蔡兆斌，莊讓笑，潘旭旺，方紅英，黃瑋瑋，邵益丹，張建康，史婷婷，劉壽榮

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市西溪醫(yī)院，浙江杭州 310023）

N-乙酰半胱氨酸對(duì)慢性肝損傷大鼠Nrf2及HO-1和 γ-GCS表達(dá)的影響

蔡兆斌，莊讓笑，潘旭旺，方紅英，黃瑋瑋，邵益丹，張建康，史婷婷，劉壽榮

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市西溪醫(yī)院，浙江杭州 310023）

目的 觀察小劑量N-乙酰半胱氨酸（NAC）注射液對(duì)慢性肝損傷大鼠核因子相關(guān)因子2（Nrf2）及下游分子血紅素氧合酶1（HO-1）和γ谷氨酸-半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的影響。方法 雄性SD大鼠sc給予25%CCl4橄欖油溶液（1 mL·kg-1），每周3次，連續(xù)4周。4周末，將造模成功的大鼠分別ip給予NAC 45，90和180 mg·kg-1及陽(yáng)性對(duì)照谷胱甘肽（GSH）54 mg·kg-1，每日1次連續(xù)4周。檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性及肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、GSH、羥脯氨酸（Hyp）含量或活性；HE染色法觀察肝組織病理變化；免疫組化檢測(cè)肝組織Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清GPT，GOT，MDA和Hyp明顯升高（P＜0.01），Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)及SOD活性和GSH含量無(wú)明顯變化；模型組肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，肝組織可見(jiàn)許多大小不等的圓形空泡，部分肝細(xì)胞水腫，匯管區(qū)伴炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn)；與模型組相比，NAC各治療組大鼠血清GPT和GOT活性明顯降低（P＜0.01），肝組織SOD活性、GSH和Hyp含量下降（P＜0.01，P＜0.05），Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，NAC 45，90和180 mg·kg-1組肝組織Hyp明顯降低（P＜0.01），NAC 45 mg·kg-1組肝組織Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。與NAC 45 mg·kg-1組比較，90和180 mg·kg-1組Nrf2蛋白表達(dá)較低（P＜0.01）。結(jié)論 小劑量NAC可能通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2及下游因子HO-1和γ-GCS的表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用進(jìn)而發(fā)揮防治慢性肝損傷進(jìn)展的目的。

乙酰半胱氨酸；慢性肝損傷；核因子NF-E2相關(guān)因子2；血紅素氧合酶1；γ谷氨酸-半胱氨酸合成酶

慢性肝損傷是多種嚴(yán)重肝疾病的發(fā)生發(fā)展及最終走向肝功能衰竭的始動(dòng)環(huán)節(jié)和共同途徑［1］。研究表明，抗氧化應(yīng)激可能有助于防止慢性肝損傷的進(jìn)展，在其防治中有重要意義［2］。核因子相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是抗氧化酶表達(dá)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在穩(wěn)定氧化-抗氧化平衡、減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的組織損傷中起關(guān)鍵性作用［3］。

N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體，能提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）的生物合成［4］，并具有多途徑抗生物氧化作用［5］。通過(guò)多年研究，我院成功將NAC開發(fā)成治療慢性重型肝炎的藥物，于2003年通過(guò)國(guó)家新藥評(píng)審并應(yīng)用于臨床，規(guī)格為3%，7.5 g∶250 mL，靜滴，每日1次，給廣大重型肝病患者提供了新的治療藥物。不過(guò)，由于該藥濃度高，注射劑量大，患者易發(fā)生惡心、嘔吐、面部潮紅和血管性水腫等不良反應(yīng)［6］，因此，開發(fā)小劑量的NAC注射制劑用于慢性肝損傷的治療具有重要的臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，NAC能影響肝組織GSH、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血紅素氧化酶（hemeoxygenase-1，HO-1）活性，改善肝損傷大鼠病理變化，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［7-9］。為進(jìn)一步探討小劑量NAC對(duì)慢性肝損傷的防治機(jī)制，本研究觀察了小劑量NAC（1%，1 g∶100 mL）對(duì)慢性肝損傷大鼠Nrf2及下游分子HO-1和γ谷氨酸-半胱氨酸合成酶（γ-glutamate cysteine synthetase，γ-GCS）在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

雄性SD大鼠93只，體質(zhì)量120～140 g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，大鼠生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）2014-0001；大鼠使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0008。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在屏障環(huán)境中進(jìn)行。

