馮永輝，于曉飛，曹雅明，朱曉彤*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng)110032;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遼寧沈陽(yáng)110122)

中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲株裂殖子頂端膜抗原1 (PfAMA1)Domain I的基因多態(tài)性分析

馮永輝1，3，于曉飛2，曹雅明3，朱曉彤3*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧沈陽(yáng)110001;2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng)110032;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，遼寧沈陽(yáng)110122)

明確中國(guó)和緬甸邊境地區(qū)惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1蛋白的基因特點(diǎn)。收集中緬邊境地區(qū)88例惡性瘧原蟲感染患者血樣，制備血樣濾紙片;試劑盒提取惡性瘧原蟲基因組DNA(gDNA);PCR和測(cè)序檢測(cè)分析惡性瘧原蟲PfAMA1基因的Domain I(DI)區(qū)域的多態(tài)性。成功擴(kuò)增88例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1胞外段DI區(qū)域基因，與惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株3D7比較，檢測(cè)出31個(gè)分離位點(diǎn)，18個(gè)單倍型，單倍型多樣度為0.794。其中c1特別是c1L區(qū)域的基因多樣性顯著高于其他檢測(cè)區(qū)域。同時(shí)，分子進(jìn)化分析顯示，DI區(qū)域及其中的c1和c1L區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。研究發(fā)現(xiàn)，中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1基因DI區(qū)和其中c1、c1L區(qū)域高度多態(tài)，提示上述區(qū)域作為紅內(nèi)期疫苗候選抗原研制靶位的可能性。

惡性瘧原蟲;PfAMA1;基因多態(tài)性;中緬邊境

KeywordsPlasmodium falciparum;PfAMA1;genetic polymorphism;China-Myanmar border

惡性瘧原蟲是可感染人類的五種瘧原蟲中致病性最為嚴(yán)重的瘧原蟲種屬，每年世界范圍內(nèi)有43.8萬(wàn)人死于惡性瘧感染，其中65%為5歲以下兒童［1］?？顾幵x株和耐藥蚊蟲的出現(xiàn)，使惡性瘧的防治面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。安全有效的瘧疾疫苗研制是防治瘧疾的重要措施之一。然而，紅內(nèi)期原蟲抗原多態(tài)性和瘧原蟲的免疫逃避機(jī)制阻礙了紅內(nèi)期疫苗的研發(fā)進(jìn)程。對(duì)紅內(nèi)期疫苗候選抗原的基因多態(tài)性分析，是疫苗研制開發(fā)必備的前期基礎(chǔ)。惡性瘧原蟲株裂殖子頂端膜抗原1(PfAMA1)是惡性瘧主要的紅內(nèi)期疫苗候選抗原，已進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)［2］。PfAMA1基因編碼蛋白表達(dá)于裂殖子頂端復(fù)合體結(jié)構(gòu)的微線體內(nèi)，分泌到裂殖子表面與RON蛋白形成緊密連接復(fù)合體，在原蟲侵襲宿主紅細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。早期研究表明，PfAMA1基因的Domain I(DI)區(qū)域高度多態(tài)，在分子進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇，為PfAMA1疫苗研制的主要靶位［4］。且DI區(qū)域中c1、c1L、c2和c3區(qū)域表達(dá)在PfAMA1蛋白表面。其中，c1L區(qū)域中197位氨基酸的突變與AMA1疫苗的特異性相關(guān)［5］。因此深入探討PfAMA1基因多態(tài)性將為瘧疾疫苗的研制提供參考。目前，尚未見關(guān)于中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲發(fā)病阻斷疫苗候選抗原PfAMA1基因DI區(qū)域和其中的c1、c1L、c2和c3區(qū)域基因特點(diǎn)的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)中緬邊境地區(qū)惡性瘧分離株P(guān)fAMA1基因的多態(tài)性特點(diǎn)和分子進(jìn)化學(xué)進(jìn)行分析，為我國(guó)惡性瘧紅內(nèi)期疫苗的研制和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

QIAamp DNA Mini Kit試劑盒(德國(guó));QIA-quick Gel Extraction Kit試劑盒(QIAGEN，加州，美國(guó));ABI Prism BigDyeTM cycle sequencing kit (Applied Biosystems，加州，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和基因組DNA提取2011年4月至2013年10月間，于緬甸西北部中緬邊境地區(qū)的瘧疾診所就診的患者中采集患者指尖血制備血樣干濾紙片。通過(guò)姬姆薩染色厚血膜法確認(rèn)惡性瘧原蟲感染血樣。按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書提取惡性瘧原蟲基因組DNA。

