朱海生，莊尹宏，劉建汀，王 彬，陳敏氡，張前榮，溫慶放*，李大忠，薛珠政

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

絲瓜總酚提取和測(cè)定方法的優(yōu)化

朱海生1,2,3，莊尹宏1,2,3，劉建汀1,2,3，王 彬1,2,3，陳敏氡1,2,3，張前榮1,2,3，溫慶放1,2,3*，李大忠1,2,3，薛珠政1,2,3

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

為建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的絲瓜總酚提取和測(cè)定體系，對(duì)絲瓜果肉總酚的超聲波輔助提取和福林-酚比色測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化。絲瓜果肉與80%乙醇在比例為1∶10、40℃下超聲波提取30 min，總酚的提取效果較好。在測(cè)定波長(zhǎng)750 nm、0.5 mol·L-1Na2CO3體積3 mL、0.5 mol·L-1福林-酚體積1.5 mL、反應(yīng)溫度30℃、反應(yīng)時(shí)間60 min時(shí)，總酚含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.9947)，說明此方法能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的測(cè)定絲瓜總酚含量。

絲瓜；總酚；超聲波；福林-酚

絲瓜Luffacylindrica原產(chǎn)東印度，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，有普通絲瓜LuffacylindricaRoem和有棱絲瓜LuffaacutangulaRoxb 2個(gè)栽培種，在我國南北均有栽培，是我國主要的瓜類蔬菜[1]。絲瓜營養(yǎng)豐富，且具有很好的醫(yī)療保健功能，隨著人們對(duì)飲食營養(yǎng)保健的日益重視，絲瓜作為一種藥食兼用的高溫季節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)的蔬菜和保健蔬菜，其需求量不斷增大，栽培面積日益擴(kuò)大，蘊(yùn)含著巨大的市場(chǎng)前景，但絲瓜果肉及湯汁出現(xiàn)褐變，大大降低了果蔬的貯藏加工性能，嚴(yán)重影響絲瓜產(chǎn)品的商品價(jià)值，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此成為絲瓜育種和采后的研究熱點(diǎn)。

酚類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，主要存在于細(xì)胞液泡內(nèi)[2-3]，是蘋果[4]、梨[5]、荔枝[6]、蓮藕[7]等果蔬酶促褐變的底物，導(dǎo)致品質(zhì)下降，降低園藝產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益[8-9]。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取和福林-酚比色法研究絲瓜總酚的提取和測(cè)定方法，為今后絲瓜酶促褐變機(jī)理研究及絲瓜新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)絲瓜品種 本試驗(yàn)供試絲瓜品種(系)‘黑12’由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蔬菜中心提供。用雙蒸水進(jìn)行清洗，晾干，快速削皮后分裝于保鮮袋中，液氮速凍后置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑 福林-酚購自美國Signa公司；甲醇(CH3OH)、丙酮(CH3COCH3)、乙醇(C2H6O)、碳酸鈉(Na2CO3)、沒食子酸(C7H605)等為國產(chǎn)分析純(廣通貿(mào)易化學(xué)試劑有限公司)。

沒食子酸溶液配制：稱取 0.11 g沒食子酸，用雙蒸水溶解定容至1 000.0 mL，得到濃度為 100 μg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 DK-8D電熱恒溫水槽(上海-恒科學(xué)儀器有限公司)、BILON-96超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(成都比郎實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、UV1000紫外可見分光光度計(jì)(天美科學(xué)儀器有限公司)、AR224CN電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)、CR22N冷凍高速離心機(jī)(北京順心萬昌科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲輔助提取絲瓜總酚工藝優(yōu)化

(1)不同提取劑的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，分別加入60%的乙醇、甲醇、丙酮，料液比1∶8，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測(cè)。

(2)不同乙醇濃度的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶8，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測(cè)。

(3)不同液料比的選擇

精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測(cè)。

(4)不同超聲時(shí)間的選擇

精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至勻漿，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min，40℃、300 W下超聲輔助提取，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測(cè)。

(5)不同超聲溫度的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至勻漿，超聲溫度分別為25、40、60℃，300 W下超聲輔助提取30 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測(cè)。

1.2.2 福林-酚比色法測(cè)定絲瓜總酚含量的優(yōu)化

(1)測(cè)量波長(zhǎng)的選擇：移取沒食子酸溶液(100 μg·mL-1)1 mL于25 mL試管中，加入5 mL的蒸餾水，再加入1 mL的福林-酚比色劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液2 mL，用雙蒸水定容至25 mL，于室溫下避光反應(yīng)1 h后，在500～900 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

