作步驟進(jìn)行上述擴(kuò)增片段的回收，然后將要連接的空載體pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒與上述擴(kuò)增的片段用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，37℃酶切3h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并進(jìn)行酶切后膠回收。

1.2.3Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體的獲得將酶切后膠回收得到的Wip1基因全長和載體pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行定向連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒Wip1－pcDNA3.1（＋）。將重組質(zhì)粒Wip1－pcDNA3.1（＋）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。將含無突變、無缺失質(zhì)粒的菌株再擴(kuò)大培養(yǎng)，最后提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒備用。

1.2.4Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備、鑒定及擴(kuò)繁 將上述提取的Wip1－pcDNA3.1（＋）無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化后送往中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所制備Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。利用Southern blotting方法對獲得的小鼠進(jìn)行DNA水平上的鑒定。Southern blotting免疫印跡技術(shù)操作主要步驟為：先提取小鼠的基因組DNA并進(jìn)行質(zhì)量檢測，制備包含pcDNA3.1啟動子和Wip1 CDS部分序列的探針，對基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)移和固定，最后進(jìn)行DIG雜交和免疫檢測。經(jīng)過鑒定的小鼠用于配種、擴(kuò)繁。小鼠在進(jìn)入SPF級鼠房先適應(yīng)新環(huán)境1周后再進(jìn)行配種。SPF級鼠房具備智能溫控（保持25℃左右）、智能光照（12h光照，12h黑暗），小鼠自由采食和飲水，配種后獲得具有相同來源、共同飼養(yǎng)環(huán)境下的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。上述涉及到的所有試驗(yàn)動物的相關(guān)試驗(yàn)操作均按相關(guān)操作規(guī)范進(jìn)行。

1.2.5擴(kuò)繁的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選、鑒定 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對擴(kuò)繁的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行篩選。采集待鑒定小鼠的鼠尾，置于Trizol中進(jìn)行裂解，接下來按照RNA提取試劑盒說明書提取組織的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測小鼠組織中的Wip1表達(dá)水平。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)Wip1及GAPDH的上、下游引物，引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體構(gòu)建

為了制備Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，需要先構(gòu)建過表達(dá)載體。首先將要連接的空載體pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒與擴(kuò)增的含編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切以獲得含有互補(bǔ)的黏性末端的DNA片段。所獲得的Wip1－pcDNA3.1（＋）載體長度約為7 242bp。對含有該大小質(zhì)粒的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測到的片段大小為1 814bp，符合預(yù)期結(jié)果并將該質(zhì)粒送測序，確認(rèn)序列正確無突變?nèi)笔АＭ瑯?，對該過表達(dá)載體Wip1－pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒用ScaⅠ線性化處理后得到的線性載體片段為7 242bp（圖1），從而進(jìn)一步確認(rèn)成功構(gòu)建了Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體（圖2）。

2.2原代小鼠的整合檢測

通過顯微注射方法獲得原代小鼠30只，利用Southern blotting方法對獲得的原代小鼠進(jìn)行DNA水平上的鑒定，檢測到陽性小鼠為11只，陽性率為36.67%。對鑒定得到的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁、備用。

Southern blotting結(jié)果顯示，在待鑒定的1～10號原代小鼠中，3、5、6、7及10號原代小鼠均出現(xiàn)3條特異性條帶（最下面1條大小為596bp，是與探針特異性結(jié)合的條帶），為Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠（圖3）。

圖1　Wip1－pcDNA3.1（＋）載體的構(gòu)建Fig.1 The constrction of Wip1－pcDNA3.1（＋）vector

圖2　Wip1－pcDNA3.1（＋）載體構(gòu)建圖Fig.2 The drawing of Wip1－pcDNA3.1（＋）vector

圖3　部分原代小鼠的Southern blotting鑒定Fig.3 Southern blotting identification of part of the founder mouse

