陳啟蘭祝光禮龔一萍任興昌齊國安赫小龍

復方黃芪養(yǎng)心合劑對SD大鼠冠狀動脈結扎術后心室及血管周圍膠原重構的影響

陳啟蘭1祝光禮1龔一萍2任興昌3齊國安4赫小龍1

目的觀察復方黃芪養(yǎng)心合劑（CAMNH）對SD大鼠冠狀動脈結扎術后心室及血管周圍膠原重構（VR）的影響。方法SD大鼠47只隨機取假手術組（SO組）8只。其余39只行冠狀動脈左前降支結扎術，觀察10天，存活29只大鼠按隨機數字表法分為三組，復方黃芪養(yǎng)心合劑組（CAMNH組）、美托洛爾緩釋片組（MSSRT組）每組10只，心臟重構組（VR組）9只，CAMNH組MSSRT組予相應藥物灌胃，VR組和SO組予蒸餾水灌胃，共計8周。計算全心室質量與體質量比（Vt/Wt）；使用改良Masson染色法觀察大鼠心室重構，用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，計算心肌組織膠原容積分數（CVF）和血管周圍膠原面積（PVCA）。結果Vt/Wt：MSSRT組小于VR組［（2.77±0.26）%比（3.06±0.21）%，P＜0.05］；CAMNH組明顯小于VR組［（2.67±0.17）%比（3.06± 0.21）%，P＜0.01］。CVF與PVCA：MSSRT組及CAMNH組與VR組比較明顯降低［（43.89±6.83）%、（42.60±17.55）%比（59.01±6.93）%；（101.8±49.7）%、（104.1±41.2）%比（148.1±69.3）%；P＜0.01］。結論復方黃芪養(yǎng)心合劑能夠減輕冠狀動脈結扎術后SD大鼠Vt/Wt，降低VR大鼠CVF、PVCA，作用

大鼠；冠狀動脈結扎術后；心臟重構；復方黃芪養(yǎng)心合劑；美托洛爾；心肌組織膠原容積分

心室重構（ventriclar remodeling，VR）是在各種損傷及繼發(fā)性因素作用下所造成的心肌結構、功能的變化，心肌細胞外基質及血管周圍膠原沉積和纖維化是VR的重要表現(xiàn)之一，使心肌僵硬度增加，造成心力衰竭[1]。近年來冠心病越來越成為臨床常見病[2]，由于心肌缺血、梗死造成的冠心病心室重構也越來越多見。本研究觀察復方黃芪養(yǎng)心合劑（compound astragalus mixture nourishing heart，CAMNH）對SD大鼠冠脈結扎術后心室及血管周圍膠原重構的干預作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級Sprague-Dawley （SD）大鼠47只，體質量180～220g，8～10周齡，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，清潔飼養(yǎng)室保持恒溫（20℃），相對濕度40%～60%；實驗動物許可證號：SYXK（浙）2008-0115。

1.2 實驗藥品 CAMNH處方組成和制劑工藝：黃芪（批號101010）、黨參（批號101005）、太子參（批號101013）、苦參（批號101022）、丹參（批號101023）、甘松（批號101019）各20g，炙甘草10g（批號101018），生山楂15g（批號101007），單味中藥均由浙江省臨安市中藥藥材有限公司提供。將各藥加水煎煮2次，第一次1.5h，第二次0.5h，由杭州市中醫(yī)院藥劑制劑室制備成生藥濃度為2g/mL的生藥煎劑，4℃冰箱保存。對照藥物：美托洛爾緩釋片（metoprolol succinate sustained-release tablets，MSSRT）（47.5mg/片，批號m14438）由阿斯特拉（無錫）制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉（規(guī)格：25g/瓶，上海西唐，批號WS20080118）；Masson三色染色試劑盒（MST-8003/8004，福州邁新）；DH-150動物人工呼吸機（浙江大學醫(yī)學儀器廠）；Medlab-U/4CS生物信號采集儀（南京美易科技有限公司）；病理組織漂烘處理儀（常州效區(qū)中威電子儀器廠）；LEICA RM 2235輪轉式切片機（LEICA，德國）；BX-51 OLYMPUS顯微鏡（Olympus，日本）；Microview MVC 1000圖像采集儀（Olympus，日本）；Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國）。

