（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

實驗研究

健脾益智膠囊對MCAO大鼠海馬NT3及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

馮珂，紀立金

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122）

［目的］探討健脾益智膠囊對大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)素3（NT3）及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。［方法］建立MCAO大鼠模型，隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組。采用免疫組化法、Bederson評分、Morris水迷宮實驗、跳臺實驗于術(shù)后7 d、14 d、28 d觀察MCAO大鼠海馬NT3的表達及學(xué)習(xí)記憶能力的改善情況。［結(jié)果］隨著術(shù)后時間的增加，模型組、西藥組、中藥組大鼠Bederson評分逐漸減少，組內(nèi)各時間點的評分均有顯著性差異（P<0.05）；與模型組比較中藥組與西藥組同時間點評分差異顯著（P<0.05），且中藥組評分優(yōu)于西藥組（P<0.05）。隨著術(shù)后時間的增加，Morris水迷宮實驗中模型組、中藥組、西藥組逃避潛伏期逐漸縮短，穿越原平臺次數(shù)逐漸增多；跳臺實驗潛伏期逐漸延長，錯誤次數(shù)逐漸減少（P<0.05）。中藥組均較同時間點模型組、西藥組水迷宮實驗逃避潛伏期縮短，穿越次數(shù)增多；跳臺實驗潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少（P< 0.05）。免疫組化實驗顯示，術(shù)后7 d中藥組NT3陽性細胞數(shù)明顯多于模型組、西藥組（P<0.05）；術(shù)后14 d中藥組NT3陽性細胞數(shù)與西藥組無明顯差異（P＞0.05）；術(shù)后28 d中藥組NT3陽性細胞數(shù)明顯多于模型組、西藥組（P＜0.05）。［結(jié)論］健脾益智膠囊可促進MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)，促進MCAO大鼠海馬NT3表達增加，提示健脾益智膠囊可能通過誘導(dǎo)NT3表達以達到恢復(fù)腦缺血后學(xué)習(xí)記憶能力的目的。

健脾益智膠囊；大腦中動脈栓塞模型；Morris水迷宮實驗；跳臺實驗；NT3；實驗研究

腦卒中是臨床常見病、多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點。缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病率的60%～80%［1］，目前尚無有效治療手段，患者預(yù)后差的主要原因是腦缺血損傷再灌注后壞死的腦組織修復(fù)不佳。中醫(yī)藥對神經(jīng)功能缺損疾病的治療有較好效果，本實驗建立大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠模型，采用免疫組化法、Bederson評分和Morris水迷宮實驗、跳臺實驗等行為學(xué)檢測，評價健脾益智膠囊對MCAO模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善情況，并探討其機制，為臨床治療缺血性腦卒中提供有力的實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物SPF級健康雄性SD大鼠120只，13周齡，體質(zhì)量280～300 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d后，隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組、中藥組。每組按存活時間再分為7 d、14 d、28 d亞組，每亞組8只。

1.2 試劑與儀器NT3兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1293）；Mayor’s蘇木素（Sigma公司，Lot No.07G03A05）；PBS（pH7.2～7.6，武漢博士德生物工程有限公司，Lot No.07c16B30）；枸櫞酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，AR0024）；即用型SABC（小鼠IgG）免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，Lot No. 07K21cJ）；即用型SABC（兔IgG）免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，Lot No.07K15BJ）；DAB顯示試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，Lot No.07127c22）；10%水合氯醛（福建中醫(yī)藥大學(xué)證研究基地）；HM315R石蠟切片機（德國MICROM）；STP-120全自動生物組織脫水機（德國MICROM）；EC-350生物組織包埋機（德國MICROM）；攤片機（德國MICROM）；烤片機（德國MICROM）；BX51T-PHD-J1三目顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司］；大鼠跳臺儀DTT-2（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；Morris水迷宮、大鼠迷宮自動程序記錄儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）。