NAC注射液（自制，批號(hào)20150724）；GSH（阿拓莫蘭）（重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20150428）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate pyruvate transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxa?loacetic transaminase，GOT）檢測(cè)試劑盒（北京豪邁）；SOD、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH和羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。一抗Nrf2（16396-1-AP），HO-1（10701-1-AP），γ-GCS（10601-1-AP）及其相應(yīng)二抗試劑（武漢三鷹）。RevertAid?第一鏈cDNA合成試劑盒（美國(guó)Thermo，#K1622）；FastStart Uni?versal SYBR Green Master（Rox）（美國(guó)Roche，04 913 914 001）；CCl4（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20141014）；橄欖油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20140822）。AU5421型生化儀（日本奧林巴斯公司）；DG5033A型酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）；RM2016型病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；ECLIPSE TI-S R正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。ABI Step one plus熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 模型制備和分組

SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，sc給予25%CCl4橄欖油溶液1 mL·kg-1進(jìn)行造模，每周3次，連續(xù)4周。4周末，隨機(jī)取3只進(jìn)行血清和病理切片檢查，血清GPT和GOT顯著升高，肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，肝組織可見(jiàn)許多大小不等的圓形空泡，肝細(xì)胞水腫，匯管區(qū)伴炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，表示造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組，每組15只，分別為模型組、NAC 45，90和180 mg·kg-1組及GSH（陽(yáng)性對(duì)照）組，另設(shè)正常對(duì)照組（15只）。參照藥品說(shuō)明書，進(jìn)行人和大鼠間體表面積折算的等效劑量比值設(shè)定GSH陽(yáng)性藥對(duì)照組劑量為54 mg·kg-1。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置大劑量NAC含量為3%，小劑量NAC含量為1%。各給藥組按劑量給藥，正常對(duì)照組和模型組ip給予等量滅菌生理鹽水，每日1次，連續(xù)4周。在藥物治療期間，除正常對(duì)照組外，sc給予25%CCl4橄欖油溶液1 mL·kg-1，每周1次，至治療結(jié)束。

1.3 樣品采集

于末次給藥24 h后，ip給予3%戊巴比妥鈉（2 mL·kg-1）麻醉后，腹腔靜脈取血，離心留取血清。分離肝組織，一部分-80℃凍存?zhèn)溆茫Ｓ嗖糠钟?0%甲醛固定，作病理檢查和免疫組化。

1.4 血清肝功能指標(biāo)GPT和GOT活性檢測(cè)

血清采用全自動(dòng)生化分析儀，按試劑盒說(shuō)明書對(duì)GPT和GOT活性進(jìn)行測(cè)定。

1.5 肝組織氧化和抗氧化指標(biāo)MDA，GSH，Hyp和SOD檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取肝組織質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）= 1∶9的比例加入9倍的生理鹽水，冰水浴條件下制成10%的組織勻漿，838×g，離心10 min，取上清液測(cè)定肝組織勻漿中MDA，GSH，Hyp和SOD的含量或活性。

1.6 肝組織病理觀察

肝組織切片，常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察肝細(xì)胞性狀和炎癥情況。

1.7 免疫組化法檢測(cè)Nrf2，HO-1和 γ-GCS蛋白的表達(dá)

通過(guò)石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、BSA或者血清封閉、加一抗、加二抗、DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核和脫水封片等步驟，最后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。一抗稀釋比均為1∶200，二抗為即用型。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件選擇圖片上免疫組化反應(yīng)物的黃色區(qū)域，然后測(cè)量這些區(qū)域的積分吸光度值（integrated absorbance，IA），除以圖片中組織的面積（S），計(jì)算IA/S，表示Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以x±s形式表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA進(jìn)行處理，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠血清GPT和GOT活性的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清GPT和GOT活性顯著升高（P＜0.01），表明模型大鼠有明顯肝損傷，造模較成功。與模型組比較，NAC 45，90和180 mg·kg-1組和陽(yáng)性對(duì)照組GPT和GOT活性均明顯降低（P＜0.01），提示NAC能明顯改善肝功能。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，NAC 45，90和180 mg·kg-1組GPT和GOT均無(wú)明顯變化。

Tab.1 Effect of N-acetylcysteine（NAC）on activity of GPT and GOT in serum of rats with chronic hepatic injury induced by carbon tetrachloride（CCl4）

2.2 NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠肝組織抗氧化應(yīng)激的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組肝MDA和Hyp明顯升高（P＜0.01），SOD和GSH無(wú)明顯變化，提示模型組大鼠出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，NAC 45和90 mg·kg-1組GSH和Hyp含量和SOD活性下降（P＜0.05，P＜0.01），NAC 180 mg·kg-1組僅GSH和Hyp含量下降（P＜0.05，P＜0.01），各劑量組MDA無(wú)明顯變化，提示NAC 45 mg·kg-1有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，Hyp含量降低（P＜0.01），其他指標(biāo)差異均無(wú)顯著差異。

