郭振紅，曹雪濤

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腫瘤免疫細胞治療的現(xiàn)狀及展望

郭振紅，曹雪濤

近年來，腫瘤的免疫治療因其對于常規(guī)療法無效的晚期腫瘤具有顯著療效而受到極大關(guān)注，并于2013年被《Science》評為年度十大科技突破之首，為轉(zhuǎn)移性晚期腫瘤治療帶來新的希望。實際上，免疫療法已經(jīng)經(jīng)歷了一個多世紀的發(fā)展。腫瘤的免疫療法始于Coley的發(fā)現(xiàn)，他于1891年報道給患者注射細菌產(chǎn)物后可以引起腫瘤縮小，被認為是誘導(dǎo)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。1909年，Ehrlich提出假設(shè)“免疫系統(tǒng)可以保護機體免于發(fā)生腫瘤”，并由Thomas等和Burnet進一步發(fā)展，提出“腫瘤的免疫監(jiān)視”理論。腫瘤抗原的設(shè)想和發(fā)現(xiàn)則推動了免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用的研究，并奠定了腫瘤免疫治療的“中心法則”，即CD8+T細胞可以特異性地殺傷表達腫瘤抗原的腫瘤細胞。除了CD8+T細胞，20世紀70年代DC和NK細胞的先后發(fā)現(xiàn)及近年來的進一步研究更證明了這兩種細胞在腫瘤免疫中的重要作用：2010年，DC疫苗成為第一個FDA批準的治療性腫瘤疫苗。2015年底，美國前總統(tǒng)卡特現(xiàn)身說法，證實利用PD-1抗體的免疫治療配合手術(shù)和放療控制了他的黑素瘤。腫瘤的免疫治療在近10年來獲得了突飛猛進的發(fā)展，然而，腫瘤免疫治療領(lǐng)域仍然存在著許多懸而未決的科學(xué)難題，仍然需要進一步強化基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。在本文中，筆者以T細胞、NK細胞和DC細胞這三個在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要效應(yīng)的關(guān)鍵細胞為出發(fā)點，對近年來免疫治療的研究進展進行總結(jié)，并對后續(xù)需要解決的問題作一下展望。

1　T細胞治療

T細胞是目前認為唯一能夠特異性殺傷腫瘤細胞的細胞。DC將抗原提呈給T細胞，誘導(dǎo)T細胞的活化和增殖，包括CD4+輔助性T細胞和CD8+殺傷性T細胞。腫瘤抗原特異性T細胞一直是腫瘤治療的重要目標。目前來看，正在進行的針對T細胞的腫瘤免疫治療，可以分為兩大類，一類是T細胞過繼療法，主要包括Steve Rosenberg教授一直在進行的從患者TIL中擴增腫瘤特異性T細胞進行回輸；另一類是通過基因修飾的方法，在正常T細胞表面表達能夠識別腫瘤抗原的受體，包括T細胞受體（T cell receptor, TCR）基因修飾T細胞（TCR-T）和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）修飾T細胞（CAR-T）。而第二類是免疫檢查點抑制劑療法。

1.1T細胞過繼療法

作為能夠特異性殺傷腫瘤細胞的細胞，T細胞的過繼回輸治療開創(chuàng)了免疫細胞治療腫瘤的先河。早在1985年，Rosenberg等就發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射IL-2和LAK細胞可以使某些轉(zhuǎn)移性黑素瘤維持長久地消退，提示有特異性的T細胞擴增。但由于全身性的毒性反應(yīng)及Treg的擴增導(dǎo)致療效不佳，最終無法全身使用IL-2進行腫瘤治療。進一步的體外實驗發(fā)現(xiàn)，從黑素瘤中提取出來的淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）含有能識別自身腫瘤的特異性細胞。隨后臨床試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自身TILs可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的客觀消退。