2.3 擴(kuò)繁的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選鑒定

將獲得的陽性鼠進(jìn)行合籠，經(jīng)傳代產(chǎn)后代小鼠204只，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測陽性67只，陽性率32.84%，篩選與對照組小鼠相比表達(dá)水平存在顯著差異的個(gè)體，以建立Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠家系。

2.3.1組織RNA及cDNA的質(zhì)量檢測 采集小鼠鼠尾組織提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示檢測到了18S和28S兩條條帶（圖4）。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示僅檢測到一條特異性條帶（圖5），說明提取的RNA和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA質(zhì)量較好，適宜進(jìn)行下一步的實(shí)時(shí)熒光定量檢測。

圖4　RNA電泳質(zhì)量檢測Fig.4 RNA quality detection by electrophoretic analysis

圖5　cDNA電泳質(zhì)量檢測Fig.5 cDNA quality detection by electrophoretic analysis

2.3.2Wip1過表達(dá)小鼠的篩選鑒定 由圖6可知，與74號野生型對照組小鼠組織中Wip1mRNA表達(dá)水平相比，68號和70號小鼠的Wip1mRNA表達(dá)水平極顯著升高（68號：P＝0.0007，70號：P＝0.0001），說明68號和70號小鼠為篩選出的Wip1過表達(dá)小鼠，可以將轉(zhuǎn)基因Wip1穩(wěn)定遺傳給后代。

圖6　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Fig.6 Real－time PCR detection

3 討 論

Wip1是于1997年通過基因篩選法首次被發(fā)現(xiàn)命名的，是一種新的轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以一種p53依賴的方式來表達(dá)，并且響應(yīng)電離輻射（ionizing radiation，IR）誘導(dǎo)產(chǎn)生，與絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶（type 2Cprotein phosphatase，PP2C）同源。Wip1mRNA在電離輻射后快速生成，其翻譯生成的蛋白在細(xì)胞核表達(dá)。Wip1可能會以p53依賴的方式對DNA的損傷產(chǎn)生響應(yīng)來協(xié)助生長抑制通路的激活［14－15］。小鼠的Wip1基因包含了6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，整個(gè)Wip1的DNA長度跨越超過36kb，外顯子的范圍在125～558bp，第1個(gè)內(nèi)含子的大小未知，但是至少跨越16kb，該蛋白的分子質(zhì)量約為66ku。目前，已知的Wip1靶向蛋白至少有7種：P53（p53kinase）、P38（p38kinase）、ATM（serine／threonine kinase）、Mdm2（MDM2protooncogene，E3ubiquitin protein ligase）、Chkl（choline kinase 1）、Chk2（choline kinase 2）和UNG2（uracil－DNA glycosylase）［15－20］，而對Wip1的研究主要集中于Wip1的靶向位點(diǎn)及去磷酸化位點(diǎn)。Wip1具有多方面的功能，對細(xì)胞生長發(fā)育、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生殖、炎癥、疾病等均起著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究通過顯微注射的方法，獲得了Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過PCR、Southern blotting及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測證明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是成功的。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）由多種因素參與，其病變主要累及到大、中動脈內(nèi)膜及中層等結(jié)構(gòu)，是一種以脂質(zhì)沉積和慢性炎性細(xì)胞浸潤為特征的病理生理過程，是心腦血管疾病的一個(gè)重要的誘因。Wip1是一個(gè)已知的ATM和p53的調(diào)節(jié)因子，ATM和p53在動脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)中起作用［21－24］。研究表明，Wip1可以通過ATM－mTOR途徑抑制細(xì)胞自噬活性，從而控制脂肪堆積和動脈粥樣硬化的形成。而在飼喂高能飲食的小鼠中，若將Wip1基因敲除，不僅能抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，還能夠減輕動脈粥樣硬化噬斑的形成［11］。因此，本研究中構(gòu)建的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠是否易得動脈粥樣硬化是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)，這將為Wip1基因的敲除可以減緩動脈粥樣硬化的發(fā)生提供佐證，也為研究Wip1影響動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)理提供基礎(chǔ)，同時(shí)將大大有助于開展以Wip1為分子靶點(diǎn)的靶向藥物研究與開發(fā)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)制備的Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠可以傳至下一代。雖然目前對Wip1基因的研究有一定的進(jìn)展，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而且很多機(jī)制并不明確。尤其對其在癌癥患者中高表達(dá)的機(jī)制以及如何參與慢性疾病的發(fā)病過程并不清楚，因此，下一步也可以從Wip1生物學(xué)功能及小鼠培育等多方面進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了Wip1－pcDNA3.1（＋）過表達(dá)載體，并且經(jīng)過Wip1基因在小鼠組織DNA和RNA水平上的鑒定篩選，成功獲得了Wip1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制提供了一種動物模型。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Choi J，Appella E，Donehower L A.The structure and expression of the murine wildtype p53－induced phosphatase 1（Wip1）gene［J］.Genomics，2000，64（3）：298－306.