1.3 藥物健脾益智膠囊由人參、黃芪、白術(shù)、制何首烏、石菖蒲、遠志、水蛭組成，中藥均購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，由福建中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠代加工。膠囊每粒內(nèi)容物重0.3 g，1 g內(nèi)容物相當(dāng)于含生藥10 g。實驗時制備成健脾益智膠囊0.9%氯化鈉溶液混懸液（0.2 g/ml），備用。西藥尼莫地平（國藥準字H41022175，鄭州瑞康制藥有限公司，每片20 mg），實驗時制備成0.9%氯化鈉溶液混懸液（1 mg/ml），備用。

2 方法

2.1 MCAO模型復(fù)制與給藥參照文獻［2］復(fù)制模型，術(shù)后2 h參照Bederson評分法［3］進行行為學(xué)評分，評價大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損程度，評分達2分以上的大鼠納入研究。此后分別于7 d、14 d、28 d處死取材，處死前進行行為學(xué)評分。中藥組術(shù)后給予健脾益智膠囊混懸液［3.675 ml/（kg·d）］，西藥組給予尼莫地平混懸液［10 ml/（kg·d）］。模型組、假手術(shù)組給予0.9%氯化鈉溶液，正常組常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2 大鼠行為學(xué)檢測

2.2.1 Morris水迷宮實驗迷宮由圓形水池、平臺兩部分組成。水池直徑120 cm，高60 cm，池壁漆成黑色，在池壁上四個等距離點將水池分為四個象限，直徑為9 cm的平臺置于任一象限中央，淹沒于水下2 cm，于造模前進行Morris水迷宮訓(xùn)練，實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗，歷時5 d，每天于固定時間段進行訓(xùn)練，每個時段4次。每次試驗分別從東、西、南、北4個點入水，入水時大鼠面向池壁。記錄大鼠找到平臺所需時間即逃避潛伏期。如大鼠在2 min內(nèi)找不到平臺，則由實驗者將其引導(dǎo)向平臺，其潛伏期為120 s。自動錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時間和游泳途徑?？臻g探索實驗于第6天撤除原平臺，任選一個入水點將大鼠放入水中，所有大鼠必須為同一入水點，記錄大鼠在2 min內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)。在各時間點處死前5天，進行測試，記錄逃避潛伏期、穿越原平臺的次數(shù)。

2.2.2 跳臺實驗造模前對大鼠進行跳臺試驗的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，將大鼠放入箱內(nèi)適應(yīng)3 min后，接通電源，大鼠受電擊后跳至跳臺上，如此反復(fù)5 min，記錄大鼠受電擊后跳至跳臺上的時間及受電擊次數(shù)。第2日進行測試訓(xùn)練，將大鼠放于跳臺之上，即刻通電，記錄5 min內(nèi)大鼠第1次從跳臺上跳下的時間（這段時間稱為潛伏期），并同時記錄大鼠跳下跳臺受電擊的次數(shù)（稱為錯誤次數(shù)），潛伏期和錯誤次數(shù)作為反應(yīng)大鼠記憶能力的指標。在各時間點處死前2天，再次進行跳臺測試訓(xùn)練，記錄潛伏期、錯誤次數(shù)。

2.3 NT3免疫組化檢測免疫組化采用SABC（鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物）法，操作步驟按試劑盒說明書進行。

2.4統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，作單因素方差分析和t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾益智膠囊對MCAO大鼠腦缺血后神經(jīng)行為學(xué)評分的影響見表1。

表1 各組大鼠不同時間段腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分比較（分±s）

表1 各組大鼠不同時間段腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分比較（分±s）

注：與模型組比較，①P<0.05；與西藥組比較，②P<0.05；與同組術(shù)后7 d比較，③P<0.05；與同組術(shù)后14 d比較，④P<0.05；下同

正常組24000假手術(shù)組24000模型組242.62±0.922.12±0.64③1.50±0.76③④西藥組242.12±0.64①1.63±0.52①③0.88±0.35①③④中藥組241.87±0.83①②1.13±0.64①②③0.50±0.53①②③④組別n7 d14 d28 d

表1結(jié)果顯示，正常組、假手術(shù)組Bederson神經(jīng)功能評分均為0分；與模型組同時段比較，西藥組、中藥組Bederson評分均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中中藥組Bederson評分改善更顯著，與西藥組比較有顯著性差異（P< 0.05）。