2.3 NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響

圖1結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞無(wú)明顯水腫、脂肪變性和炎癥，組織基本正常。模型組肝細(xì)胞廣泛脂肪變性，肝組織可見(jiàn)許多大小不等的圓形空泡，部分肝細(xì)胞水腫，匯管區(qū)伴炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn)。陽(yáng)性對(duì)照組及NAC 45，90和180 mg·kg-1組未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞。

Fig.1 Effect of NAC on pathological changes of liver injured by CCl4in rats（HE×200）.See Tab.1 for rat treat?ments.Black arrows show steatosis cells；red arrows show edema degeneration cells.

2.4 NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠肝組織Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)的影響

圖2結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；與模型組比較，NAC45 mg·kg-1組Nrf2，HO-1和γ-GCS表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01），NAC 90和80 mg·kg-1組無(wú)明顯變化。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，NAC 45 mg·kg-1組Nrf2和180 mg·kg-1組HO-1蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），其他指標(biāo)均無(wú)明顯變化。與NAC 45 mg·kg-1劑量組比較，90和180 mg·kg-1組Nrf2蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。提示小劑量NAC可能通過(guò)增加Nrf2及其下游因子HO-1和γ-GCS的激活和釋放，進(jìn)而達(dá)到防止慢性肝損傷的目的。

Tab.2 Effect of NAC on levels of SOD，MDA，GSH and Hyp in liver tissue of rats with chronic hepatic injury induced by CCl4

Fig.2 Effect of NAC on Nrf2，HO-1 and γ-GCS in rat liver injured by CCl4detected by immunohistochemistry.See Tab.1 for rat treatments.Black arrows show adipose degeneration；red arrows show endochylema puff and hypochromatic；yellow arrow shows expression of Nrf2；B was the semi-quantitative result of A.Nrf2：nuclear factor-eythroid 2 related factor 2；HO-1：hemeox?ygenase-1；γ-GCS：γ-glutamate cysteine synthetase.x±s，n=15.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，慢性肝損傷模型組大鼠血清GPT和GOT明顯升高，肝組織MDA和Hyp含量增加，SOD活性和GSH含量降低；病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞變性和炎癥較明顯；同時(shí)，慢性肝損傷模型組大鼠Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，提示CCl4刺激后大鼠肝組織Nrf2在一定程度上被激活；由于本模型大鼠氧化應(yīng)激水平增高，推測(cè)慢性肝損傷時(shí)肝組織Nrf2被激活，啟動(dòng)下游保護(hù)性氧化酶HO-1和γ-GCS，以發(fā)揮其在組織氧化損傷的病理?xiàng)l件下保護(hù)細(xì)胞的作用。

Nrf2是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，它能在活性氧或親電試劑的刺激下，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant respon?sive element，ARE）相互作用，從而誘導(dǎo)下游保護(hù)性Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，達(dá)到細(xì)胞保護(hù)的作用［2］。HO-1是Ⅱ相酶中一種重要的抗氧化酶，在針對(duì)有害刺激的內(nèi)源性和外源性起源細(xì)胞保護(hù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。其抗氧化功能一方面與其阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)有關(guān)，另一方面，HO-1及其酶解產(chǎn)物膽紅素、CO共同發(fā)揮著抗氧化、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡和擴(kuò)血管、改善組織微循環(huán)等作用［10-11］。Nrf2/HO-1通路廣泛參與心、腦、肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官的抗氧化應(yīng)激損傷，是機(jī)體最重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一。GSH主要在肝合成，是細(xì)胞內(nèi)主要的還原劑，能清除體內(nèi)超氧離子和自由基，保護(hù)細(xì)胞膜完整性，是肝抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。GSH的生物合成是在γ-GCS和GSH合成酶催化下將底物谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸按順序合成。γ-GCS是由Nrf2和ARE調(diào)控的Ⅱ相酶，是合成GSH的限速酶。

本研究觀考察了小劑量NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠Nrf2及其下游因子HO-1和γ-GCS的影響。結(jié)果表明，應(yīng)用小劑量NAC干預(yù)后，大鼠肝組織Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)較模型組有不同程度的提高，部分指標(biāo)甚至高于陽(yáng)性對(duì)照組，表明小劑量NAC可提高參與機(jī)體抗氧化應(yīng)激的Nrf2及其下游因子HO-1和γ-GCS的激活和釋放，進(jìn)而達(dá)到防止慢性肝損傷的目的。在Nrf2，HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)方面，NAC 45 mg·kg-1組明顯高于其他2組，且Nrf2兩者表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明小劑量NAC對(duì)慢性肝損傷大鼠Nrf2及其下游因子HO-1和γ-GCS的影響存在劑量差異。

