仇子龍，李霄

孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究

仇子龍，李霄

孤獨(dú)癥在1946年由美國(guó)醫(yī)生Kanner發(fā)現(xiàn)并命名，其主要在幼兒中出現(xiàn)，臨床癥狀有語(yǔ)言發(fā)育遲緩、社交溝通障礙及重復(fù)刻板行為等。近年來(lái)孤獨(dú)癥的臨床發(fā)病率日益飆升，引起世界各國(guó)的廣泛重視。經(jīng)過(guò)醫(yī)生與神經(jīng)科學(xué)家數(shù)十年的臨床與基礎(chǔ)研究，目前認(rèn)為孤獨(dú)癥/孤獨(dú)癥譜系障礙是一種復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育性疾病（neurodevelopmental disorder），主要由遺傳因素導(dǎo)致。本文從遺傳分析，神經(jīng)生物學(xué)研究及動(dòng)物模型的構(gòu)建角度逐一討論孤獨(dú)癥研究的各個(gè)方面，并將國(guó)內(nèi)近年來(lái)對(duì)孤獨(dú)癥研究在這些方面取得的進(jìn)展逐一介紹，最后對(duì)孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究進(jìn)行總結(jié)與展望。

1　遺傳分析

孤獨(dú)癥最早被發(fā)現(xiàn)時(shí)曾經(jīng)被誤認(rèn)為是由父母的不當(dāng)行為導(dǎo)致的疾病，直到發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥的發(fā)病率在雙生子及遺傳關(guān)系密切的人群顯著升高，研究者才認(rèn)識(shí)到遺傳因素在孤獨(dú)癥的發(fā)病中占有重要地位，對(duì)孤獨(dú)癥人群的大規(guī)模遺傳分析因此展開(kāi)。近年來(lái)，世界各國(guó)都對(duì)多個(gè)孤獨(dú)癥的核心家系及孤獨(dú)癥的散發(fā)人群開(kāi)展了大規(guī)?；蚪M關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study）。但令人困惑的是，這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了眾多基因突變位點(diǎn)與孤獨(dú)癥相關(guān)，但是卻沒(méi)有某幾種基因占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為許多孤獨(dú)癥相關(guān)突變位點(diǎn)僅僅占整體孤獨(dú)癥基因突變的極少部分。

這些研究為孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究提供了重要線(xiàn)索，首先提示作為一種復(fù)雜精神疾病的孤獨(dú)癥，很可能是一種多基因多位點(diǎn)致病的疾病。其次，在遺傳分析中發(fā)現(xiàn)的突變基因呈現(xiàn)出功能上可以細(xì)分的幾大類(lèi)，例如突觸蛋白編碼基因與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白編碼基因等，進(jìn)一步提示孤獨(dú)癥與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育特別是突觸的正常功能失調(diào)密切相關(guān)。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，研究者對(duì)人類(lèi)基因組的變異類(lèi)型有了嶄新的認(rèn)識(shí)。2007年，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室Wigler教授研究組發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)段的原發(fā)性拷貝數(shù)變異（de novo copy number variations）與孤獨(dú)癥密切相關(guān)，這為孤獨(dú)癥遺傳分析提供了新角度。

中國(guó)科學(xué)家在孤獨(dú)癥遺傳學(xué)研究領(lǐng)域也作出了突出貢獻(xiàn)。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部張岱教授研究組對(duì)中國(guó)的孤獨(dú)癥遺傳學(xué)分析做了長(zhǎng)期系統(tǒng)的工作，2004年報(bào)道在中國(guó)的孤獨(dú)癥患者中語(yǔ)言相關(guān)基因FoxP2與孤獨(dú)癥的發(fā)生具有相關(guān)性，該發(fā)現(xiàn)為語(yǔ)言發(fā)育在孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)理中的研究提供了重要證據(jù)。中南大學(xué)夏昆教授研究組報(bào)道了在中國(guó)孤獨(dú)癥人群中進(jìn)行大規(guī)模基因組關(guān)聯(lián)分析的工作，發(fā)現(xiàn)了與孤獨(dú)癥密切相關(guān)的染色體新區(qū)段。鑒于孤獨(dú)癥與遺傳因素關(guān)系密切，因此針對(duì)不同人種的孤獨(dú)癥遺傳學(xué)研究非常重要。對(duì)歐美高加索人群中報(bào)道的孤獨(dú)癥遺傳因素是否可以應(yīng)用于東亞人群需要進(jìn)行細(xì)致的研究。