3.2 水迷宮實驗結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期及穿越原平臺次數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期及穿越原平臺次數(shù)比較（±s）

逃避潛伏期（s）穿越原平臺（次/分）逃避潛伏期（s）穿越原平臺（次/分）逃避潛伏期（s）穿越原平臺（次/分）正常組2425.54±3.086.11±1.5325.45±3.056.12±1.4725.51±2.936.11±1.50假手術(shù)組2425.42±3.036.06±1.4325.51±3.066.10±1.4025.49±3.026.10±1.39模型組2445.01±3.122.04±1.0138.65±4.02③3.27±1.33③30.40±2.55③④3.72±1.48③④西藥組2440.89±5.86①2.20±1.12①32.30±3.36①③3.76±1.84①③28.67±2.53①③④5.13±1.49①③④中藥組2438.26±4.97①②2.38±1.07①②29.68±3.54①②③4.11±1.78①②③25.89±3.14①②③④5.57±1.48①②③④n 7 d14 d28 d組別

表2結(jié)果顯示，術(shù)后7 d、14 d、28 d，中藥組、西藥組均較同時間點模型組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數(shù)增多，差異有顯著性意義（P<0.05）；與西藥組同時間點比較，中藥組逃避潛伏期縮短更明顯，穿越原平臺次數(shù)增多更明顯（P<0.05）。術(shù)后14 d、28 d，模型組、中藥組、西藥組均較同組術(shù)后7 d逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數(shù)增多（P<0.05）；術(shù)后28 d較術(shù)后14 d逃避潛伏期縮短，穿越次數(shù)增多（P<0.05）。

3.3 跳臺實驗結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠跳臺實驗潛伏期及錯誤次數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠跳臺實驗潛伏期及錯誤次數(shù)比較（±s）

潛伏期（s）錯誤次數(shù)（次）潛伏期（s）錯誤次數(shù)（次）潛伏期（s）錯誤次數(shù)（次）正常組24249.93±14.191.94±0.88250.10±12.762.06±0.88250.23±12.732.02±0.90假手術(shù)組24250.21±8.131.95±0.82250.07±7.991.96±0.80250.23±8.141.98±0.79模型組2440.15±2.155.34±1.8064.38±2.85③3.57±1.16③135.86±4.58③④3.06±1.17③④西藥組2454.01±2.34①4.05±1.35①149.35±8.20①③2.94±1.32①③214.00±4.42①③④2.55±1.29①③④中藥組2455.25±3.15①②3.84±1.30①②156.39±8.07①②③2.43±1.00①②③242.61±5.48①②③④2.22±1.05①②③④n 7 d14 d28 d組別

表3結(jié)果顯示，術(shù)后7 d、14 d、28 d，中藥組、西藥組均較同時間點模型組潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少，差異有顯著性意義（P<0.05）；與西藥組同時間點比較，中藥組潛伏期延長更明顯，錯誤次數(shù)減少更明顯（P<0.05）。術(shù)后14 d、28 d，模型組、中藥組、西藥組均較同組術(shù)后7 d潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少（P<0.05）；術(shù)后28 d較術(shù)后14 d潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少（P<0.05）。

3.4 健脾益智膠囊對NT3陽性細胞數(shù)的影響見表4、圖1。

表4 各組大鼠海馬區(qū)NT3陽性細胞數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠海馬區(qū)NT3陽性細胞數(shù)比較（±s）

正常組2421.87±4.2421.78±4.2821.67±4.17假手術(shù)組2421.85±4.3721.74±4.4421.83±4.47模型組2425.15±2.8020.81±4.44③12.62±2.80③④西藥組2431.76±1.54①24.98±2.57①③12.79±2.77③④中藥組2435.50±4.15①②25.48±4.20①③15.69±2.30①②③④組別n7 d14 d28 d