(2)試劑體積的選擇：①Na2CO3體積的確定：移取沒食子酸溶液7份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1 mL的福林-酚比色劑，混勻靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用雙蒸水定容至25 mL，在室溫下避光反應(yīng)1 h后，待反應(yīng)液顯色后于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，確定最大OD值所對(duì)應(yīng)的Na2CO3體積；②福林-酚體積的確定：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，再分別加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至25 mL，于室溫下避光反應(yīng)1 h后，待反應(yīng)液顯色后于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以確定福林-酚的體積。

(3)測(cè)定時(shí)間的選擇：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1.5 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用雙蒸餾水定容至25 mL，在室溫下分別避光反應(yīng)10、20、30、40、50、60、90、120 min后，于750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，確定最佳測(cè)定時(shí)間。

(4)測(cè)定溫度的選擇：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1.5 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用雙蒸餾水定容至25 mL，分別在10、20、30、40、50、60℃下避光反應(yīng)1 h后，顯色后于波長(zhǎng)750 nm處測(cè)定吸光度值，確定適宜的反應(yīng)溫度。

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：移取0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL試管中，加入5 mL的蒸餾水，再加入1.5 mL的福林-酚比色劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至25 mL，在室溫下避光反應(yīng)1 h后。顯色后在750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以上試驗(yàn)方法均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取絲瓜總酚工藝優(yōu)化

2.1.1 不同提取劑對(duì)絲瓜總酚提取效果的影響 由圖1可知，提取劑不同，總酚的提取效果也不同。其中，乙醇的吸光值最高，丙酮次之，甲醇最小。提取液對(duì)總酚物質(zhì)的顯色反應(yīng)較大，其吸光值也越大，說明絲瓜總酚提取效果越好；同時(shí)，考慮到甲醇和丙醇的毒性及價(jià)格均高于乙醇，因此，選擇乙醇作為絲瓜果肉總酚的提取劑。

2.1.2 不同提取劑濃度對(duì)絲瓜總酚提取效果的影響 由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，絲瓜提取液的吸光度在50%～80%的濃度范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在80%時(shí)其吸光值最高；而后隨著乙醇濃度升高，其吸光值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，下降幅度明顯。提取劑濃度為80%時(shí)吸光值最高，說明絲瓜總酚的提取效果較好，因此，選擇80%的乙醇為絲瓜果肉總酚提取劑濃度。

2.1.3 不同液料比對(duì)絲瓜總酚提取效果的影響 由圖3 可知，總酚提取液隨著液料比的變化而變化。當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，絲瓜的總酚提取液基本上達(dá)到飽和，而后隨著料液比的升高而下降。當(dāng)吸光值越高，說明總酚提取越完全。當(dāng)液料比為1∶12總酚提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明液料比為1∶10時(shí)，絲瓜總酚提取效果較為充分。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)絲瓜總酚提取效果的影響 由圖4所示，隨著超聲波時(shí)間的增加，總酚的吸光值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30 min中達(dá)到峰值，之后逐漸呈下降趨勢(shì)。表明超聲時(shí)間在30 min時(shí)，絲瓜總酚提取效果較好。

2.1.5 超聲溫度對(duì)絲瓜總酚提取效果的影響 由圖5所示，隨著超聲波溫度的增加，總酚的吸光值升高，其吸光值在40℃時(shí)達(dá)到峰值，在60℃時(shí)吸光值下降。表明超聲溫度在40℃時(shí)，絲瓜總酚提取效果較好。

2.2 福林-酚比色法測(cè)定絲瓜總酚含量的優(yōu)化

2.2.1 最佳波長(zhǎng)的確定 將沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液置于波長(zhǎng)500～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)750 nm達(dá)到最大值。吸光值越大，沒食子酸溶液反應(yīng)越完全，因此，選用750 nm作為本次絲瓜總酚含量測(cè)定的最適吸收波長(zhǎng)。