1.2.2 PfAMA1基因Domain I區(qū)域的PCR擴(kuò)增和測(cè)序采用PfAMA1基因Domain I(DI)區(qū)域的特異性PCR引物:Pfama1_nF(5'-GATGCTGAAGTAGCTGGAACTC-3')和Pfama1_nR(5'-CCCATAATCCGAATTTTGCATTCTG-3')擴(kuò)增PfAMA1基因DI區(qū)(堿基位點(diǎn)(nucleotide position，nt)445～906 bp;氨基酸位點(diǎn)(amino acid position，aa)148～302)。PCR反應(yīng)包含2 μL的10×KOD-Plus-Neo緩沖液，2 μL的2 mmol/L dNTPs，0.8 μL的25 mmol/L MgSO4，各0.5 μL的10 μmol/L引物，0.5單位的KOD-Plus-Neo DNA聚合酶(Toyobo，Osaka，Japan)，1.0 μL基因組DNA模板，終體積20 μL。反應(yīng)條件:94℃2 min;45個(gè)循環(huán)的94℃15 s，56℃15 s，68℃90 s;最終68℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒提取純化。純化的PCR產(chǎn)物采用Pfama1_nF和Pfama1_nR引物，ABI Prism BigDyeTM cycle sequencing kit和ABI PRISM 310基因分析儀分析測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì)和基因多態(tài)性分析選用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株3D7株作為參照，采用MEGA6.0軟件對(duì)比分析88個(gè)中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲序列［6］。MEGA6.0軟件比對(duì)分析輸出的Fasta文件采用DnaSP v5.10.1軟件計(jì)算分離位點(diǎn)(the number of segregating sites，S)、平均核苷酸差異數(shù)(the average number of nucleotide differences，k)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型(the number of haplotypes，H)和單倍型多樣度(haplotype diversity，Hd)［7］。

1.2.4 分子進(jìn)化分析采用DnaSP5.10.1軟件分析PfAMA1的DI區(qū)域的非同義核苷酸置換率dN和同義核苷酸置換率dS比值，F(xiàn)u and Li’s D*and F*檢驗(yàn)及Tajima’s D檢驗(yàn)值和統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)Fu and Li’s D*and F*檢驗(yàn)Tajima’s D檢驗(yàn)值顯著大于0時(shí)，可用于推斷瓶頸效應(yīng)和平衡選擇;當(dāng)Fu and Li’s D*and F*檢驗(yàn)Tajima’s D檢驗(yàn)值顯著小于0時(shí)，可用于推斷群體規(guī)模放大和定向選擇［8］。采用Plasmodium reichenowi(GenBank nos.AJ252087)為瘧原蟲種間參考株［9］，通過(guò)Mc-Donald-Kreitman(MK)檢測(cè)，考查PfAMA1的DI區(qū)域在種內(nèi)和種間的非同義與同義突變的比值。通過(guò)Fisher精準(zhǔn)檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證零假設(shè)，當(dāng)檢驗(yàn)值顯著大于0時(shí)，可用于推斷瓶頸效應(yīng)和平衡選擇;當(dāng)檢驗(yàn)值顯著小于0時(shí)，可用于推斷群體規(guī)模放大和定向選擇［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

本研究成功擴(kuò)增了88例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因的Domain I(DI)區(qū)域(nt:445～906 bp;149～302 aa)461 bp長(zhǎng)度片段，包含c1(187～207 aa)、c1L(197～207 aa)、c2(242～245 aa和282～286 aa)和c3(172～175 aa)，見圖1。

2.2 基因多態(tài)性分析

88例樣本的PfAMA1基因DI區(qū)域和其中的c1、c1L、c2和c3區(qū)域核苷酸多樣性(π)分別為0.020、0.037、0.090、0.050/0.084和0.056;平均核苷酸差異數(shù)(k)在各檢測(cè)段分別為9.046、4.938、3.251、0.600/1.265和0.675。88例惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因DI分屬18個(gè)單倍型(H)，單倍型多樣度(Hd)為0.794，見表1。Sliding window plot分析結(jié)果顯示PfAMA1基因DI的c1區(qū)，特別是c1L的基因多態(tài)性明顯高于c2、c3和c4區(qū)，見圖2A。同時(shí)，c1特別是c1L區(qū)域氨基酸突變水平明顯高于其他檢測(cè)區(qū)域，見圖2B。

表1 中緬邊境地區(qū)88個(gè)惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因多態(tài)性分析Table 1Estimation of nucleotide diversity of PfAMA1 in 88 P.falciparum isolates from the China-Myanmar border area

2.3 分子進(jìn)化分析

2.3.1 dN/dS比值分析DnaSP v5.10.1軟件分析結(jié)果顯示PfAMA1基因DI區(qū)和其中的c1和c1L區(qū)同義核苷酸置換率dS分別為0.001、0.005和0.022，非同義核苷酸置換率dN分別為0.003、0.045和0.111，dN/dS分別為18.299、9.125和4.982。同時(shí)，對(duì)PfAMA1基因DI區(qū)和其中的c1和c1L區(qū)的分析結(jié)果顯示，上述區(qū)域的非同義置換顯著高于同義置換，見表2。

