文│楊明娟（山東省臨朐縣畜牧局）

抗體的制備、分離和篩選技術(shù)

文│楊明娟（山東省臨朐縣畜牧局）

抗體主要存在于動(dòng)物的血清中，是機(jī)體免疫系統(tǒng)被特定抗原刺激后，宿主體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞通過增殖分化以后形成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的特定免疫球蛋白，它能夠特異性地結(jié)合特定抗原。在血液和淋巴液中，抗原抗體的特異性結(jié)合是宿主抵御外來分子和微生物入侵的一種重要機(jī)制。經(jīng)過多年的實(shí)際應(yīng)用，抗體用于治療人和動(dòng)物的傳染性疫病的效果日益被認(rèn)可，其良好的應(yīng)用前景和篩選技術(shù)的革新，推動(dòng)了抗體的制備、分離和篩選技術(shù)的迅速發(fā)展。筆者現(xiàn)就相關(guān)技術(shù)綜述如下。

一、人工制備抗體技術(shù)

1.多克隆抗體。當(dāng)一種抗原侵入宿主的體內(nèi)時(shí)，機(jī)體便會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生可以中和不同抗原決定簇的抗體。一種天然的抗原通常具有多種不同的抗原決定簇，并且每一個(gè)抗原決定簇都能夠刺激細(xì)胞產(chǎn)生一種特異性抗體。如果想要把這些抗體按類進(jìn)行分離，用目前已有的物理、化學(xué)或生化方法幾乎不可能做到。

早期制備抗體的放大是將待免疫的動(dòng)物暴露在抗原條件下，因?yàn)榭乖镔|(zhì)具有許多不同的抗原決定簇，因此可以產(chǎn)生多種抗體并分泌到血清或者體液中，所以動(dòng)物血清是包括多種抗體在內(nèi)的混合物。這種通過體內(nèi)免疫方法獲得的免疫血清稱為多克隆抗體，也是第一代抗體。但是這種抗體是混合的，對于感染性疾病的臨床治療和抗體分子功能結(jié)構(gòu)的研究無多大幫助。

2.單克隆抗體。毒素或抗原免疫小鼠等模式動(dòng)物，可刺激模式動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體，但產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞是終末狀態(tài)的細(xì)胞，不能增殖分化，因此產(chǎn)生抗體的能力非常有限且存在時(shí)間較短。為了能使B細(xì)胞在體外或動(dòng)物體內(nèi)無限增殖，科學(xué)家采用雜交瘤技術(shù)，利用骨髓瘤細(xì)胞能夠無限增殖的特點(diǎn)，將產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，得到既能只分泌一種特異性抗體又可以迅速增殖的雜交瘤細(xì)胞。然后將其進(jìn)行體外培養(yǎng)或者注入小鼠體內(nèi)，就能得到大量針對某一抗原決定簇的單克隆抗體，由此產(chǎn)生了單克隆抗體制備技術(shù)。

1995年，美國的芝加哥大學(xué)科學(xué)家Katherine Knight從轉(zhuǎn)基因的兔中分離出了骨髓瘤細(xì)胞，從此創(chuàng)立了兔單克隆抗體的制備技術(shù)。兔單克隆抗體比鼠單克隆抗體有更加顯著的優(yōu)勢：兔可反復(fù)免疫，產(chǎn)生的血清抗體親和力更高、能夠識別更多類型的表位；兔單克隆抗體可以識別出某些小鼠不能識別的抗原；由于兔的脾臟比老鼠大，脾細(xì)胞的數(shù)量更多，融合試驗(yàn)中產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的數(shù)量更多，結(jié)合高通量篩選技術(shù)能制備更好的抗體。

單克隆抗體用于治療和診斷疾病的潛力巨大。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性更強(qiáng)、純度和效價(jià)更高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。單克隆抗體的廣泛應(yīng)用大幅提高了診斷各種惡性腫瘤和傳染病的準(zhǔn)確性。單克隆抗體技術(shù)對各種免疫細(xì)胞的分離、鑒定以及分類，各種膜表面分子結(jié)構(gòu)和功能的研究，具有深遠(yuǎn)的意義。

二、抗體篩選技術(shù)

