莫瑞祥 楊 威 李西融 廖文勝 張慧明 陳澤峰 黃 芳

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院 1外一科；2 病理科，桂林市 541002)

肝細(xì)胞性肝癌中p28GANK基因的表達(dá)與凋亡基因bax、bcl-2表達(dá)的關(guān)系▲

莫瑞祥1楊 威1李西融2廖文勝1張慧明1陳澤峰1黃 芳1

(廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院 1外一科；2 病理科，桂林市 541002)

目的 探討p28GANK基因在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。方法 收集肝細(xì)胞性肝癌組織68例、正常肝組織30例，采用免疫組化法檢測標(biāo)本中p28GANK基因、凋亡基因Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果 p28GANK在肝細(xì)胞性肝癌和正常肝組織中的陽性表達(dá)率分別為73.5%和6.7%，肝細(xì)胞性肝癌中p28GANK基因的表達(dá)高于正常肝組織(P<0.01)。肝細(xì)胞性肝癌組織Bax的表達(dá)明顯低于正常肝組織(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.05)。肝細(xì)胞性肝癌組織p28GANK的表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，但與Bax的表達(dá)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 p28GANK蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)，p28GANK和凋亡抑制基因Bcl2的共同表達(dá)可能在肝細(xì)胞性肝癌中起協(xié)同作用。

肝腫瘤；p28GANK；Bcl-2；Bax；免疫組織化學(xué)

研究表明,p28GANK基因主要參與了Rb、MDM2-p53等重要信號(hào)途徑的調(diào)控,調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[1～3]。本研究通過p28GANK基因、凋亡因子Bcl-2、Bax的聯(lián)合檢測，觀察p28GANK基因、Bcl-2 和Bax在肝細(xì)胞性肝癌的表達(dá)情況，探究肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制及在此過程中p28GANK基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 標(biāo)本選取2010年1月至2015年12月我院病理科存檔的蠟塊標(biāo)本，肝細(xì)胞性肝癌68例，正常肝組織30例，病例均未接受放療和化療。肝細(xì)胞性肝癌病例中，男42例，女26例，年齡21～72歲，中位年齡40歲。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 主要試劑 兔抗人p28GANK單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，Bcl-2鼠抗人單克隆抗體(即用型)、Bax鼠抗人單克隆抗體(即用型)、S-P法即用型抗兔免疫組織化學(xué)超敏UltraSensitiveTM SP試劑盒、正常非免疫羊血清和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)S-P法染色及評估 組織芯片切片脫蠟、水化后，置入3%H2O2中室溫30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常非免疫羊血清室溫封閉30 min，分別滴加p28GANK抗體(濃度1：50)、Bcl-2抗體(即用型)和Bax(即用型)抗體，置密封濕盒中4℃過夜，滴加即用型生物素標(biāo)記二抗和標(biāo)記過氧化物酶的鏈霉菌抗生物素蛋白，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽性的結(jié)腸腺癌切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 評估方法 參照文獻(xiàn)[4]評估結(jié)果，由兩位未知患者臨床病理資料的資深病理醫(yī)師獨(dú)立觀察， p28GANK免疫組化染色陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)和胞核，bcl-2和bax的陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)。每例標(biāo)本至少隨機(jī)觀察3個(gè)視野(×200)，根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度判定染色結(jié)果。無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞<30%記 1分，30%～60%記2分，>60%記3分；無染色記0分，弱陽性記1分，陽性記2分，強(qiáng)陽性記3分。兩項(xiàng)評分分值相加0～2分為表達(dá)陰性，3～6分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)， 組間相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p28GANK基因和凋亡基因bax、bcl-2的表達(dá) 免疫組化檢測結(jié)果見圖1。p28GANK表達(dá)陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒。68例肝細(xì)胞性肝癌組織中有50例p28GANK表達(dá)陽性，陽性率為73.5%。30例正常肝組織中有2例p28GANK呈弱陽性表達(dá)，陽性率為6.67%。肝細(xì)胞性肝癌組織與正常肝組織相比，p28GANK的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

Bax、Bcl-2陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。68例肝細(xì)胞性肝癌組織中有15例Bax呈陽性表達(dá)，表達(dá)率為22.1%，而30例正常肝組織中有20例Bax呈陽性表達(dá)，陽性率為66.7%。肝細(xì)胞性肝癌組織Bax的表達(dá)明顯低于正常肝組織(P<0.05)。Bcl-2在68例肝癌組織中有45例呈陽性表達(dá)，陽性率為 66.2%。30例正常肝組織中有9例Bcl-2呈陽性表達(dá)，陽性率為30.0%。肝細(xì)胞性肝癌組織Bcl-2的表達(dá)明顯高于正常肝組織(P<0.05)。見表1。

表1 p28GANK、bax、bcl-2在肝細(xì)胞性肝癌和正常肝組織中的表達(dá) [n(%)]