圖1 P.falciparum和P.reichenowi AMA1蛋白序列比對(duì)Fig.1Alignment of P.falciparum and P.reichenowi AMA1 protein sequences各矩形框標(biāo)記分別為c3、c1和c2區(qū)域;黃色背景所示為c1L區(qū)域;紅色加粗字體間所示區(qū)域?yàn)镈omain I(DI);淺藍(lán)色字體標(biāo)記為中緬邊境地區(qū)PfAMA1基因氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)Black Boxes indicate c3，c1 and c2，respectively;The c1L region was highlighted by yellow color;Domain I(DI)was shown by red bold letters;The polymorphic sites of PfAMA1 from China-Myanmar border area were indicating by light blue color

圖2 中緬邊境樣本PfAMA1基因DI區(qū)基因多態(tài)性的sliding window plot和各位點(diǎn)氨基酸突變水平分析Fig.2Sliding window plot of nucleotide diversity and amino acid polymorphism analysis of PfAMA1 ectodomain in China-Myanmar border isolatesA:PfAMA1基因DI區(qū)基因多態(tài)性的sliding window plot圖;B:PfAMA1基因DI區(qū)各位點(diǎn)氨基酸突變數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖，紅色區(qū)域所示為c1區(qū)A:Sliding window plot of nucleotide diversity of PfAMA1 DI:B:The amino acid polymorphism analysis of PfAMA1，The c1 region was indicates by red color

2.3.2 Fu and Li’s D*and F*檢驗(yàn)對(duì)中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1的DI區(qū)和其中的c1和c1L區(qū)域的Fu and Li’s D*and F*檢測(cè)結(jié)果分別為1.941和2.104、1.618和1.915、1.426和1.644，見表2。其中，PfAMA1的DI區(qū)和其c1區(qū)域的Fu and Li’s D*and F*中性檢測(cè)結(jié)果拒絕零假設(shè)，因此，中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因的DI和其c1區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中偏離中性進(jìn)化模型，經(jīng)歷顯著的陽(yáng)性選擇作用(P＜0.02和P＜0.001)，見圖3和表2。

2.3.3 McDonald-Kreitman(MK)檢驗(yàn)基于種內(nèi)多態(tài)性和種間分歧度之間數(shù)據(jù)比較的MK檢驗(yàn)顯示，PfAMA1基因DI區(qū)的Fisher檢測(cè)結(jié)果拒絕零假設(shè)，在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷顯著的陽(yáng)性選擇作用(P＜0.02)，見表2。

表2 中緬邊境地區(qū)88個(gè)惡性瘧原蟲分離株P(guān)fAMA1基因分子進(jìn)化分析Table 2Estimation of summary statistics of PfAMA1 in 88 P.falciparum isolates from the China-Myanmar border area

圖3 中緬邊境樣本PfAMA1基因DI區(qū)Fu and Li’s D*and F*檢驗(yàn)sliding window plot圖Fig.3Sliding window plots of Fu and Li’s D*and F*testA:Fu and Li’s D*檢驗(yàn);B:Fu and Li’s F*檢驗(yàn)，直線以上區(qū)域所示P＜0.05A:Fu and Li’sD*test:B:Fu and Li’s F*test，Regions above lines shows P＜0.05

3 討論

2014年中國(guó)瘧疾病例為3 078例，境外輸入性瘧疾占98.1%，其中惡性瘧疾占61.1%［11］。由于邊境地區(qū)的人口流動(dòng)，輸入性瘧疾疫情仍不容忽視。因此，本研究旨在通過(guò)對(duì)中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲疫苗候選抗原PfAMA1基因的DI區(qū)域，和其內(nèi)部蛋白表面表位區(qū)域的基因多態(tài)性和分子進(jìn)化模式分析，為中緬邊境地區(qū)惡性瘧原蟲的防控提供理論依據(jù)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PfAMA1基因的DI和其內(nèi)部表達(dá)于PfAMA1蛋白表面的c1、c1L、c2和c3區(qū)域與瘧原蟲抗原逃逸和感染后對(duì)宿主的致病性高度相關(guān)［12］?；蚨鄳B(tài)性分析顯示，PfAMA1基因的DI區(qū)域的31個(gè)分離位點(diǎn)中51.6%(16/31)定位于c1區(qū)域，其中68.8%(11/16)的分離位點(diǎn)集中于c1L區(qū)域。c1和c1L區(qū)域的平均核苷酸差異數(shù)(k)和核苷酸多樣性(π)顯著高于c2和c3區(qū)域。同時(shí)，DI區(qū)域中c1和c1L的單倍型數(shù)目亦明顯高于c2和c3區(qū)域，提示PfAMA1基因DI區(qū)域中c1和c1L區(qū)域高度多態(tài)，提示在進(jìn)化過(guò)程中受宿主免疫系統(tǒng)選擇作用。采用PfAMA1單克隆抗體進(jìn)行的發(fā)病阻斷疫苗研究顯示，PfAMA1蛋白的c1L和c1區(qū)域中197、200、201、204和225位點(diǎn)的氨基酸突變可阻斷單克隆抗體與PfAMA1蛋白的結(jié)合，從而抑制發(fā)病阻斷疫苗效果［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，中緬邊境地區(qū)PfAMA1基因的c1和c1L區(qū)域在基因和蛋白水平高度多態(tài)，同時(shí)在197、200、201和225位點(diǎn)存在氨基酸多態(tài)性，提示上述區(qū)域在制備發(fā)病阻斷疫苗過(guò)程中可能影響疫苗免疫效果。