1.噬菌體展示技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)是當(dāng)前常用的抗體篩選技術(shù)，最常用的為溶原性的絲狀噬菌體。這項(xiàng)技術(shù)在1985年由美國的Smith博士首次提出，首次證實(shí)外源DNA可以插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ中，并與pⅢ蛋白融合展示。噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA片段插入到噬菌體編碼的蛋白基因，使外源基因的表達(dá)蛋白可以和噬菌體的外殼蛋白相融合，然后展示在噬菌體的表面。PCR擴(kuò)增人或動(dòng)物的抗體庫，以單鏈抗體形式在噬菌體中表達(dá)，再以高通量篩選技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，獲得抗體的技術(shù)可復(fù)制性高，應(yīng)用廣泛。

2.酵母展示技術(shù)。酵母（表面）展示技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。該項(xiàng)技術(shù)由KD Wittrup實(shí)驗(yàn)室建立，是分離和改造抗體特異性、親和力和穩(wěn)定性的有力手段。抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)由linker鏈接成單鏈可變區(qū)抗體（scFv單鏈抗體），與酵母表面細(xì)胞壁上Aga2p蛋白融合，結(jié)合熒光素標(biāo)記的抗原，以FACS方法分選有結(jié)合活性的酵母細(xì)胞，然后體外細(xì)胞表達(dá)抗體，驗(yàn)證抗體的功能。

3.B細(xì)胞永生化。B細(xì)胞永生化及活化在單克隆抗體制備方案中對于抗體的獲得至關(guān)重要。前期B淋巴細(xì)胞永生化的方法是由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的，這可以提高細(xì)胞的增殖能力和分泌抗體的活性，但缺點(diǎn)是效率低。到2004年，Traggiai等人在研究非典型肺炎冠狀病毒的過程中改進(jìn)提高了EBV轉(zhuǎn)化效率的方法。由于來自人的B淋巴細(xì)胞資源有限，很難獲得足夠的數(shù)量，并且因感染原因、程度和階段的細(xì)胞比例不同，所以能夠直接分離純化獲得的B淋巴細(xì)胞很少，細(xì)胞活性低，能夠分泌目標(biāo)抗體的能力也比較低。

目前B淋巴細(xì)胞永生化技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的研究制備和B淋巴細(xì)胞的研究。有學(xué)者在研究T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的應(yīng)答過程中也運(yùn)用了B淋巴細(xì)胞永生化技術(shù)，并且結(jié)合高通量細(xì)胞篩選技術(shù)，獲得了具有較強(qiáng)增殖能力和抗體分泌活性的記憶B淋巴細(xì)胞。

4.單細(xì)胞PCR技術(shù)。近年來開始廣泛應(yīng)用單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)，該技術(shù)是一種體外克隆和表達(dá)單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞抗體基因的技術(shù)，重鏈和輕鏈的可變區(qū)的天然配對會(huì)被保留，具有需要的細(xì)胞量很少、基因多樣性好、效率高、全人源等優(yōu)點(diǎn)。以噬菌體、細(xì)菌和酵母展示為代表的抗體庫技術(shù)可以使用天然免疫庫，通過重鏈、輕鏈隨機(jī)重組建立抗體序列，通過與抗原多輪富集篩選親和力最強(qiáng)的抗體。天然免疫庫具有多樣性，因此在免疫庫中分離天然配對的抗體更具有優(yōu)勢。

單細(xì)胞克隆抗體技術(shù)主要應(yīng)用于漿母細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的克隆。人的漿母細(xì)胞表型清楚，以CD3-/CD19+/CD20-/ CD27++/CD38++/IgM-分選感染后急性期或免疫疫苗者7天后的PBMC，半塊96孔板（約42個(gè)細(xì)胞孔，H行作為對照）約能克隆出重輕鏈匹配抗體20個(gè)。這一方法廣泛應(yīng)用于流感疫苗、肺炎球菌疫苗和流感感染者、登革熱感染者等突發(fā)傳染病的B細(xì)胞克隆中，通過這種技術(shù)，目前已經(jīng)有研究獲得流感、HIV方面研究的中和抗體。另外一種方法是利用特異的抗原蛋白探針，通過組織細(xì)胞表達(dá)抗原，標(biāo)記熒光素作為探針分選傳染病感染者恢復(fù)期的PBMC，從而分選出抗原探針特異性IgG單個(gè)B細(xì)胞。例如，Adimab公司利用單細(xì)胞PCR技術(shù)在兩個(gè)月時(shí)間里分離出的埃博拉中和抗體比過去20年埃博拉研究領(lǐng)域分離的埃博拉抗體總和還多。