2　神經(jīng)生物學(xué)研究

孤獨(dú)癥的遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了大量在孤獨(dú)癥人群中發(fā)生突變的基因，這些基因突變究竟是否與孤獨(dú)癥相關(guān)？在用遺傳學(xué)方法很難確認(rèn)孤獨(dú)癥的發(fā)病基因時(shí)，就需要利用神經(jīng)生物學(xué)的方法來(lái)研究這些基因突變是否會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能造成影響而導(dǎo)致孤獨(dú)癥。

在對(duì)孤獨(dú)癥的遺傳分析中發(fā)現(xiàn)許多突觸蛋白的編碼基因發(fā)生突變，如shank3，neuroligins，neurexins 及cntnap 等。因此孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究工作需要解決兩大問(wèn)題：在孤獨(dú)癥中發(fā)生的基因突變是否影響其編碼蛋白的正常功能及神經(jīng)突觸傳導(dǎo)？在含有同樣基因突變的動(dòng)物模型中，是否有可能再現(xiàn)類(lèi)似孤獨(dú)癥的癥狀？在過(guò)去的10年中對(duì)這兩大問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究。

對(duì)在孤獨(dú)癥病人中發(fā)生突變的一系列基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，其中功能研究相對(duì)深入的是neuroligins與neurexins家族蛋白。neuroligins與neurexins家族蛋白在20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)是與突觸形成與功能有關(guān)的重要黏連蛋白。美國(guó)斯坦福大學(xué)Sudhof教授研究組發(fā)現(xiàn)，在孤獨(dú)癥中發(fā)生突變的neuroligin3 （R451C）蛋白影響了小鼠大腦中的抑制性突觸傳導(dǎo)，并且攜neuroligin3 （R451C）突變的小鼠發(fā)生了類(lèi)似人類(lèi)孤獨(dú)癥的癥狀，包括減少小鼠之間的社會(huì)交往行為等。另外一個(gè)重要的家族蛋白neuroligin4編碼基因缺失小鼠也表現(xiàn)出類(lèi)似孤獨(dú)癥的表型。

東南大學(xué)謝維與韓俊海教授研究組在利用果蠅（Drosophila melanogaster）為模式生物研究neuroliginneurexin功能方面有重要進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)果蠅中neuroligin家族蛋白也對(duì)突觸的功能非常重要，neuroligin4基因編碼蛋白對(duì)睡眠有重要調(diào)控作用以及neurexin蛋白作為分子伴侶的新功能。這些工作為深入了解neuroligin-neurexin家族蛋白的功能作出了重要貢獻(xiàn)。

近年來(lái)的重要進(jìn)展還包括對(duì)shank3基因在孤獨(dú)癥中的研究。shank3基因是最早幾個(gè)在孤獨(dú)癥中發(fā)現(xiàn)的突變基因之一，而且編碼重要的突觸后細(xì)胞骨架蛋白，因此shank3基因的突變是否是導(dǎo)致孤獨(dú)癥的原因便成為研究熱點(diǎn)。2011年，美國(guó)馮國(guó)平與姜永輝教授研究組同時(shí)報(bào)道在shank3基因突變小鼠中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)孤獨(dú)癥的表型及一系列突觸的發(fā)育及功能異常。這些工作進(jìn)一步確認(rèn)突觸蛋白的功能異常可導(dǎo)致一系列類(lèi)孤獨(dú)癥及精神疾病的癥狀。

與孤獨(dú)癥密切相關(guān)的突觸黏連蛋白還有cntnap（contactin-associated protein）家族，其中cntnap2，4基因的突變?cè)诠陋?dú)癥及其他精神疾病的病患中都被發(fā)現(xiàn)。加州大學(xué)洛杉磯分校 Geschwind 教授研究組發(fā)現(xiàn)，cntnap2基因缺失小鼠具有一系列類(lèi)孤獨(dú)癥表型及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，建立起cntnap家族蛋白與孤獨(dú)癥及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病的聯(lián)系。紐約大學(xué)Fishell教授研究組發(fā)現(xiàn)，cntnap4蛋白特異性地在抑制性中間神經(jīng)元及多巴胺神經(jīng)元中表達(dá)，而且缺失cntnap4基因的小鼠也表現(xiàn)出一系列的突觸傳導(dǎo)異常及類(lèi)精神疾病表型。