在從患者TILs中擴增腫瘤特異性T細胞后進行回輸?shù)脑囼炛?，早期發(fā)現(xiàn)注射幾天后在循環(huán)中就無法找到相應(yīng)的細胞；后來發(fā)現(xiàn)，在TILs回輸之前，實行非清髓性預(yù)處理可以有效促進腫瘤的消退以及回輸淋巴細胞的長期存活及擴增，從而達到良好的治療效果：客觀反應(yīng)率達30%～60%。目前TILs療法主要集中在黑素瘤的治療，偶有涉及宮頸癌和膽管癌。主要原因在于，黑素瘤的外顯子突變率遠遠高于其他腫瘤，這些大量的突變所編碼的腫瘤抗原表位成為能夠重復(fù)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性TILs的基礎(chǔ)，也是后續(xù)TIL治療的靶標。在轉(zhuǎn)移性黑素瘤，結(jié)合化療或者放療，TILs療法的客觀反應(yīng)率可以達到50%～70%。但是，一系列原因阻止了TIL療法的廣泛應(yīng)用：早期分離步驟需要新鮮的腫瘤組織；TILs擴增有難度；擴增后的TIL細胞功能受損；來自于腫瘤微環(huán)境的負向調(diào)節(jié)（如PDL的表達以及Treg的活化）等。如何解決這些問題將成為日后研究的重點。最新的研究提示，黑素瘤患者可以通過檢測外周血中PD-1的表達來發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原特異性的T細胞，該結(jié)果對于TILs療法的影響將拭目以待。

為了產(chǎn)生針對其他腫瘤的特異性T細胞，相應(yīng)的技術(shù)應(yīng)運而生。首先，研究者把正常的、能夠識別腫瘤通過MHC分子提呈腫瘤抗原的TCR插入到患者T細胞上，擴增后回輸患者。2006年，研究者首次發(fā)現(xiàn)，特異性表達識別MART-1黑素瘤TCR的T細胞可以誘導(dǎo)腫瘤消退。但特異性問題隨之而來：由于TCR識別抗原具有MHC限制性，因此TCR特異性T細胞的臨床應(yīng)用受到限制。另外，TCR與抗原之間的親和力很弱，容易造成交叉反應(yīng)和脫靶毒性。

為解決這一問題，Eshhar等提出用抗原-抗體的識別區(qū)與TCR的信號分子融合可能會誘導(dǎo)T細胞特異性活化而不需要識別MHC分子，這種融合結(jié)構(gòu)被稱為CAR。這種由CAR修飾的T細胞（CAR-T）克服了MHC的限制性，從而更有效地殺傷抗原特異性的腫瘤細胞；同時，由于不依賴于MHC分子，減少了由于腫瘤降低MHC分子表達而造成的免疫逃逸，而且，抗原抗體結(jié)合特異性好、親和力高，這一切決定了CAR-T療法在臨床應(yīng)用上具有很大的優(yōu)勢。2010年，表達識別CD19的嵌合受體的淋巴細胞用于治療晚期B淋巴瘤療效明顯；隨后，CD19特異性的CAR-T被應(yīng)用于治療慢性淋巴細胞白血病和淋巴瘤，收到了很好的療效：病情得到超過2年的長期緩解。在這些臨床試驗中，回輸?shù)蛣┝康腡細胞在體內(nèi)大量擴增，同時伴隨腫瘤細胞的裂解和正常CD19+B細胞的清除。由于正常B細胞清除、腫瘤細胞裂解和大量細胞因子分泌導(dǎo)致的副作用也時有報道。通過對CD19特異性CAR治療B細胞惡性腫瘤（包括慢性淋巴細胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤）的臨床療效進行分析，可以發(fā)現(xiàn)，總反應(yīng)率為48%，6個月和1年的無進展生存率分別為43%和27%，可以提示CAR-T在治療血液性惡性腫瘤確實具有強大的療效。

CAR的結(jié)構(gòu)經(jīng)歷快速的發(fā)展。其基本結(jié)構(gòu)包括兩部分，胞外包括腫瘤抗原抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，胞內(nèi)是T細胞活化的分子（如CD3ζ、FcRγ、CD28或者41BB、FcRγ），二者連在一起組裝在T細胞上。CAR結(jié)構(gòu)第一代只有一個胞內(nèi)信號組分，主要是CD3ζ或者FcRγ，T細胞可以被活化但無法增殖，主要靶向不同惡性腫瘤細胞表面的L1CAM、CD20和carbonicanhydrase-Ⅸ（CAⅨ），但療效甚微。第二代CAR具有兩個胞內(nèi)信號組分，包括一個共刺激分子，如CD28、41BB、OX40或者ICOS和CD3ζ，這樣的結(jié)構(gòu)決定了T細胞即便沒有外源性共刺激分子也可以不斷增殖，而且共刺激分子可以活化相關(guān)的信號通路如ERKp38、JNK和NF-κB等。第三代CAR具有三個胞內(nèi)信號區(qū)，包括CD28、CD3ζ、41BB或OX40。研究表明，胞內(nèi)有三個共刺激信號的三代CAR結(jié)構(gòu)使細胞具有更強的腫瘤裂解能力和更多的因子分泌，并在小鼠體內(nèi)具有更強的腫瘤抑制能力。第四代CAR結(jié)構(gòu)與前三代不同，因表達特定的細胞因子（目前主要是IL-12）而被稱為TRUCK（T-cells redirected for universal cytokine killing），可以在具有免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境中釋放促炎性因子，從而有助于招募并活化更多的免疫細胞而增強免疫反應(yīng)。