2.2 免疫組化檢測 45例Bcl-2陽性表達(dá)者中p28GANK陽性表達(dá)占33例，陽性率為73.33%；而23例Bcl-2陰性表達(dá)者中p28GANK陽性表達(dá)占9例，陽性率為39.13%15例Bax陽性表達(dá)者中p28GANK陽性占10例，陽性率為66.67%；而53例Bax陰性表達(dá)者中p28GANK陽性表達(dá)40例， 陽性率為75.47%。

p28GANK Bcl-2 Bax

3 討 論

3.1 p28GANK表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 細(xì)胞凋亡與腫瘤關(guān)系密切，細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因異常是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，多種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，與細(xì)胞增殖平衡的失調(diào)在腫瘤的病程中起重要作用[5]。p28GANK促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展機(jī)制主要與MDM2-p53、Rb等通路相關(guān)。MDM2-p53通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，MDM2在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變潛能。研究表明，p28GANK能夠與MDM2 N-端RING結(jié)構(gòu)域結(jié)合而激活后者引起構(gòu)象變化，從而發(fā)揮與p53結(jié)合功能，促進(jìn)p53泛素化而降解，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[6-8]。Rb蛋白能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等多種惡性生物學(xué)行為，p28GANK過表達(dá)可以促進(jìn)Rb磷酸化，使其出核后在胞漿降解[9，10]。陳平平等[11]報(bào)道，p28GANK 在肝門膽管癌表達(dá)顯著高于正常膽管上皮組織，其高表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，對于肝門膽管癌患者術(shù)后預(yù)后判斷具有一定有指導(dǎo)意義，也為膽管癌診斷及生物靶向治療提供新的思路。文獻(xiàn)報(bào)道p28GANK 在食管癌、結(jié)腸癌、胰腺導(dǎo)管癌[12～14]等消化道惡性腫瘤中表達(dá)顯著增強(qiáng)。本文應(yīng)用免疫組化檢測p28GANK表達(dá)，肝細(xì)胞性肝癌組織中陽性率為73.5%，正常肝組織陽性率為6.7%，肝細(xì)胞性肝癌組織表達(dá)率明顯高于正常肝組織，提示p28GANK基因表達(dá)與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生可能相關(guān)，p28GANK有作為肝癌的輔助腫瘤標(biāo)記物的潛質(zhì)。

3.2 Bcl-2和Bax與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生相關(guān) Bcl-2和Bax一對凋亡因子，Bcl-2抑制凋亡而Bax促進(jìn)調(diào)亡，它們可以通過調(diào)控細(xì)胞凋亡而達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)，凋亡抑制因子Bcl-2蛋白的過度表達(dá)已被證實(shí)存在于多種腫瘤組織中[15]。楊連君等[16]報(bào)道，Bcl-2在正常肝組織的陽性率只有4.2%，而在肝癌組織為25.8%，差異顯著。Bax在正常肝組織的陽性率為70.8%，在肝癌組織為43.9%，差異顯著，肝癌組織的Bcl-2和Bax陽性率與其病理分級之間均未見明顯的相關(guān)性。本文應(yīng)用免疫組化檢測68例肝細(xì)胞性肝癌組織中Bcl-2和Bax陽性表達(dá)率，肝細(xì)胞性肝癌組織Bcl-2的表達(dá)明顯高于正常肝組織而肝細(xì)胞性肝癌組織Bax的表達(dá)明顯低于正常肝組織，說明Bcl-2和Bax與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。

3.3 p28GANK和凋亡抑制基因Bcl-2的共同表達(dá)可能在肝細(xì)胞性肝癌中起協(xié)同作用 本研究中結(jié)果顯示，45例Bcl-2陽性表達(dá)者中p28GANK陽性表達(dá)占33例，陽性率為73.33%；而23例Bcl-2陰性表達(dá)者中p28GANK陽性表達(dá)占9例，陽性率為39.13%，推測p28GANK與Bcl-2可能通過作用于細(xì)胞凋亡的不同階段協(xié)同發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，從而在促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)同作用；而p28GANK與Bax可能通過不同途徑對凋亡起作用。因細(xì)胞凋亡過程存在一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，故肝癌中細(xì)胞凋亡各個(gè)信號(hào)途徑之間的相互聯(lián)系與相互作用仍需進(jìn)一步研究。

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Expression of p28GANK gene in hepatocellular carcinoma and its relationship with Bcl-2 and Bax expression

MORuixiang1,YANGWei1,LIXirong2,LIAOWensheng1,ZHANGHuiming1,CHENZefeng1,HUANGFang1

(1DepartmentofSurgery, 2DepartmentofPathology,NanxishanHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Guilin, 541002,China)

Objective To investigate the expression of p28GANK gene in hepatocellular carcinoma(HCC) and its relationship with apoptosis. Methods 68 cases of hepatocellular carcinoma and 30 cases of normal liver tissues were collected. The expression of p28GANK gene and apoptosis gene Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry in HCC and normal liver tissues. Results The positive expression of p28GANK in HCC and normal liver tissues were 73.5%，6.67%, respectively. p28GANK in HCC was significantly higher than that in normal liver tissues(P<0.01). The expression of Bax in HCC was significantly lower than that in normal liver tissues (P<0.05), but the expression of Bcl-2 in HCC was significantly higher than that in normal liver tissues (P<0.05). The expression of p28GANK was positively correlated with the expression of Bcl-2 (P<0.05), but not correlated with Bax(P>0.05). Conclusion The expression of p28GANK protein may be related to the tumorigenesis and progress of hepatocellular carcinoma, and the co-expression of p28GANK and apoptosis inhibitory gene Bcl-2 may play a synergistic role in HCC.

Liver neoplasms; p28GANK; Bcl-2；Bax；Immunohistochemistry

廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(編號(hào)：重2012014)

莫瑞祥(1965～)，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：肝膽腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

R 735.7

A

1673-6575(2016)06-0823-03

10.11864/j.issn.1673.2016.06.03

2016-08-04

2016-09-30)