朱海生，莊尹宏，劉建汀，王 彬，陳敏氡，張前榮，溫慶放*，李大忠，薛珠政

(1.福建省農業(yè)科學院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農業(yè)科學院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技術研究中心，福建 福州 350013)

絲瓜總酚提取和測定方法的優(yōu)化

朱海生1,2,3，莊尹宏1,2,3，劉建汀1,2,3，王 彬1,2,3，陳敏氡1,2,3，張前榮1,2,3，溫慶放1,2,3*，李大忠1,2,3，薛珠政1,2,3

(1.福建省農業(yè)科學院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農業(yè)科學院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技術研究中心，福建 福州 350013)

為建立簡單、穩(wěn)定的絲瓜總酚提取和測定體系，對絲瓜果肉總酚的超聲波輔助提取和福林-酚比色測定方法進行優(yōu)化。絲瓜果肉與80%乙醇在比例為1∶10、40℃下超聲波提取30 min，總酚的提取效果較好。在測定波長750 nm、0.5 mol·L-1Na2CO3體積3 mL、0.5 mol·L-1福林-酚體積1.5 mL、反應溫度30℃、反應時間60 min時，總酚含量與吸光度呈良好的線性關系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.9947)，說明此方法能夠簡便、準確、快速的測定絲瓜總酚含量。

絲瓜；總酚；超聲波；福林-酚

絲瓜Luffacylindrica原產東印度，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，有普通絲瓜LuffacylindricaRoem和有棱絲瓜LuffaacutangulaRoxb 2個栽培種，在我國南北均有栽培，是我國主要的瓜類蔬菜[1]。絲瓜營養(yǎng)豐富，且具有很好的醫(yī)療保健功能，隨著人們對飲食營養(yǎng)保健的日益重視，絲瓜作為一種藥食兼用的高溫季節(jié)市場供應的蔬菜和保健蔬菜，其需求量不斷增大，栽培面積日益擴大，蘊含著巨大的市場前景，但絲瓜果肉及湯汁出現褐變，大大降低了果蔬的貯藏加工性能，嚴重影響絲瓜產品的商品價值，造成巨大經濟損失，因此成為絲瓜育種和采后的研究熱點。

酚類物質是植物體內重要的次生代謝產物，主要存在于細胞液泡內[2-3]，是蘋果[4]、梨[5]、荔枝[6]、蓮藕[7]等果蔬酶促褐變的底物，導致品質下降，降低園藝產品經濟效益[8-9]。本試驗采用超聲波輔助提取和福林-酚比色法研究絲瓜總酚的提取和測定方法，為今后絲瓜酶促褐變機理研究及絲瓜新品種選育奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗絲瓜品種 本試驗供試絲瓜品種(系)‘黑12’由福建省農業(yè)科學院作物研究所蔬菜中心提供。用雙蒸水進行清洗，晾干，快速削皮后分裝于保鮮袋中，液氮速凍后置于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗試劑 福林-酚購自美國Signa公司；甲醇(CH3OH)、丙酮(CH3COCH3)、乙醇(C2H6O)、碳酸鈉(Na2CO3)、沒食子酸(C7H605)等為國產分析純(廣通貿易化學試劑有限公司)。

沒食子酸溶液配制：稱取 0.11 g沒食子酸，用雙蒸水溶解定容至1 000.0 mL，得到濃度為 100 μg·mL-1的沒食子酸標準溶液。

1.1.3 試驗儀器 DK-8D電熱恒溫水槽(上海-恒科學儀器有限公司)、BILON-96超聲波細胞粉碎機(成都比郎實驗設備有限公司)、UV1000紫外可見分光光度計(天美科學儀器有限公司)、AR224CN電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)、CR22N冷凍高速離心機(北京順心萬昌科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲輔助提取絲瓜總酚工藝優(yōu)化

(1)不同提取劑的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，分別加入60%的乙醇、甲醇、丙酮，料液比1∶8，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測。

(2)不同乙醇濃度的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶8，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測。

(3)不同液料比的選擇

精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，冰浴下研磨至勻漿，于40℃、300 W下超聲輔助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測。

(4)不同超聲時間的選擇

精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至勻漿，超聲時間分別為10、20、30、40、50、60 min，40℃、300 W下超聲輔助提取，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測。