這些證據(jù)都表明，孤獨(dú)癥確實(shí)與大腦中突觸傳導(dǎo)的功能異常有關(guān)。除了突觸蛋白編碼基因突變以外，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)在孤獨(dú)癥病人中甲基化DNA結(jié)合蛋白MeCP2（methyl CpG-binding protein 2）的編碼基因出現(xiàn)拷貝數(shù)的倍增。MeCP2是一個(gè)甲基化DNA結(jié)合蛋白，具有抑制基因表達(dá)的重要功能。

美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院的Zoghbi教授研究組發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育性疾病瑞特綜合征（Rett syndrome）與MECP2基因突變密切相關(guān)，95%的瑞特綜合征病人攜帶MECP2基因的缺失功能突變。瑞特綜合征患者因?yàn)橛胁糠峙c孤獨(dú)癥患者類(lèi)似的表型，早期也被歸為孤獨(dú)癥譜系障礙的一種（autism spectrum disorders，ASD）。因此，這些證據(jù)表明基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與功能密切相關(guān)，失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育性疾病。美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院Rosenmund教授研究組進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，MeCP2蛋白具有雙向調(diào)控突觸傳導(dǎo)的活性，MeCP2蛋白缺失后神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳導(dǎo)受損，MeCP2蛋白增多則神經(jīng)元之間的興奮性突觸傳導(dǎo)增強(qiáng)。人們陸續(xù)制作了多種MECP2基因敲除與轉(zhuǎn)基因的小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)攜帶人類(lèi)mecp2基因的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出焦慮水平上升及社會(huì)交往行為缺陷等類(lèi)孤獨(dú)癥表型。

2003年，美國(guó)哈佛大學(xué)Greenberg教授研究組與加州大學(xué)洛杉磯分校的孫毅教授研究組發(fā)現(xiàn)，MeCP2在神經(jīng)元中可以調(diào)控重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子——腦源性營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophin factor， BDNF）的表達(dá)，進(jìn)而提示MeCP2可以通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)而影響突觸的發(fā)育及可塑性。本實(shí)驗(yàn)室最近發(fā)現(xiàn)，MeCP2除了調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，還具備抑制核內(nèi)小RNA剪切加工的活性，可調(diào)控眾多的小RNA剪切加工并影響神經(jīng)元的樹(shù)突生長(zhǎng)及突觸形成。發(fā)現(xiàn)，MeCP2的過(guò)多及過(guò)少可雙向調(diào)控神經(jīng)元中小RNA的水平進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)量，此工作為因MeCP2蛋白的劑量不同而導(dǎo)致孤獨(dú)癥或瑞特綜合征提供了可能的機(jī)理解釋。

對(duì)于孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究已經(jīng)取得許多進(jìn)展，包括對(duì)孤獨(dú)癥中發(fā)生突變基因的功能等。這些研究結(jié)果初步提示，是基因突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)中突觸發(fā)育異常從而導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育出現(xiàn)紊亂，進(jìn)而很有可能在整體水平表現(xiàn)出復(fù)雜的精神癥狀，包括社交障礙及重復(fù)刻板行為等。但是對(duì)于孤獨(dú)癥的神經(jīng)生物學(xué)研究最終還必須在整體動(dòng)物水平進(jìn)行，包括對(duì)攜帶基因突變的動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)育情況及行為表型進(jìn)行研究。因此，建立可靠的動(dòng)物模型對(duì)孤獨(dú)癥的研究至關(guān)重要。