由于TCR-T和CAR-T都是需要根據(jù)特定的腫瘤抗原來設(shè)計TCR和CAR，因而選擇合適的靶向腫瘤抗原就非常重要。一個用HER2/Neu特異性的CAR（CD28-CD137-z）-T細胞治療的患者在回輸細胞后死亡，可能與心肺等重要正常組織表達相應(yīng)的抗原有關(guān)。另外，哪種T細胞亞群更適合用作制備TCR-T和 CAR-T從而保證其在體內(nèi)更好地生存、增殖和記憶形成？有研究發(fā)現(xiàn)，不成熟的細胞，如中心記憶性T細胞（TCM）比效應(yīng)記憶性T細胞（TEM）和效應(yīng)性T細胞（TE）在體內(nèi)能更好地存活并具有更好的抗腫瘤效果。更有研究者發(fā)現(xiàn)，一種干細胞樣記憶性T細胞亞群具有比TCM更強的抗腫瘤效果。另外，目前CAR-T主要應(yīng)用于血液腫瘤，在實體瘤由于缺乏特異性的TAA靶點、實體瘤微環(huán)境的抑制性特點以及腫瘤體積巨大T細胞難以趨化等因素療效欠佳。

1.2免疫檢查點抑制劑療法

除了采用過繼回輸腫瘤抗原特異性的T細胞來增強對腫瘤的免疫效應(yīng)，目前采用免疫檢查點抑制方法，即“松開剎車”的方法，來增強T細胞的功能，也取得了令人振奮的結(jié)果。FDA已經(jīng)批準了共刺激抑制分子包括CTLA-4、PD-1及PD-L1的抗體用于治療晚期黑素瘤、小細胞肺癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌，多個相關(guān)抗體目前用于多種腫瘤的臨床試驗。在T細胞活化增殖的過程中，CD28作為最重要共刺激分子與來自于抗原提呈細胞的CD80/CD86作用，促進T的活化，隨后胞內(nèi)預(yù)先合成的CTLA-4會轉(zhuǎn)移到胞膜，以更強的結(jié)合力與CD80/CD86結(jié)合，抑制T細胞的活化與增殖。由于CTLA-4在負向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的重要作用，在臨床試驗中，其阻斷性抗體往往炎性副反應(yīng)發(fā)生率非常高。但由于在黑素瘤患者體內(nèi)存在高頻腫瘤特異性的T細胞，因而仍大約有20%的患者可以從該項治療中獲益。2011年CTLA-4抗體ipilimumab由于Ⅲ期臨床治療晚期惡性黑素瘤整體生存率顯著延長而在美國和歐洲獲批上市。在非黑素瘤的腫瘤中，ipilimumab目前顯示了有限的抗腫瘤效應(yīng)。例如在腎癌，ipilimumab單獨應(yīng)用只能引起10%的部分反應(yīng)率。在副作用方面，15%～30%接受CTLA-4抗體治療的患者往往伴隨嚴重的免疫相關(guān)的副作用，有時甚至致死，主要發(fā)生在皮膚、腸道和內(nèi)分泌腺體。