［2］ Lowe J，Cha H，Lee M O，et al.Regulation of the Wip1phosphatase and its effects on the stress response［J］.FrontiersinBioscience，2012，17：1480－1498.

［3］ Bulavin D V，Demidov O N，Saito S，et al.Amplification of PPM1Din human tumors abrogates p53tumorsuppressor activity［J］.NatureGenetics，2002，31（2）：210－215.

［4］ Song J Y，Ryu S H，Cho Y M，et al.Wip1suppresses apoptotic cell death through direct dephosphorylation of BAX in response to gamma－radiation［J］.Cell Death＆Disease，2013，4（8）：120－130.

［5］ Yin H，Yan Z，Liang Y，et al.Knockdown of protein phosphatase magnesium－dependent 1（PPM1D）through lentivirus－mediated RNA silencing inhibits colorectal carcinoma cell proliferation［J］.TechnologyinCancerResearch＆Treatment，2013，12（6）：537－543.

［6］ Bulavin D V，Phillips C，Nannenga B，et al.Inactivation of the Wip1phosphatase inhibits mammary tumorigenesis through p38MAPK－mediated activation of the p16（Ink4a）－p19（Arf）pathway［J］.NatureGenetics，2004，36（4）：343－350.

［7］ Buss M C，Remke M，Lee J，et al.The WIP1oncogene promotes progression and invasion of aggressive medulloblastoma variants［J］.Oncogene，2015，34：1126－1140.

［8］ Park H K，Panneerselvam J，Dudimah F D，et al.Wip1contributes to cell homeostasis maintained by the steady－state level of Wtp53［J］.CellCycle，2011，10（15）：2574－2582.

［9］ Hansson G K，Libby P.The immune response in atherosclerosis：A double－edged sword［J］.Nature ReviewsImmunology，2006，6（7）：508－519.

［10］ Glass C K，Witztum J L.Atherosclerosis：The road ahead［J］.Cell，2001，104（4）：503－516.

［11］ Le G X，Brichkina A，Huang Y F，et al.Wip1－dependent regulation of autophagy，obesity，and atherosclerosis［J］.CellMetabolism，2012，16（1）：68－80.

［12］ Hamamdzic D，Wilensky R L.Porcine models of accelearated coronary atherosclerosis：Role of diabetes mellitus and hypercholesterolemia［J］.Journalof DiabetesResearch，2013，2013（1）：86－89.

［13］ Vilahur G，Padro T，Badimon L.Atherosclerosis and thrombosis：Insights from large animal models［J］.JouralofBiomedicine＆Biotechnoligy，2011，2011（1）：907575.

［14］ 張 偉，顧 勇，羅紅鶴，等.原癌基因wip1的研究進(jìn)展［J］.中國病理學(xué)雜志，2008，24（7）：1445－1448.

［15］ Fiscella M，Zhang H，F(xiàn)an S，et al.Wip1，a novel human protein phosphatase that is induced in response to ionizing radiation in a p53－dependent manner［J］.ProceedingoftheNationalAcademyofSciencesof theUnitedStatesofAmerica，1997，94（12）：6048－6053.