2 實驗方法

2.1 大鼠冠脈結扎術后心室重構（ventricular remodeling，VR）模型的建立 大鼠急性心肌梗死制作參考徐叔云等[3]的方法通過左冠狀動脈前降支高位結扎并略作改進[4]。結扎術后觀察15min，關閉胸腔，擠出殘余空氣，逐層縫合胸壁組織，做好麻醉后復蘇及保暖工作。假手術（sham-operated，SO）組除不結扎冠脈左前降支外，其余步驟相同。全程記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖并存盤。

2.2 動物分組 47只大鼠隨機取假手術組（SO組）8只。其余39只大鼠行冠狀動脈左前降支結扎術，術后縫合，觀察10天，存活29只大鼠按隨機數字表法分為三組，復方黃芪養(yǎng)心合劑組（CAMNH組）、美托洛爾緩釋片組（MSSRT組）每組各10只，心臟重構組（VR組）9只。CAMNH組按14g/［7mL/（kg·d）］劑量灌胃；MSSRT組按9.5mg/［7mL/（kg·d）］劑量，將MSSRT研細，稱重，加蒸餾水溶解后灌胃；VR組和SO組均按蒸餾水7mL/（kg·d）灌胃，共計8周。

2.3 指標檢測

2.3.1 心電圖 冠狀動脈結扎術后10周，各組大鼠麻醉，記錄心電圖30s。

2.3.2 全心室質量與體質量比 稱體質量（weight，Wt，g），麻醉，開胸，取下大鼠心臟，用生理鹽水洗凈血污，去除左右心房、心耳，用吸水紙吸去水分，稱全心室質量（ventricle weight，Vt，g），計算全心室質量與體質量比（Vt/Wt，%）。

2.3.3 HE及改良Masson染色觀察 標本的取材與處理：取下大鼠心臟，用生理鹽水洗凈血污，去除左右心房、心耳、右心室，用吸水紙吸去水分，取結扎以下部分，從心尖至心底部垂直心臟縱軸方向，將心臟切成3個組織塊，厚度約2～3mm（視組織塊縱徑長短而定），取2個組織塊置于4%中性福爾馬林溶液內固定24h。將心肌組織用不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，按肌肉橫斷面切片（厚度3μm），65℃下過夜烤干備用。

HE染色：組織切片于病理組織漂烘處理儀60℃烤片1h，二甲苯脫蠟二次，再依次梯度酒精脫水和蒸餾水水化，HE常規(guī)染色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察心肌缺血情況。用彩色攝像機采集圖像（×200）。

改良Masson染色：組織切片于病理組織漂烘處理儀60℃烤片1h，二甲苯脫蠟二次，再依次梯度酒精脫水和蒸餾水水化，吸取Masson復合染色液染色，去離子水洗兩次；吸取磷鉬酸液適量滴至標本上，5min后傾去，去離子水涮洗兩次；吸取苯胺藍適量滴至標本上，5min后傾去；直接滴加鹽酸酒精分化液適量，30～60s后傾去，×2次；無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察心肌細胞與膠原纖維情況。用彩色攝像機采集圖像（×400）。用Image Pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測量心肌組織膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF，%）和血管周圍膠原面積（perivascular collagenvolume area，PVCA，%）。CVF（%）=膠原面積/總面積×100%，PVCA （%）=小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積× 100%，每一標本均至少取5個視野測量，計算其均值。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s） 表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1 實驗動物存活情況 左前降支冠脈結扎成功率為100%。冠狀動脈結扎術中死亡8只，術后觀察期間死亡2只，術后第6周末存活29只，存活率74.4%。術后第6周CAMNH組死亡2只，術后第10 周VR組死亡1只，余均存活至實驗結束。