圖1 光鏡下NT3免疫細胞檢測圖

表4結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，中藥組、西藥組較模型組NT3陽性細胞數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組NT3陽性細胞數(shù)增加更明顯（P＜0.05）。術(shù)后14 d，與模型組比較，中藥組及西藥組NT3陽性細胞數(shù)增加顯著（P＜0.05），但中藥組及西藥組兩組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后28 d，與模型組比較，中藥組NT3陽性細胞數(shù)增加顯著（P＜0.05），西藥組NT3陽性細胞數(shù)無明顯增加（P＞0.05）。與同組術(shù)后7 d比較，模型組、中藥組、西藥組術(shù)后14 d、28 d NT3陽性細胞數(shù)均明顯減少（P＜0.05）；術(shù)后28 d較術(shù)后14 d NT3陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）。

4 討論

認知障礙在腦卒中患者中發(fā)病率高達56.6%［4］，其中45.4%腦卒中后認知障礙患者主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降［5］。缺血性腦卒中發(fā)生后，由于腦組織缺血缺氧進而發(fā)生一系列復(fù)雜的病理改變，導(dǎo)致大腦神經(jīng)元破壞和死亡［6］，最終出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶減退等功能障礙。

NT3是在胚胎期及發(fā)育期成活和發(fā)育所必需的一種蛋白質(zhì)［7-8］，能促進神經(jīng)嵴細胞進行有絲分裂并誘導(dǎo)其分化［9］，并參與神經(jīng)突觸的形成和神經(jīng)突起的生長［10］。目前國內(nèi)外對神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等研究較多，而NT3與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究較少。有研究表明NT3缺乏或者含量不足會對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響，并與AD等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。而NT3能阻止膽堿能神經(jīng)元退變，改善因基底前腦膽堿能神經(jīng)元退變引起的學(xué)習(xí)記憶功能障礙［11］。

腦卒中后由于腦組織結(jié)構(gòu)功能的異常，卒中后患者一般會遺留半身不遂、語言障礙、口眼斜等癥狀，且較易出現(xiàn)會出現(xiàn)焦慮、抑郁、妄想、譫妄、人格變態(tài)、癡呆等神志障礙，這些都屬于中醫(yī)“智”的異常。中醫(yī)認為脾藏意，主思，生智，故在缺血性腦卒中治療方面，確立了健脾益智的治療方法。

本研究中，健脾益智膠囊干預(yù)后的MCAO大鼠在Morris水迷宮實驗中表現(xiàn)出大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越原平臺次數(shù)明顯增多，其獲得經(jīng)驗（學(xué)習(xí)）能力、保存經(jīng)驗（記憶）的能力以及視空間識別的能力均有明顯恢復(fù)，優(yōu)于模型組、西藥組；跳臺法實驗中，中藥組MCAO大鼠在跳臺上的潛伏期明顯變長，犯錯受電擊次數(shù)明顯減少，學(xué)習(xí)記憶能力有明顯恢復(fù)，優(yōu)于模型組、西藥組。Morris水迷宮實驗、跳臺實驗結(jié)果表明健脾益智膠囊可促進MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)。在同期免疫組化實驗中，術(shù)后7 d MCAO大鼠海馬NT3陽性細胞數(shù)明顯增多；隨著時間的推移，術(shù)后14 d、28 d MCAO大鼠海馬NT3陽性細胞數(shù)逐漸減少，至28 d已低于正常水平；術(shù)后7 d、28 d中藥組陽性細胞數(shù)明顯多于西藥組。據(jù)上述結(jié)果我們推斷出，健脾益智膠囊可能通過誘導(dǎo)NT3的表達來實現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)，至于NT3如何使得MCAO大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)還有待于進一步研究。

（本文源自馮珂的博士學(xué)位論文）

［1］中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2010［J］.中華神經(jīng)科雜志，2010，43（2）：146-153.

［2］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:84.

［3］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）:472.

［4］曲艷吉，卓琳，詹思延.中國腦卒中后認知障礙流行病學(xué)特征的系統(tǒng)評價［J］.中華老年心腦血管病雜志，2013，14（12）：1294-1301.

［5］胡昔權(quán)，竇祖林，萬桂芳，等.腦卒中患者認知功能障礙的發(fā)生率及其影響因素的探討［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2003，25（4）：219-222.

［6］Jin R，Song Z，Yu S，et al.Phosphatidylinositol-3-kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke［J］.Stroke，2011，42（7）：2033-2044.