(5)不同超聲溫度的選擇：精確稱取絲瓜果肉樣品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至勻漿，超聲溫度分別為25、40、60℃，300 W下超聲輔助提取30 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液定容至25 mL待測。

1.2.2 福林-酚比色法測定絲瓜總酚含量的優(yōu)化

(1)測量波長的選擇：移取沒食子酸溶液(100 μg·mL-1)1 mL于25 mL試管中，加入5 mL的蒸餾水，再加入1 mL的福林-酚比色劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液2 mL，用雙蒸水定容至25 mL，于室溫下避光反應1 h后，在500～900 nm的波長范圍內掃描。

(2)試劑體積的選擇：①Na2CO3體積的確定：移取沒食子酸溶液7份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1 mL的福林-酚比色劑，混勻靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用雙蒸水定容至25 mL，在室溫下避光反應1 h后，待反應液顯色后于750 nm波長處測定OD值，確定最大OD值所對應的Na2CO3體積；②福林-酚體積的確定：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，再分別加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至25 mL，于室溫下避光反應1 h后，待反應液顯色后于750 nm波長處測定OD值，以確定福林-酚的體積。

(3)測定時間的選擇：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1.5 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用雙蒸餾水定容至25 mL，在室溫下分別避光反應10、20、30、40、50、60、90、120 min后，于750 nm波長處測定OD值，確定最佳測定時間。

(4)測定溫度的選擇：取沒食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸餾水，加入1.5 mL福林-酚試劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用雙蒸餾水定容至25 mL，分別在10、20、30、40、50、60℃下避光反應1 h后，顯色后于波長750 nm處測定吸光度值，確定適宜的反應溫度。

(5)標準曲線的繪制：移取0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL的沒食子酸標準液于25 mL試管中，加入5 mL的蒸餾水，再加入1.5 mL的福林-酚比色劑，混勻后靜置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸餾水定容至25 mL，在室溫下避光反應1 h后。顯色后在750 nm波長處測定OD值，以吸光值為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

以上試驗方法均重復3次。

1.3 數據處理與分析

運用Excel 2003進行數據整理和作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助提取絲瓜總酚工藝優(yōu)化

2.1.1 不同提取劑對絲瓜總酚提取效果的影響 由圖1可知，提取劑不同，總酚的提取效果也不同。其中，乙醇的吸光值最高，丙酮次之，甲醇最小。提取液對總酚物質的顯色反應較大，其吸光值也越大，說明絲瓜總酚提取效果越好；同時，考慮到甲醇和丙醇的毒性及價格均高于乙醇，因此，選擇乙醇作為絲瓜果肉總酚的提取劑。

2.1.2 不同提取劑濃度對絲瓜總酚提取效果的影響 由圖2可知，隨著乙醇濃度的增大，絲瓜提取液的吸光度在50%～80%的濃度范圍內呈上升趨勢，在80%時其吸光值最高；而后隨著乙醇濃度升高，其吸光值呈現下降趨勢，下降幅度明顯。提取劑濃度為80%時吸光值最高，說明絲瓜總酚的提取效果較好，因此，選擇80%的乙醇為絲瓜果肉總酚提取劑濃度。

2.1.3 不同液料比對絲瓜總酚提取效果的影響 由圖3 可知，總酚提取液隨著液料比的變化而變化。當料液比為1∶10時，絲瓜的總酚提取液基本上達到飽和，而后隨著料液比的升高而下降。當吸光值越高，說明總酚提取越完全。當液料比為1∶12總酚提取量呈現下降趨勢，表明液料比為1∶10時，絲瓜總酚提取效果較為充分。

2.1.4 超聲時間對絲瓜總酚提取效果的影響 由圖4所示，隨著超聲波時間的增加，總酚的吸光值呈現先上升后下降的趨勢，在30 min中達到峰值，之后逐漸呈下降趨勢。表明超聲時間在30 min時，絲瓜總酚提取效果較好。

2.1.5 超聲溫度對絲瓜總酚提取效果的影響 由圖5所示，隨著超聲波溫度的增加，總酚的吸光值升高，其吸光值在40℃時達到峰值，在60℃時吸光值下降。表明超聲溫度在40℃時，絲瓜總酚提取效果較好。