3.2 心電圖改變 手術前，大鼠心率多數高于400 次/min，P波、QRS波、T波正?？杀?；左冠狀動脈前降支結扎即刻Ⅱ導聯(lián)R波振幅明顯抬高，ST段抬高＞0.2mV，T波、ST段與R波融合形成單向曲線，持續(xù)至手術結束，證明造模成功[4]。冠狀動脈結扎術后10周，大鼠心率250～450bpm，VR組、CAMNH組及MSSRT組均可見Q波形成、QRS波及ST-T改變，部分可見早搏；SO組P波、QRS波、T波正常可辨。VR 組R波振幅減小，ST段與T波融合，T波深倒；MSSRT組：QRS波振幅增加，ST段明顯壓低并與T波融合；CAMNH組：QRS波振幅減小，ST段明顯壓低并與T波融合，可見早搏（圖1）。

圖1 大鼠冠脈左前降支結扎術后Ⅱ導聯(lián)心電圖改變

3.3 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較 Vt/Wt（%）VR組明顯重于SO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MSSRT組小于VR組（P＜0.05），但是顯著大于SO組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；CAMNH組明顯小于VR組（P＜0.01），與SO組相近，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CVF（%）：VR組與SO組相比明顯增高（P＜0.01）。MSSRT組與VR組相比明顯降低（P＜0.01），與SO組相比明顯增高（P＜0.01）。CAMNH組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組相比明顯增高（P＜0.01）；與MSSRT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PVCA（%）：VR組與SO組相比明顯增高（P＜0.05）。MSSRT組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CAMNH組與VR組相比明顯降低（P＜0.01）；與SO組MSSRT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較（%，±s）

表1 各組大鼠Vt/Wt、CVF、PVCA比較（%，±s）

注：與VR組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與SO組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；SO：假手術組；VR：心臟重構組；MSSRT：復方黃芪養(yǎng)心合劑組；CAMNH組：美托洛爾緩釋片組；Vt/Wt：心室質量/體質量；CVF：心臟組織膠原容積分數；PVCA：血管周圍膠原面積

3.4 病理形態(tài)學觀察 摘取大鼠心臟時肉眼可見SO組心臟體積正常，心肌組織彈性良好，顏色鮮紅，表面光滑；VR組、MSSRT組、CAMNH組心臟體積變大，顏色暗紅，心肌組織彈性較差，梗死區(qū)室壁顏色灰白，其中VR組最為明顯。

HE染色光鏡下觀察可見SO組心肌橫紋清晰，心肌纖維排列整齊，胞漿染色均勻，胞核清楚，未見炎性細胞浸潤（圖2-A，封四）。VR組可見典型心肌梗死，梗死區(qū)心肌橫紋消失，心肌纖維溶解斷裂，心肌細胞斷裂、核固縮、結構破壞，排列紊亂，伴有炎性細胞浸潤及部分毛細血管新生；非梗死區(qū)心肌纖維排列整齊，心肌橫紋清晰可見；梗死區(qū)與非梗死區(qū)之間邊界清晰可見（圖2-B，封四）。MSSRT組、CAMNH組病變較VR組明顯減輕（圖2-C、D，封四）。

改良Masson染色光鏡下觀察，可清晰顯示心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色（圖3，封四）。SO組心肌間隙有少量散在膠原纖維（圖3-A，封四）；VR組紅色的心肌細胞與藍色的膠原纖維均有廣泛分布并有交界，位于梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處，交界處可見紅色的心肌細胞與藍色的膠原纖維交錯分布，大鼠心肌梗死區(qū)有大量膠原堆積，并可見壞死的不完整心肌細胞（圖3-B，封四）。MSSRT組與CAMNH組可見有藍色的膠原沉積于梗死區(qū)，但較VR組減輕（圖3-C、D，封四）。

心肌內冠狀動脈周圍可見藍色的膠原纖維環(huán)繞，有向細胞間質呈放射狀分布的趨勢（圖4，封四）。SO組在冠脈周圍僅見少量膠原纖維分布（圖4-A，封四），VR組可見在冠脈周圍大量的膠原增生，并向血管周圍的間質延伸（圖4-B，封四）。心肌血管周圍膠原沉積MSSRT組、CAMNH組與VR組相比有明顯減少（圖4-C、D，封四）。