［7］Fox E A，McAdams J.Smooth-muscle-specific expression of neurotrophin-3 in mouse embryonic and neonatal gastrointestinal tract［J］.Cell Tissue Res，2010，340（2）：267-286.

［8］Sahenk Z，Galloway G，Edwards C，et al.TrkB and TrkC agonist antibodies improve function，electrophysiologic and pathologic features in Trembler mice［J］.Exp Neurol，2010，224（2）：495-506.

［9］Gavazzi I，Kumar R D，McMahon S B，et al.Growth responses of different subpopulat ions of adult sensory neurons to neurtroph ic factors in vitro［J］.Eur J Neurosci，1999，11（10）：3405-3414.

［10］Hossain W A，Brumwell C L，Morest D K.Sequential in teractions of fibroblast growth factor-2，brain-derived neurotrophic factor，neurotrophin-3，and their receptors define critical periods in the development of cochlear ganglion cells［J］.Exp N eurol，2002，175（1）:138-151.

［11］Fischer W，Sirevaag A，Wiegand S J，et al.Reversal of spatial memory impairments in aged rats by nerve growth factor and neurotrophin-3 and 4/5 but not by brain-derived neurotrophic factor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（18）:8607-8611.

（編輯 陳明偉）

Effects of Jianpiyizhi Capsule on Expression of NT3 in the Hippocampus and Learning and Memorizing Ability of MCAO Rats

FENG Ke，JI Li－jin
（FujianUniversityof TraditionalChineseMedicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，350122）

［Objective］To detect the effects of Jianpiyizhi capsule on learning and memorizing ability of middle cerebral artery occlusion（MCAO）rats.［Methods］The MCAO model rats were randomly divided into 5 groups：normal control group，sham operation group，MCAO model group，Nimodipine group，Jianpiyizhi group.The expression of NT3 in hippocampus and the learning and memory ability of MCAO rats were observed by immunohistochemical method，Bederson score，Morris water maze test and stepdown test at 7d，14d and 28d after operation.［Results］With the increase of the postoperative time，the Bederson scores of MCAO model group，Nimodipine and Jianpiyizhi group gradually reduced.Bederson scores were significant different in each group at each time point（P＜0.05）.The scores of Nimodipine and Jianpiyizhi groups at the same time－point were significant different compared with that of MCAO model group（P＜0.05）.And the score of Jianpiyizhi group was better than that of Nimodipine group（P＜0.05）.With the increase of the postoperative time，the escape latency of MCAO model group，Nimodipine and Jianpiyizhi groups was gradually shortened and the frequency of crossing the original platform was gradually increased in Morris water maze test.The latency of the experiment was gradually prolonged and the number of errors decreased gradually（P＜0.05）.At the same time point，the escape latency，frequency of crossing the original platform，the latency of the experiment and the number of errors in Morris water maze testofJanpiyizhigroupwassignificantlydifferentlyfromthatofMCAOmodelgroupandNimodipinegroup（P＜0.05）.Immunohistochemical experiments showed that the number of NT3 positive cells on the 7th day after surgery of the Jianpiyizhi group were significantly higher than that in MCAO model group and Nimodipine groups（P＜0.05）.No significant difference was noted in the number of NT3 positive cells on the 14th day after surgery between Janpiyizhi group and Nimodipine group（P＞0.05）.The number of NT3 positive cells on the 28th day after surgery of the Jianpiyizhi group were significantly higher than that in MCAO model group and Nimodipine groups（P＜0.05）.［Conclusion］Janpiyizhi capsule can promote the recovery of learning and memory ability of MCAO rats and facilitate the expression of NT3 in hippocampus of MCAO rats.It is suggested that the capsule could achieve the purpose of recovery of learning and memory after cerebral ischemia through the induction of NT3 expression.

Jianpiyizhi capsule；middle cerebral artery occlusion model；Morris water maze test；step－down avoidance test；NT3；experimental research

R285.5

A

2095-4441（2016）04－0001－05

2016－10－13

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81373528）

馮珂（1983-），女，漢族，山東淄博人，博士，講師，研究方向：中醫(yī)藏象理論

紀立金，E-mail：666j@163.com