目前，NAC注射液主要是在綜合治療基礎(chǔ)上用于肝衰竭早期治療，以降低膽紅素、提高凝血酶原活動(dòng)度。我們后期的研究發(fā)現(xiàn)，NAC在用于肝纖維化，酒精性肝損傷以及某些病毒性肝損傷大鼠動(dòng)物模型時(shí)，也顯示出較佳的效果［7，12-13］。小劑量NAC在防治慢性肝損傷進(jìn)展方面表現(xiàn)良好，但其他動(dòng)物模型是否也有NAC類似藥理作用，有待進(jìn)一步研究。

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Effect ofN-acetylcysteine on Nrf2，heme oxygenase-1 and γglutamate cysteine synthetase in rats with chronic hepatic injury

CAI Zhao-bin，ZHUANG Rang-xiao，PAN Xu-wang，F(xiàn)ANG Hong-ying，HUANG Wei-wei，SHAO Yi-dan，ZHANG Jian-kang，SHI Ting-ting，LIU Shou-rong
（Hangzhou Xixi Hospital，Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310023，China）

OBJECTIVE To observe the effect of N-acetylcysteine on nuclear factor-eythroid 2 related factor 2（Nrf2），heme oxygenase-1（HO-1）and γ-glutamate cysteine synthetase（γ-GCS）in rats with chronic hepatic injury.METHODS The rats were divided into normal control and model groups.25%CCl4olive oil solution（1 mL·kg-1）was given by subcutaneous injection to induce a chronic hepatic injury rat model，3 times a week，for 4 weeks.At the end of the 4thweek，rats with chronic hepatic injury were equally divided into 5 groups：NAC 45，90 and 180 mg·kg-1groups，glutathione（GSH）54 mg·kg-1group（positive model group）and model group.Normal control and model groups were given the same volume of sterilized normal sodium，once a day，for 4 weeks.At the end of the 8thweek，all the rats were sacrificed.The levels of glutamate pyruvate transaminase（GPT），glutamic oxa?loacetic transaminase（GOT）in serum and superoxide dismutase（SOD），malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH）and hydroxyproline（Hyp）in hepatic tissue were detected.Liver histopathological changes were observed.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Nrf2，HO-1 and γ-GCS in hepatic tissue.The mRNA levels of Nrf2，HO-1 and γ-GCS in the liver were detected by real?time PCR.RESULTS Compared with normal control group，levels of GPT，GOT，MDA and Hyp were raised（P＜0.01），while protein expresssion of Nrf2 and HO-1 and γ-GCS，levels of SOD and GSH had no statistical difference.There was extensive adipose degeneration in hepatic cells in model group，and round vacuoles of different size were seen in hepatic tissue.Some hepatic cells developed edema，and portal areas were infiltrated with inflammatory cells.Compared with normal control group，GPT and GOT in serum，SOD，GSH and Hyp in hepatic tissue in NAC groups were decreased（P＜0.05，P＜0.01）.Compared with positive control group，Hyp in hepatic tissue declined obviously in NAC 45，90 and 180 mg·kg-1groups（P＜0.01）.Nrf2 expression in NAC 45 mg·kg-1groups increased obviously（P＜0.01）.Compared with NAC 45 mg·kg-1group，Nrf2 expression in NAC 90 and 180 mg·kg-1groups declined（P＜0.05，P＜0.01）.CONCLUSION Low-dose broncholysin could protect against oxidative stress and prevent chronic hepatic injury by regulating the expression of Nrf2，HO-1 and γ-GCS.

N-acetylcysteine；chronic hepatic injury；nuclear factor-erythroid 2 related factor 2；heme oxygenase-1；γ-glutamate cysteine synthetase

LIU Shou-rong，E-mail：lsr85463990@sina.com，Tel：（0571）86481818

R975

A

1000-3002-（2016）11-1136-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.002

Foundation item：The project supported by Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau Program（20130733Q30）；Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau Program（20130633B09）；and Hangzhou Major Scientific and Technological Innovation Program（20142013A60）

2015-04-29接受日期：2016-10-27）

（文本編輯：賀云霞）

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130733Q30）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130633B09）；杭州市重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目（20142013A60）

蔡兆斌，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事心血管和肝病臨床及治療藥物研究，E-mail:czbys@sina.com，Tel：（0571）86481888。

劉壽榮，E-mail:lsr85463990@sina.com，Tel:（0571）86481818