2.2.2 最佳試劑體積的確定 由圖6可知，總酚物質(zhì)的顯色效果隨著Na2CO3體積的增加越來越明顯，Na2CO3體積為1～3 mL時(shí)，吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其對(duì)總酚物質(zhì)顯色效果越來越好；當(dāng)Na2CO3體積達(dá)到3 mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，對(duì)總酚物質(zhì)的顯色效果最好；但 Na2CO3體積超過3 mL時(shí)，其OD值不再明顯增加，基本保持穩(wěn)定；說明Na2CO3體積不足會(huì)導(dǎo)致總酚物質(zhì)顯色不完全。當(dāng)Na2CO3的最佳體積為3 mL時(shí)吸光度值最大，反應(yīng)也最明顯，因此，表明Na2CO3的最佳體積為3 mL。

由圖7所示，隨著福林-酚體積的增加，吸光值也相應(yīng)增加，總酚物質(zhì)的顯色效果也越好。當(dāng)福林-酚體積為1.5 mL時(shí)，吸光值達(dá)最大，反應(yīng)最完全。當(dāng)福林-酚體積過低(0.25 mL)或過高(2 mL)時(shí)，對(duì)顯色反應(yīng)均產(chǎn)生抑制作用，降低其吸光值。因此，確定最佳福林-酚體積為1.5 mL。

2.2.3 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 由圖8可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，總酚物質(zhì)的吸光值也相應(yīng)增加，在前10 min吸光度值最小，反應(yīng)效果不顯著；在60 min時(shí)吸光值達(dá)到最大，反應(yīng)最完全，顯色反應(yīng)明顯；在60 min之后吸光值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，變化幅度較小，顯色反應(yīng)不明顯。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。

2.2.4 最佳反應(yīng)溫度的確定 由圖9可知，總酚的顯色反應(yīng)受溫度的影響。隨著反應(yīng)溫度(10～60℃)的增加，其反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中在30℃時(shí)吸光值達(dá)到最大值，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，其吸光值呈下降的趨勢(shì)。說明當(dāng)超過一定溫度時(shí)，總酚的穩(wěn)定性較差，反應(yīng)產(chǎn)物在高溫下易被分解。因此，選擇30℃作為本次絲瓜總酚測(cè)定的最佳溫度。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由圖10所示，將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行線性回歸，結(jié)果得出吸光度與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液之間的關(guān)系方程式為Y=0.6279X+0.0273，R2=0.994 7，相關(guān)系數(shù)為0.994 7，說明在1～6 μg·mL-1有較好的線性關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以‘黑12’絲瓜品種(系)為試材，利用超聲波提取方法[10-11]，對(duì)絲瓜總酚提取的提取劑、乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度等影響因子進(jìn)行優(yōu)化，利用福林酚比色法[12-13]，對(duì)絲瓜總酚測(cè)定的測(cè)量波長(zhǎng)、試劑體積、測(cè)定時(shí)間、 測(cè)定溫度等影響因子進(jìn)行優(yōu)化，獲得了總酚提取和測(cè)定的反應(yīng)體系：(1)提取優(yōu)化結(jié)果：乙醇濃度為80%，液料比1∶10，超聲波溫度40℃，超聲時(shí)間30 min；(2)測(cè)定優(yōu)化結(jié)果：測(cè)定波長(zhǎng)750 nm，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度30℃，0.5 mol·L-1Na2CO3體積3 mL，0.5 mol·L-1福林-酚體積1.5 mL。總酚含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.994 7)。本研究建立的絲瓜總酚提取和測(cè)定方法具有穩(wěn)定性好、精密度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、不受蛋白質(zhì)的干擾等優(yōu)點(diǎn)，為絲瓜中總酚含量的研究提供技術(shù)支持，為后期抗褐變絲瓜品種選育研究提供了理論依據(jù)。

超聲波輔助提取總酚效果好，具有回收率高、損耗小等優(yōu)勢(shì)，已在果蔬總酚中廣泛應(yīng)用[14-20]。本試驗(yàn)以‘黑12’絲瓜果肉鮮果為試材，利用超聲波輔助提取絲瓜總酚提取液，提取效果較好。由于總酚含有某些羥基類物質(zhì)，可與蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的化合物，因此選擇丙酮、甲醇、乙醇作為絲瓜總酚提取劑[21]。通過上述有機(jī)溶劑提取總酚效果來看，乙醇效果最佳，所以選用乙醇作為總酚提取劑。何志勇[22]通過對(duì)橄欖總酚的提取比較，因丙酮具有劇毒，故選擇乙醇；同時(shí)乙醇提取工藝簡(jiǎn)單，成本低且提取率高，故選擇乙醇作為提取溶劑。超聲時(shí)間與溫度是提取果蔬總酚過程中重要的影響因素，本試驗(yàn)得出絲瓜總酚最佳超聲波時(shí)間與溫度分別為30 min和40℃。若超聲波時(shí)間過短或者溫度過低，絲瓜總酚提取效果也低，時(shí)間過長(zhǎng)或者溫度過高，則會(huì)破壞絲瓜總酚物質(zhì)。因此，超聲提取絲瓜總酚溫度和時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