PD-1功能與CTLA-4相似，但是，雖然T細胞活化后也表達PD-1，阻斷PD-L1與PD-1相互作用后的效應(yīng)主要發(fā)生于腫瘤的免疫微環(huán)境中：PD-L1主要表達在腫瘤細胞表面，這也與臨床觀察到的PD-1和PD-L1抗體在自身免疫方面副作用要低于CTLA-4的情況相一致；另外，多項臨床試驗顯示，相比CTLA-4抗體，PD-L1與PD-1抗體具有更廣泛的抗腫瘤活性。目前，多個PD-1和PD-L1抗體已經(jīng)獲批上市。抗PD-1 nivolumab第一個臨床試驗就提示可以治療多種腫瘤，包括上皮細胞癌、惡性黑素瘤和和結(jié)直腸癌。在晚期難治性非小細胞肺癌、腎癌和惡性黑素瘤，其客觀反應(yīng)率分別為17%、27%和31%；而且即便停藥后療效仍可維持，長期隨訪發(fā)現(xiàn)，其總存活期分別為9.9、22.4和16.8個月。最近一個Ⅲ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，利用nivolumab作為一線藥物治療晚期黑素瘤，比標準的化療具有優(yōu)勢；PD-1和PD-L1的阻斷性抗體已經(jīng)在惡性黑素瘤、腎細胞癌和非小細胞性肺癌的臨床試驗中證實有效。Nivolumab和MPDL3280A已經(jīng)被美國FDA批準上市，但他們在膀胱癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸部腫瘤、胃腸道腫瘤及乳腺癌中的抗癌效果仍需要進一步地研究。

除了CTLA-4和PD-1，目前也有很多其他的免疫檢查點抑制劑已經(jīng)或者即將走上臨床試驗，其中很多與PD-L1共同表達在腫瘤細胞表面，包括LAG-3、KIR、B7-H3和TIM-3、TIGIT、VISTA等。另外，雖然IDO不是經(jīng)典意義上的檢查點分子，但是在某些腫瘤中，那些通過過表達IDO來發(fā)揮抑制功能的通路在下調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在，IDO抑制劑D-1MT和小分子抑制劑INCB024360、NLG919都已經(jīng)進入臨床，初步顯示出抗腫瘤效應(yīng)。

2　NK細胞治療

NK細胞因其不需預(yù)先致敏就可以殺死病毒感染的細胞或者腫瘤細胞而得名。除此之外，NK細胞還可以產(chǎn)生多種細胞因子調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，因此，NK細胞是固有免疫系統(tǒng)中非常重要的一群細胞。NK細胞的功能執(zhí)行主要通過兩大類細胞表面受體，包括殺傷細胞活化受體（killer activation receptor，KAR）和殺傷細胞抑制受體（killer inhibitory receptor，KIR）進行調(diào)控。正常情況下，KIR 與MHCⅠ類分子結(jié)合，產(chǎn)生抑制性信號，盡管自身細胞上多糖類抗原與KAR結(jié)合產(chǎn)生活化性信號，但由于抑制性占主導(dǎo)地位，從而保證了自身細胞不被NK殺傷。但是，當細胞表面MHCⅠ類分子的表達降低或者缺失，抑制性信號功能減弱，NK則被活化，殺傷相應(yīng)的細胞。活化后的NK細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性顆粒，或者表達Fas 和TRAIL誘導(dǎo)靶細胞發(fā)生凋亡。

在對NK細胞的分子特征和功能調(diào)控深入研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)以NK細胞為基礎(chǔ)的免疫治療可能引發(fā)腫瘤免疫治療的新的突破。雖然早期的IL-2活化的淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokine-activated killer cell，LAK）治療腫瘤效應(yīng)不佳，但NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)在2002年獲得確認。接受同種異體骨髓回輸?shù)募毙粤＜毎籽。╝cute myeloblastic leukemia，AML）患者，由于KIR 和HLA-C不匹配，復(fù)發(fā)率明顯降低，表明供體來源的NK細胞介導(dǎo)了針對AML的同種異體抗原的反應(yīng)而沒有導(dǎo)致移植物抗宿主反應(yīng)。根據(jù)這一策略，向AML患者過繼回輸體外活化的同種異體KIR不匹配NK細胞，或者向惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者回輸體外活化的自體NK細胞獲得了一定的治療效果。但目前看來，過繼回輸NK細胞若想獲得更好的療效，還需要解決NK細胞抑制性受體的效應(yīng)并清除Treg等一系列問題。