本研究選取DI區(qū)域中多態(tài)性水平較高的c1和c1L區(qū)域進(jìn)行分子進(jìn)化分析。DI區(qū)域和其中的c1和c1L區(qū)域的dN/dS比值均顯著大于1(P＜0.001)，提示上述區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。同時(shí)，F(xiàn)u and Li’s D*and F*檢驗(yàn)結(jié)果顯示，DI區(qū)域和其中的c1和c1L區(qū)域的D*和F*檢驗(yàn)值大于1，且DI和c1區(qū)域D*和F*值顯著大于1，提示DI和其c1區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。采用Plasmodium reicheinow原蟲株作為種間對(duì)照進(jìn)行的MK檢驗(yàn)同樣證明DI區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。上述結(jié)果提示PfAMA1基因的DI，特別是DI內(nèi)的c1和c1L區(qū)域?yàn)樗拗鞅Ｗo(hù)性免疫系統(tǒng)作用的靶位。

本研究首次檢測(cè)了中緬邊境惡性瘧原蟲流行地區(qū)PfAMA1基因DI區(qū)域，和其中位于PfAMA1蛋白表面的c1、c1L、c2和c3區(qū)域的基因多態(tài)性特點(diǎn)，并對(duì)DI區(qū)和其中的c1和c1L區(qū)域進(jìn)行了分子進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，上述區(qū)域高度多態(tài)，且DI區(qū)和其內(nèi)部c1和c1L區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷陽(yáng)性選擇。本研究為我國(guó)邊境地區(qū)開發(fā)AMA1惡性瘧原蟲疫苗的研究和應(yīng)用提供參考。

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Genetic Polymorphism Analysis of Plasmodium falciparum Apical Membrane Antigen I(PfAMA1)Domain I in China-Myanmar Border Area

FENG Yong-hui1，3，YU Xiao-fei2，CAO Ya-ming3，ZHU Xiao-tong3
(1.Dept.of Lab.Med.，1st Hosp.，China Med.Uni.，Shenyang 110001;2.Dept.of Neurol.，4th Affil.Hosp.，China Med.Uni.，Shenyang 110032;3.Teach＆Res.Div.Immunol.，Coll.of Basic Med.Sci.，China Med.Uni.，Shenyang 110122)

In order to confirm the genetic features of Plasmodium falciparum vaccine candidates PfAMA1 protein in China-Myanmar border area，88 blood samples from patients infected by P.falciparum in the border area were collected，and prepared filter paper sheets of blood samples，and extracted genomic DNA of P.falciparum with reagent kid; as well as PCR and sequence determination to analyse the polymorphism of Domain I(DI)of P.falciparum’s PfAMA1 gene.The DNA sequence of PfAMA1 gene of extracellular Domain I(DI)was amplified successfully by PCR and compared with standard 3D7 strain of P.falciparum and isolated 31 segregation sites，18 haploid types，with haploid diversity of 0.794.Among them the diversity in c1 especially c1L domains significantly higher than the other tested domains.At the same time，molecular evolution analyses showed that during the evolution process DI domain and of its c1 and c1L domains had experienced positive choice.The study has found that the candidate vaccine antigen PfAMA1 gene of DI domain and its c1 and c1L domains of P.falciparum in China-Myanmar border has high polymorphism，suggested that the above mentioned areas have the possibility to develop target of endoerythrocytic stage vaccine candidate antigen.

Q78;R382.3+1

A

1005－7021(2016)04－0036－05

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.006

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(81301455)

馮永輝男，講師，博士。主要從事抗感染免疫研究。E-mail:Yonghuif@gmail.com

*通訊作者。女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事抗感染免疫研究。E-mail:zhu.xt918@gmail.com

2016-02-23;

2016-04-04