目前，總酚含量的測(cè)定方法有多種，如紙層析、薄層層析、氣液色譜、高效液相色譜、福林-酚法等多種方法。其中紙層析、薄層層析在分離效果、速度和準(zhǔn)確定量方面存在缺陷; 氣液色譜用于植物酚類物質(zhì)的分離測(cè)定速度快、靈敏度高，但該法需要衍生化處理，前處理比較麻煩; 而高效液相色譜法比較昂貴, 不適于大量的定量分析[23]。福林-酚比色法反應(yīng)原理為酚類化合物在堿性條件下可將鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與酚含量呈正相關(guān)，結(jié)果精確穩(wěn)定，且具有操作方便、所用試劑價(jià)格低廉、適用于批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在植物總酚含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。本試驗(yàn)利用福林-酚法進(jìn)行絲瓜總酚含量的測(cè)定，探索出基層實(shí)驗(yàn)室簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確測(cè)定絲瓜總酚的有效方法。在不同的研究文獻(xiàn)[24-25]中，比色條件選擇差異較大，且不同的提取和測(cè)定條件下其測(cè)定結(jié)果也有所不同；測(cè)定最佳波長(zhǎng)在650～760 nm，反應(yīng)溫度為20～60℃，反應(yīng)時(shí)間在30～120 min等比色條件范圍。本試驗(yàn)的結(jié)果與相關(guān)果蔬的總酚研究結(jié)果相同或者相近，但其反應(yīng)體系的變化均在總酚反應(yīng)的合適范圍內(nèi)。如黃樹蘋等[26]通過福林-酚法測(cè)定絲瓜總酚的波長(zhǎng)為770 nm，而本試驗(yàn)的最佳波長(zhǎng)為750 nm。嚴(yán)娟等[27]利用福林-酚法對(duì)桃總酚進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為765 nm。張立新等[28]研究認(rèn)為，測(cè)定總酚的反應(yīng)體系存在一定的差異，其原因可能與品種和產(chǎn)地有關(guān)，因?yàn)橥还?，若品種不同，或種植在不同地區(qū)，其化學(xué)成分也會(huì)存在較大的差異。

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(責(zé)任編輯：柯文輝)

Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)

ZHU Hai-sheng1,2,3,ZHUANG Yin-hong1,2,3, LIU Jian-ting1,2,3,WANG Bin1,2,3,CHEN Min-dong1,2,3, ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3*,LI Da-zhong1,2,3， XUE Zhu-zheng1,2,3

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

To establish a simple and reliable extraction and measurement method for the total phenol content in luffa (LuffacylindricalRoem), ultrasound and Folin-Ciocaleu colorimetry were applied and operational procedures optimized. Phenols could be optimally extracted from the luffa mesocarp when it was mixed ultrasonically with 80% ethanol in 1∶10 ratio at 40 ℃ for 30 min. The total phenolic content had a linear correlation (Y=0.6279X+0.0273;R2= 0.9947) with the optical absorbance at 750 nm when the solution was made with 3 mL of 0.5 mol·L-1Na2CO3and 1.5 mL of 0.5 mol·L-1Folin-Ciocalteu to react with the sample for 60 min at 30℃. The newly developed extraction and subsequent measurement procedures were simple, rapid, sensitive and accurate. It was considered adequate for the determination of total phenol in luffa.

luffa; total phenol; ultrasound; folin-ciocalteu

2016-04-20初稿；2016-06-28修改稿

朱海生(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：蔬菜分子育種(E-mail：541585978@qq.com) *通訊作者：溫慶放(1965-)，男,研究員，研究方向：蔬菜育種(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)PI項(xiàng)目(2016PI-40); 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015J01118);國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)體系福州試驗(yàn)站(CARS-25-G-20)

S 642.4

：A

：1008-0384(2016)11-1204-06

朱海生，莊尹宏，劉建汀，等.絲瓜總酚提取和測(cè)定方法的優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(11)：1204-1209.

ZHU H-S，ZHUANG Y-H，LIU J-T，et al.Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1204-1209.