為了解決NK細胞抑制性受體的效應(yīng)，研究者們進行了深入的研究。體外實驗表明，使用IPH2102單抗阻斷KIR2DL1、KIR2DL2和KIR2DL3，可以增加NK細胞的抗腫瘤活性。在AML和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究已證實KIR單抗的安全性，雖然目前KIR單抗單獨應(yīng)用并沒有展示出顯著的抗腫瘤效應(yīng)，然而其與CTLA-4或PD-1抑制劑聯(lián)用效果仍值得期待。除此之外，更多的研究也集中于抑制性受體，如NKG2A或者LAG3等，觀察其對NK細胞抗腫瘤功能的影響，對其功能將拭目以待。除了研究KIR和KAR 對NK功能的調(diào)控，人們對其他分子對NK細胞的功能調(diào)控也進行了研究。近期的研究表明，某些情況下，活化的NK細胞也表達PD-1和CTLA4。一項研究表明，在MM患者體內(nèi)，NK細胞表達PD-1，而且，應(yīng)用PD-1單抗（CT-011）可以恢復(fù)NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)；此外，應(yīng)用PD-L1的IgG1單抗還可能激發(fā)NK細胞的ADCC效應(yīng)。目前，CTLA-4抗體對NK細胞的影響并不清楚，但是，聯(lián)合應(yīng)用溶瘤病毒和CTLA4阻斷抗體表明NK細胞參與了抗腫瘤效應(yīng)。由于近期靶向PD-1和CTLA-4的多個抗體獲得批準，因此，進一步深入研究PD-1和CTLA-4對NK功能的影響具有重要的意義。

同時，由于CAR-T在血液腫瘤治療中的良好效果，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在NK細胞表達腫瘤CAR也獲得初步成功。研究者們用NK細胞系NK-92或者從外周血分離出來的原代NK細胞，轉(zhuǎn)染針對多種特異性腫瘤抗原的CAR，如CD19、CD20、HER2等，在異種移植模型中顯示了針對腫瘤細胞的反應(yīng)增強，腫瘤生長受到抑制。相比較于CAR-T，表達CAR的NK細胞由于不能自分泌IL-2從而決定了其體內(nèi)生存期較短，從而避免了一些脫靶效應(yīng)。同時，即便靶向抗原在腫瘤上的表達迅速丟失，表達CAR的NK仍然可以通過自身的KAR獲得活化，因此攜帶CAR的NK細胞具有更大的優(yōu)勢。人們期待表達CAR的原代NK細胞在治療白血病的Ⅰ期臨床試驗的結(jié)果，從而更好地了解表達CAR的NK細胞在患者體內(nèi)的行為及造成的結(jié)果。

3　DC治療性疫苗

DC是專職抗原提呈細胞，負責對抗原進行加工處理后提呈給T細胞，誘導(dǎo)T細胞的活化和增殖，激發(fā)有效的免疫應(yīng)答。由于DC在免疫應(yīng)答過程中的核心地位，而且DC在體外培養(yǎng)成功，使其成為腫瘤免疫治療中最重要的力量之一。第一個基于DC的治療性腫瘤疫苗的臨床試驗是應(yīng)用于B細胞淋巴瘤，此后，大量的臨床研究應(yīng)用于多種腫瘤，到目前為止，在惡性黑素瘤、前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腎癌已經(jīng)進行到Ⅲ期臨床試驗。Dendreon公司的sipuleucel-T（或稱Provenge）于2010年獲得FDA的批準，它利用患者自身的外周血單個核細胞在體外培養(yǎng)DC，并在培養(yǎng)過程中加入前列腺癌抗原PAP-GM-CSF后回輸給患者，應(yīng)用于治療無癥狀或癥狀輕微的轉(zhuǎn)移性去勢難治性前列腺癌，是迄今為止首個被FDA批準的治療性腫瘤疫苗。盡管客觀有效率評價顯示治療效果有限（＜5%），但在Ⅲ期臨床試驗中，sipuleucel-T可以比安慰劑平均延長患者4.1個月的生存期（25.8個月相對于21.7個月）。這一系列的臨床試驗證明，基于DC疫苗的治療非常安全，能夠在腫瘤患者體內(nèi)激發(fā)保護性的抗腫瘤免疫而沒有發(fā)生重大的毒副作用。但是如何進一步提高療效，就成為目前DC治療性疫苗研究的重點。

目前基于DC的治療性腫瘤疫苗，主要分為兩種，一種是DC體外荷載抗原后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，另外一種是誘導(dǎo)DC在體內(nèi)攝取腫瘤抗原。二者的共同目的都是最大程度活化腫瘤抗原特異性CD4+和CD8+T細胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