［16］ Krokan H E，Drablos F，Slupphaug G.Uracil in DNA－Occurrence，consequences and repair［J］.Oncogene，2002，21（58）：8935－8948.

［17］ Lu X，Ma O，Nguyen T A，et al.The Wip1phosphatase acts as a gatekeeper in the p53－Mdm2autoregulatory loop［J］.CancerCell，2007，12（4）：342－354.

［18］ Lu X，Nannenga B，Donehower L A.PPM1Ddephosphorylates Chk1and p53and abrogates cell cycle checkpoints［J］.Genes＆Development，2005，19（10）：1162－1174.

［19］ Takekawa M，Maeda T，Saito H.Protein phosphatase 2Calpha inhibits the human stress－responsive p38 and JNK MAPK pathways［J］.TheEMBOJournal，1998，17（16）：4744－4752.

［20］ Yoda A，Xu X Z，Onishi N，et al.Intrinsic kinase activity and SQ／TQ domain of Chk2kinase as well as N－terminal domain of Wip1phosphatase are required for regulation of Chk2by Wip1［J］.TheJournalofBiological Chemistry，2006，281（34）：24847－24862.

［21］ Guevara N V，Kim H S，Antonova E I，et al.The absence of p53accelerates atherosclerosis by increasing cell proliferationinvivo［J］.NatureMedicine，1999，5（3）：335－339.

［22］ Schneider J G，F(xiàn)inck B N，Ren J，et al.ATM－dependent suppression of stress signaling reduces vascular disease in metabolic syndrome［J］.CellMetabolism，2006，4（5）：377－389.

［23］ Shreeram S，Hee W K，Demidov O N，et al.Regulation of ATM／p53－dependent suppression of myc－induced lymphomas by Wip1phosphatase［J］.The JournalofExperimentalMedicine，2006，203（13）：2793－2799.

［24］ Shreeram S，Demidov O N，Hee W K，et al.Wip1 phosphatase modulates ATM－dependent signaling pathways［J］.MolecularCell，2006，23（5）：757－764.

（責(zé)任編輯 盧慶萍）

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3094－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.002

收稿日期：2016－06－03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31572378）

作者簡介：高 倩（1986－），女，山東淄博人，博士生，研究方向：動物細(xì)胞工程和基因工程，E－mail：gaoqian36985＠163.com

通信作者：＊牟玉蓮（1976－），女，河北保定人，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物遺傳育種與繁殖，E－mail：mouyulian＠caas.cn

Establishment and Identification of Wip1Over－expressed Transgene Mice Model

GAO Qian，HU Yan－qing，TANG Yi－ting，MU Yu－lian＊（
InstituteofAnimalSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China）

Abstract：This study was aimed to build Wip1over－expressed transgene mice，which could provide an animal model for clarifying the pathogenetic mechanism of atherosclerosis，and the transgene mice were screened at RNA level.Mice tissues cDNA were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction（RT－PCR），which were used for the next PCR amplification template.The amplified fragments were used for gel recovery.Then，the amplified fragment and empty vector were double enzyme digested.Full－length gene of Wip1，which was obtained by gel recovery，was connected to pcDNA3.1（＋）vector，and the Wip1－pcDNA3.1（＋）over－expressed vector was constructed.Finally，Wip1over－expressed transgene mice were obtained.The transgene mice were identified and screened by Southern blotting and qPCR.30Wip1over－expressed transgene mice were got in this experiment，and the positive mice identified were 11by Southern blotting，the positive rate was 36.67%.Moreover，the positive rate was 32.84%through screening by qPCR.Therefore，the Wip1－pcDNA3.1（＋）over－expressed vector was constructed successfully，and the Wip1over－expressed transgene mice were obtained through identifying and screening at DNA and RNA level of Wip1in mice tissues.

Key words：Wip1；over－expression；mouse model