3　孤獨(dú)癥動(dòng)物模型

在過(guò)去的數(shù)年中，研究者制作了眾多動(dòng)物模型用于孤獨(dú)癥研究。2007年，美國(guó)加州理工學(xué)院的Patterson教授研究組發(fā)現(xiàn)，用給懷孕母鼠注射白介素6（IL6）的方法可以誘導(dǎo)子代小鼠出現(xiàn)明顯的類(lèi)孤獨(dú)癥與精神分裂癥表型，這種方法被稱(chēng)為母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）。接著發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的類(lèi)孤獨(dú)癥小鼠模型中出現(xiàn)了代謝系統(tǒng)紊亂，及利用某些藥物可顯著改善MIA小鼠模型的孤獨(dú)癥表型。這些結(jié)果令人振奮，但同時(shí)必須認(rèn)識(shí)到，孤獨(dú)癥的起因多種多樣，用MIA的方法誘導(dǎo)模型是否能夠完全模擬人類(lèi)的孤獨(dú)癥表型還需深入研究。例如，將MIA模型與其他的遺傳基因突變小鼠進(jìn)行仔細(xì)比較，研究在MIA 模型中出現(xiàn)的代謝異常是否也會(huì)在其他孤獨(dú)癥小鼠模型中出現(xiàn)等。

近年來(lái)，研究者還利用基因工程的方法將人類(lèi)孤獨(dú)癥中突變基因的小鼠同源基因進(jìn)行敲除與突變而得到了許多基因突變小鼠。對(duì)這些基因突變小鼠開(kāi)展了上文提到的多方面的神經(jīng)生物學(xué)研究，包括神經(jīng)發(fā)育、突觸形成與傳導(dǎo)，以及行為學(xué)上的分析等。但是對(duì)于怎樣用嚙齒類(lèi)來(lái)模擬人類(lèi)的復(fù)雜精神疾病癥狀始終是研究者反復(fù)探討的課題。是否可以用更接近人類(lèi)的非人靈長(zhǎng)類(lèi)來(lái)制作孤獨(dú)癥模型便成為了孤獨(dú)癥研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，新型快速基因編輯方法的出現(xiàn)為在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中操控基因提供了可能。

2014年上半年，中國(guó)科學(xué)家陸續(xù)報(bào)道了利用非人靈長(zhǎng)類(lèi)制作疾病動(dòng)物模型的工作。中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所季維智、同濟(jì)大學(xué)孫毅教授的團(tuán)隊(duì)及本實(shí)驗(yàn)室與中國(guó)科學(xué)院上海神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)研究員的團(tuán)隊(duì)都報(bào)道了利用TALEN打靶的方法得到了與瑞特綜合征及孤獨(dú)癥譜系障礙關(guān)系密切的mecp2基因突變食蟹猴。其中，本實(shí)驗(yàn)室與孫強(qiáng)研究員的工作發(fā)現(xiàn)，攜帶mecp2基因突變的雄性食蟹猴出生后死亡，大腦組織中檢測(cè)到顯著的MeCP2蛋白缺失，這些樣品為進(jìn)一步研究MeCP2在靈長(zhǎng)類(lèi)大腦發(fā)育中的作用提供了寶貴的材料。

4　孤獨(dú)癥研究的現(xiàn)狀與未來(lái)

孤獨(dú)癥是一種異常復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育性疾病，其病因呈現(xiàn)出遺傳上的異質(zhì)性，對(duì)神經(jīng)科學(xué)的研究提出了巨大挑戰(zhàn)。同時(shí)讓我們認(rèn)識(shí)到，人類(lèi)的復(fù)雜社交行為有可能是通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路來(lái)調(diào)控的，并且為深入認(rèn)識(shí)人類(lèi)社交行為的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ)提供了重要的線(xiàn)索。接下來(lái)，還需要在分子細(xì)胞、神經(jīng)環(huán)路及整體動(dòng)物水平上深入探討孤獨(dú)癥相關(guān)基因突變究竟怎樣影響哺乳類(lèi)大腦的功能性聯(lián)接與功能。還需要在多種動(dòng)物水平構(gòu)建更合適的動(dòng)物模型用于基礎(chǔ)研究。只有對(duì)孤獨(dú)癥的神經(jīng)基礎(chǔ)有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，有效的藥物及物理干預(yù)方法才有可能出現(xiàn)，這期待多學(xué)科的交叉合作，共同完成這一神經(jīng)科學(xué)與醫(yī)學(xué)上的重大難題。?

（摘自《中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)》2015年第8期）

責(zé)任編輯：吳曉麗

【作者單位：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所】