3.1利用DC體外荷載抗原的治療性疫苗

除了近年來有研究從外周血分離DC用于免疫治療，通過外周血CD14+單核細胞或者CD34+的造血干細胞體外培養(yǎng)獲得成熟DC是最常用的方法。在此過程中，DC的培養(yǎng)方法、誘導(dǎo)DC成熟的方式、腫瘤抗原的選擇及荷載方式以及免疫方式是決定DC疫苗抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵因素。

3.1.1DC的培養(yǎng)方式 盡管利用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)DC被認為是金標準，但由此產(chǎn)生的所謂IL-4DC與體內(nèi)傾向于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的CD14+皮膚DC相似，因而在誘導(dǎo)Th1型抗腫瘤免疫反應(yīng)中不是最優(yōu)選擇。以往的研究表明，郎格漢斯細胞（langerhans cell，LC）在激活抗原特異性的CTL反應(yīng)方面，優(yōu)于皮膚DC和moDC。因此，研究者開發(fā)了新的培養(yǎng)DC的方法，利用新的細胞因子組合從外周血CD14+單核細胞或者CD34+的造血干細胞培養(yǎng)產(chǎn)生LC樣的DC，以期激發(fā)更強的抗腫瘤反應(yīng)。

3.1.2誘導(dǎo)DC成熟的方式 DC的成熟狀態(tài)是決定DC免疫效果的重要因素。目前常用的促進DC成熟的策略包括使用某些細胞因子組合，如TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2或者Toll樣受體（TLR4、TLR7和TLR9）的激動劑。其中，利用TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IFN-α和TLR3激動劑poly（I：C）來培養(yǎng)促進Th1型反應(yīng)的DC，已經(jīng)用于臨床試驗治療復(fù)發(fā)性惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。另外一種值得一提的誘導(dǎo)DC成熟的方式是利用電穿孔的方式，在非成熟DC組成性表達三個分子TLR4、CD40L和CD70，由此產(chǎn)生的TriMixDC在黑素瘤患者取得了很有希望的結(jié)果。需要注意的是，這些TLR激動劑，不僅影響DC的功能狀態(tài)，還影響到腫瘤微環(huán)境中具有免疫負向調(diào)節(jié)效應(yīng)的細胞MDSCs和Tregs的生成。

3.1.3腫瘤抗原的選擇 從1991年第一個腫瘤抗原被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，已經(jīng)有100多種腫瘤抗原陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。對于已經(jīng)明確的腫瘤抗原，可以通過合成抗原肽或編碼特定腫瘤抗原的核酸來制備腫瘤抗原。對于未明確的腫瘤抗原，制備DC疫苗時，通常采用反復(fù)凍融腫瘤細胞，利用凋亡的腫瘤細胞或凋亡小體的方法來獲取腫瘤抗原，亦可將腫瘤細胞與DC相融合。最新的研究表明，腫瘤的外泌體因為含有大量的腫瘤細胞的信息，在決定腫瘤的器官轉(zhuǎn)移偏好及早期診斷中發(fā)揮重要作用，同時也可以作為腫瘤抗原的來源用于荷載DC。用不同形式的腫瘤細胞來源的抗原荷載DC的好處是可以獲得腫瘤細胞的所有的抗原，但往往也可能造成提呈無關(guān)抗原或自身抗原，誘導(dǎo)耐受或者自身免疫。但由于壞死的腫瘤細胞可以釋放大量的HSPs和HMGB1，從而促進了DC的成熟，而凋亡的腫瘤細胞除了釋放HSPs和HMGB1之外，其表面則可以表達大量的有助于DC吞噬的calreticulin，從而可以有效對抗腫瘤細胞來源的具有負向調(diào)節(jié)作用的IL-10或者TGF-β的作用。因此，有研究表明，用壞死或者凋亡的腫瘤細胞荷載的DC確實可以誘導(dǎo)有效的CTL反應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，用腫瘤干細胞裂解液荷載的DC，比荷載腫瘤細胞裂解液的DC在小鼠體內(nèi)可以誘導(dǎo)更強的抗腫瘤反應(yīng)，這為腫瘤抗原的獲取提供了新的思路。