2.2 福林-酚比色法測定絲瓜總酚含量的優(yōu)化

2.2.1 最佳波長的確定 將沒食子酸標準溶液置于波長500～900 nm范圍內進行掃描，沒食子酸標準溶液在波長750 nm達到最大值。吸光值越大，沒食子酸溶液反應越完全，因此，選用750 nm作為本次絲瓜總酚含量測定的最適吸收波長。

2.2.2 最佳試劑體積的確定 由圖6可知，總酚物質的顯色效果隨著Na2CO3體積的增加越來越明顯，Na2CO3體積為1～3 mL時，吸光度呈現上升趨勢，其對總酚物質顯色效果越來越好；當Na2CO3體積達到3 mL時，吸光度達到最大值，對總酚物質的顯色效果最好；但 Na2CO3體積超過3 mL時，其OD值不再明顯增加，基本保持穩(wěn)定；說明Na2CO3體積不足會導致總酚物質顯色不完全。當Na2CO3的最佳體積為3 mL時吸光度值最大，反應也最明顯，因此，表明Na2CO3的最佳體積為3 mL。

由圖7所示，隨著福林-酚體積的增加，吸光值也相應增加，總酚物質的顯色效果也越好。當福林-酚體積為1.5 mL時，吸光值達最大，反應最完全。當福林-酚體積過低(0.25 mL)或過高(2 mL)時，對顯色反應均產生抑制作用，降低其吸光值。因此，確定最佳福林-酚體積為1.5 mL。

2.2.3 最佳反應時間的確定 由圖8可知，隨著反應時間的增加，總酚物質的吸光值也相應增加，在前10 min吸光度值最小，反應效果不顯著；在60 min時吸光值達到最大，反應最完全，顯色反應明顯；在60 min之后吸光值呈現下降趨勢，變化幅度較小，顯色反應不明顯。因此，最佳反應時間為60 min。

2.2.4 最佳反應溫度的確定 由圖9可知，總酚的顯色反應受溫度的影響。隨著反應溫度(10～60℃)的增加，其反應產物的吸光值呈增長趨勢，其中在30℃時吸光值達到最大值，之后隨著反應時間的延長，其吸光值呈下降的趨勢。說明當超過一定溫度時，總酚的穩(wěn)定性較差，反應產物在高溫下易被分解。因此，選擇30℃作為本次絲瓜總酚測定的最佳溫度。

2.2.5 標準曲線的建立 由圖10所示，將測定結果進行線性回歸，結果得出吸光度與沒食子酸標準溶液之間的關系方程式為Y=0.6279X+0.0273，R2=0.994 7，相關系數為0.994 7，說明在1～6 μg·mL-1有較好的線性關系。

3 討論與結論

本試驗以‘黑12’絲瓜品種(系)為試材，利用超聲波提取方法[10-11]，對絲瓜總酚提取的提取劑、乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度等影響因子進行優(yōu)化，利用福林酚比色法[12-13]，對絲瓜總酚測定的測量波長、試劑體積、測定時間、 測定溫度等影響因子進行優(yōu)化，獲得了總酚提取和測定的反應體系：(1)提取優(yōu)化結果：乙醇濃度為80%，液料比1∶10，超聲波溫度40℃，超聲時間30 min；(2)測定優(yōu)化結果：測定波長750 nm，反應時間60 min，反應溫度30℃，0.5 mol·L-1Na2CO3體積3 mL，0.5 mol·L-1福林-酚體積1.5 mL?？偡雍颗c吸光度呈良好的線性關系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.994 7)。本研究建立的絲瓜總酚提取和測定方法具有穩(wěn)定性好、精密度高、操作簡便、省時、不受蛋白質的干擾等優(yōu)點，為絲瓜中總酚含量的研究提供技術支持，為后期抗褐變絲瓜品種選育研究提供了理論依據。

超聲波輔助提取總酚效果好，具有回收率高、損耗小等優(yōu)勢，已在果蔬總酚中廣泛應用[14-20]。本試驗以‘黑12’絲瓜果肉鮮果為試材，利用超聲波輔助提取絲瓜總酚提取液，提取效果較好。由于總酚含有某些羥基類物質，可與蛋白質和多糖等物質結合，形成穩(wěn)定的化合物，因此選擇丙酮、甲醇、乙醇作為絲瓜總酚提取劑[21]。通過上述有機溶劑提取總酚效果來看，乙醇效果最佳，所以選用乙醇作為總酚提取劑。何志勇[22]通過對橄欖總酚的提取比較，因丙酮具有劇毒，故選擇乙醇；同時乙醇提取工藝簡單，成本低且提取率高，故選擇乙醇作為提取溶劑。超聲時間與溫度是提取果蔬總酚過程中重要的影響因素，本試驗得出絲瓜總酚最佳超聲波時間與溫度分別為30 min和40℃。若超聲波時間過短或者溫度過低，絲瓜總酚提取效果也低，時間過長或者溫度過高，則會破壞絲瓜總酚物質。因此，超聲提取絲瓜總酚溫度和時間不宜過長。