4討論

心室重構過程一方面是指心肌細胞肥厚，心肌細胞凋亡、壞死、增生，甚至纖維化；另一方面指細胞外基質的膠原沉積和纖維化。在VR進程中，以炎性細胞因子升高為標志的免疫激活及膠原代謝異常發(fā)揮著重要作用[5]。心肌膠原是細胞外基質的主要成分，它在維持心臟結構和功能方面起重要作用。正常時膠原的生成和降解在體內處于動態(tài)平衡狀態(tài)，病理條件下，膠原的增多或減少都會引起及心肌纖維化，加重心衰。趙淑明等[6]研究證明葶藶生脈方可調節(jié)慢性心力衰竭大鼠心肌膠原的代謝，改善心功能。沈祥春等[7]研究發(fā)現(xiàn)太子參對急性心肌梗死心力衰竭大鼠心室重構有改善作用。池一凡等[8]研究認為，黃芪可以延緩心肌纖維化及VR的進展。王偉[9]發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰活血解毒中藥可縮小AMI后心室重構大鼠心肌梗死面積，抑制膠原蛋白合成、減少心肌肥厚、心肌纖維化。

本研究發(fā)現(xiàn)，復方黃芪養(yǎng)心合劑能明確降低Vt/ Wt，其作用與美托洛爾緩釋片相當。在間質膠原重構方面可觀察到心室重構心肌間質纖維化和血管周圍纖維化并存，CVF、PVCA增大。復方黃芪養(yǎng)心合劑能明顯降低CVF，抑制心肌間質纖維化，其作用與美托洛爾緩釋片相當；復方黃芪養(yǎng)心合劑能明顯降低PVCA，抑制心肌血管周圍纖維化，其作用與美托洛爾緩釋片相當。

心肌梗死后的心室重構（VR）包括膠原增生和左室的增大，屬中醫(yī)“胸痹”、“虛勞”等范疇。該病為本虛標實之證，主要由于心肌梗死后局部心肌血脈流行不暢，心肌供血不足，又兼手術損耗心肌之氣血，氣血虧虛，日久形成虛勞，造成心臟的擴大。冠狀動脈左前降支結扎術后心脈流行不暢，阻塞心脈，脈絡閉塞，導致水濕內停，化為濕濁。虛、瘀、濕、濁諸邪蓄積以致濁瘀內結，致心肌梗死后心肌纖維化。故而認為心肌梗死后VR的中醫(yī)病機主要為氣血虧虛、濁瘀內結。

復方黃芪養(yǎng)心合劑為院內制劑，長期臨床實踐顯示，應用復方黃芪養(yǎng)心合劑治療冠心病心臟擴大患者，可有效緩解胸悶、胸痛、氣短乏力、心悸心慌等癥，改善VR及心功能。之前的研究[4，10]證實，復方黃芪養(yǎng)心合劑可改善大鼠缺血再灌注室性心律失常，可改善大鼠缺血再灌注心肌細胞縫隙連接蛋白43 （connexin43，Cx43）的分布改變。CAMNH由黃芪、黨參、太子參、苦參、炙甘草、丹參、甘松、山楂等八味中藥組成，方中黃芪、黨參、太子參共同補益心氣，丹參、生山楂活血祛瘀、養(yǎng)血安心，甘松理氣，苦參清熱燥濕，炙甘草益氣和中，全方共起益氣養(yǎng)血、祛瘀化濁之功效。

本研究提示，在冠脈結扎術后心肌梗死所致的VR心肌纖維化血管周圍纖維化的動物模型中，CAMNH對心臟重構、心肌間質和血管周圍膠原重構兩方面都有顯著的抑制作用，其具體作用機制還有待于進一步探討。

［1］戴閏柱.慢性心力衰竭治療的現(xiàn)代概念［J］.中華心血管病雜志，2000，28（1）：75-78.

［2］葉任高.內科學［M］.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社：2001，149.

［3］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1052-1053.

［4］陳啟蘭，龔一萍，祝光禮，等.復方黃芪養(yǎng)心合劑對缺血再灌注大鼠室性心律失常的作用［J］.浙江中醫(yī)雜志，2013，48（4）：267-269.