3.2誘導(dǎo)DC在體內(nèi)攝取腫瘤抗原

目前主要是利用針對DC受體的抗體與某一特定抗原形成嵌合蛋白來達到在體內(nèi)誘導(dǎo)DC攝取腫瘤抗原的目的，有研究發(fā)現(xiàn)，利用DC表面的內(nèi)吞受體的抗體交聯(lián)抗原，可以比液態(tài)抗原提高DC活化T細胞的效率100倍以上，從而有效促進DC的抗腫瘤效應(yīng)。但需要注意的是，由于不同的DC亞群可以激發(fā)不同的免疫反應(yīng)，因此識別CD8+DC的CD205抗體和識別CD8-DC的33D1抗體會最終激發(fā)不同的抗腫瘤免疫應(yīng)答：CD8+DC可以通過MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子提呈抗原；CD8-DC則只能通過MHCⅡ類分子提呈抗原。而且，表達CD205的DC通過CD70依賴的機制觸發(fā)細胞免疫，而CD8+33D1+DC通過經(jīng)典的IL-12依賴的方式產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。同時，靶向DC不僅僅局限于運送抗原。研究者們也分別檢測了不同的共刺激信號結(jié)合抗原后對DC的效應(yīng)，如dectin1、DC-SIGN、CD40等，這些靶向抗體同時也促進了DC的活化。但需要注意的是，不同的活化信號會引起DC功能發(fā)生極化，比如DC-ASGPR會造成DC分泌IL-10而負向調(diào)節(jié)DC的抗腫瘤效應(yīng)。

目前看來，單純DC疫苗雖有療效但仍須改進，需要尋找更為合適的腫瘤抗原、更有效地促進DC活化的方法或者與其他方法聯(lián)合使用。需要注意的是，若結(jié)合其他療法，需設(shè)計實施得法，以保證在促進DC抗腫瘤效應(yīng)的同時，注意檢測負向調(diào)節(jié)方面的變化。比如，以往的研究發(fā)現(xiàn)，DC疫苗結(jié)合全身性應(yīng)用IL-2會造成外周血中Treg比例上升。

4　展望

免疫細胞治療經(jīng)過長足的發(fā)展，已經(jīng)在多種腫瘤的治療上發(fā)揮了很好的療效，給人們帶來了曙光。然而，如何進一步提高療效與特異性，擴大適應(yīng)證，是未來研究的方向。其中，對于免疫細胞的工程化修飾如何簡便可行并具有腫瘤與患者個體化特點，尚需進一步優(yōu)化；進一步深入研究免疫細胞回輸體內(nèi)之后遷移過程的分子機制以設(shè)法將其引導(dǎo)至腫瘤部位或者免疫激發(fā)器官，也是值得探索的一個方向；對于腫瘤細胞如何逃逸免疫監(jiān)視與殺傷機制的深入研究，可以提供更多的腫瘤免疫治療靶點。同時，結(jié)合精準醫(yī)學(xué)發(fā)展，篩選生物標志物，從而可以預(yù)篩選過繼細胞治療可以發(fā)揮作用的腫瘤患者，將對于腫瘤的免疫細胞治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。另外，如何將傳統(tǒng)的腫瘤治療方法與現(xiàn)有的免疫細胞治療相結(jié)合，或者將不同的免疫細胞療法相結(jié)合，從而達到最好的療效，仍需要進一步的探究。最后，利用健康大數(shù)據(jù)，建立新的免疫細胞治療的評價體系，也顯得非常重要：大量的臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過免疫治療后患者的長期生存率往往高于客觀反應(yīng)率，而且，由于在免疫治療早期腫瘤可能會因為淋巴細胞的浸潤以及炎癥反應(yīng)而增大，因此，單純檢測腫瘤大小、腫瘤標志物等指標不能完全實際反應(yīng)免疫治療的效應(yīng)，整體生存率可能才是最重要的指標，但對于臨床試驗而言，觀察整體生存率可能會耗時過長而且費用增加?？傊[瘤治療是一個長期、復(fù)雜、需要不同治療方案協(xié)同進行的過程，更深入了解免疫反應(yīng)的調(diào)控因素，從不同的角度增強免疫細胞治療的效應(yīng)，將為腫瘤的免疫細胞治療提供更多途徑。

【作者單位：第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點實驗室】

（摘自《中國腫瘤生物治療雜志》2016年第2期）