目前，總酚含量的測定方法有多種，如紙層析、薄層層析、氣液色譜、高效液相色譜、福林-酚法等多種方法。其中紙層析、薄層層析在分離效果、速度和準確定量方面存在缺陷; 氣液色譜用于植物酚類物質的分離測定速度快、靈敏度高，但該法需要衍生化處理，前處理比較麻煩; 而高效液相色譜法比較昂貴, 不適于大量的定量分析[23]。福林-酚比色法反應原理為酚類化合物在堿性條件下可將鎢鉬酸還原，生成藍色的化合物，顏色的深淺與酚含量呈正相關，結果精確穩(wěn)定，且具有操作方便、所用試劑價格低廉、適用于批量檢測等優(yōu)點，在植物總酚含量測定中應用廣泛。本試驗利用福林-酚法進行絲瓜總酚含量的測定，探索出基層實驗室簡單、快速、準確測定絲瓜總酚的有效方法。在不同的研究文獻[24-25]中，比色條件選擇差異較大，且不同的提取和測定條件下其測定結果也有所不同；測定最佳波長在650～760 nm，反應溫度為20～60℃，反應時間在30～120 min等比色條件范圍。本試驗的結果與相關果蔬的總酚研究結果相同或者相近，但其反應體系的變化均在總酚反應的合適范圍內。如黃樹蘋等[26]通過福林-酚法測定絲瓜總酚的波長為770 nm，而本試驗的最佳波長為750 nm。嚴娟等[27]利用福林-酚法對桃總酚進行測定，測定波長為765 nm。張立新等[28]研究認為，測定總酚的反應體系存在一定的差異，其原因可能與品種和產地有關，因為同一果蔬，若品種不同，或種植在不同地區(qū)，其化學成分也會存在較大的差異。

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(責任編輯：柯文輝)

Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)

ZHU Hai-sheng1,2,3,ZHUANG Yin-hong1,2,3, LIU Jian-ting1,2,3,WANG Bin1,2,3,CHEN Min-dong1,2,3, ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3*,LI Da-zhong1,2,3， XUE Zhu-zheng1,2,3

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

To establish a simple and reliable extraction and measurement method for the total phenol content in luffa (LuffacylindricalRoem), ultrasound and Folin-Ciocaleu colorimetry were applied and operational procedures optimized. Phenols could be optimally extracted from the luffa mesocarp when it was mixed ultrasonically with 80% ethanol in 1∶10 ratio at 40 ℃ for 30 min. The total phenolic content had a linear correlation (Y=0.6279X+0.0273;R2= 0.9947) with the optical absorbance at 750 nm when the solution was made with 3 mL of 0.5 mol·L-1Na2CO3and 1.5 mL of 0.5 mol·L-1Folin-Ciocalteu to react with the sample for 60 min at 30℃. The newly developed extraction and subsequent measurement procedures were simple, rapid, sensitive and accurate. It was considered adequate for the determination of total phenol in luffa.

luffa; total phenol; ultrasound; folin-ciocalteu

2016-04-20初稿；2016-06-28修改稿

朱海生(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：蔬菜分子育種(E-mail：541585978@qq.com) *通訊作者：溫慶放(1965-)，男,研究員，研究方向：蔬菜育種(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省農業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊PI項目(2016PI-40); 福建省自然科學基金項目(2015J01118);國家大宗蔬菜產業(yè)體系福州試驗站(CARS-25-G-20)

S 642.4

：A

：1008-0384(2016)11-1204-06

朱海生，莊尹宏，劉建汀，等.絲瓜總酚提取和測定方法的優(yōu)化[J].福建農業(yè)學報，2016，31(11)：1204-1209.

ZHU H-S，ZHUANG Y-H，LIU J-T，et al.Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1204-1209.