［5］Aronow WS.Epidemiology，pathophysiology，prognosis，and treatment of systolic and diastolic heart failure［J］.Cardiol Rev，2006，14（3）：108.

［6］趙淑明，郭秋紅，張志良，等.葶藶生脈方對慢性心衰大鼠血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6及心肌膠原的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（1）：153-154.

［7］沈祥春，彭佼，喻斌，等.太子參對急性心肌梗死心力衰竭大鼠心肌重構的作用［J］.貴陽醫(yī)學院學報，2008，33（6）：600-603.

［8］池一凡，何濤，戴紅艷，等.黃芪對尾加壓素Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞膠原合成及分泌轉化生長因子-β1的影響［J］.臨床合理用藥，2010，3（8）：1-2.

［9］王偉.益氣養(yǎng)陰活血解毒中藥對大鼠急性心肌梗死后梗死心肌與心室重構的影響［J］.中國心血管雜志，2012，17 （4）：298-300.

［10］陳啟蘭，龔一萍，祝光禮，等.復方黃芪養(yǎng)心合劑對大鼠缺血再灌注心肌縫隙連接蛋白43的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（5）：1581-1584.

（收稿：2015-01-15 修回：2015-05-15）

Effects of Compound Astragalus Mixture Nourishing Hearton Ventricle Remodeling and Perivascular Colla－gen Fibration in Rats

CHEN Qilan1,ZHU Guangli1,GONG Yiping2,Ren Xingchang3,QI Guoan4,HE Xiaolong1.1 Department of Internal Medicine,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China; 2 Faculty of Traditional Chinese Medical Diagnosis,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China; 3 Department of Pathology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310007),China;4 Department of Internal Medicine,Xiaoshan District Traditional Chinese Medical Hospital of Hangzhou,Hangzhou(311201),China

ObjectiveTo investigatethe effects of compound astragalus mixture nourishing heart（CAMNH）on ventricleremodeling（VR）and perivascularcollagen fibration in SD rats after coronary artery ligation.MethodsEight out of 47 SD rats were randomly selected to receive sham operation（SO）.Another 39 SD rats receivedligation of coronary artery and 29 rats survived after 10 d.The survived rats were randomlydivided into 3 groups:CAMNH group,metoprolol succinate sustained-release tablets（MSSRT）group and VR group.Rats in CAMNH and MSSRT groups were treated withCAMNH（14g·kg-1·d-1）or MSSRT（9.5mg·kg-1·d-1）for 8 weeks.Rats in SO and VR groups were given distilled water intragastrically.The ratio of weight（Wt,g）and ventricleweight（Vt,g）was calculated（Vt/Wt,%）.The VR of rats was observed with upgrading Masson staining and collagen volume fraction（CVF,%）and perivascular collagenvolume area（PVCA,%）were measured with Image Pro Plus 6.0 software.ResultsVt/Wt（%）in MSSRT group and CAMNH groupwere lower than that in VR group（2.77%±0.26%,2.67%±0.17%vs 3.06%± 0.21%,P＜0.05 or 0.01）.CVF（%）and PVCA（%）in MSSRT group and CAMNH group were significantly decreased compared to VR group（CVF:43.89%±6.83%,42.60%±17.55%vs 59.01%±6.93%;PVCA:101.8%±49.7%, 104.1%±41.2%vs 148.1%±69.3%;P＜0.01）.ConclusionCAMNH can reduce Vt/Wt（%）and CVF（%）and PVCA（%）in SD rats after ligation of coronary artery.The effects is similar to MSSRT.

rats;after ligation of coronary artery;cardiac remodeling;compound astragalus mixture nourishing heart;metoprolol;collagen volume fraction;perivascular collagenvolume area

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2008YB012）

1杭州市中醫(yī)院心血管內科（杭州 310007）；2浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學教研室（杭州 310053）；3杭州市中醫(yī)院病理科（杭州310007）；4浙江省杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院內科（杭州 311201）

陳啟蘭，Tel：13588750941，E-mail：1469013813@qq.com

與美托洛爾緩釋片相當。

數；血管周圍膠原面積