葉秀仙，黃敏玲*，羅遠華，林榕燕，鐘淮欽

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

盆花文心蘭叢生芽組培快繁技術(shù)研究

葉秀仙1,2,3，黃敏玲1,2,3*，羅遠華1,2,3，林榕燕1,2,3，鐘淮欽1,2,3

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

以文心蘭‘豹斑寶石’花梗為外植體，采用叢生芽誘導途徑，利用正交設(shè)計法，探討基本培養(yǎng)基(MS、花寶1號、改良1號、改良2號、改良3號)、植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA、IBA)、水解酪蛋白(CH)等對其叢生芽誘導、增殖、生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，以期建立文心蘭‘豹斑寶石’叢生芽組培快繁技術(shù)。結(jié)果表明：各試驗因素對文心蘭叢生芽增殖影響的主次關(guān)系為6-BA>基本培養(yǎng)基>NAA>CH；篩選出叢生芽適宜的增殖培養(yǎng)基配方為改良1號 + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+CH 0.5 g·L-1+白糖30 g·L-1+瓊脂粉5.0 g·L-1，50 d平均增殖系數(shù)達5.8；篩選出適宜生根的培養(yǎng)基配方為改良3號+ IBA 0.5 mg·L-1+活性碳0.5 g·L-1+白糖20 g·L-1+瓊脂粉3.6 g·L-1+卡拉膠3.6 g·L-1，生根率為100.0%；試管苗移栽6個月成活率達96.8%。

文心蘭；叢生芽；正交設(shè)計；組織培養(yǎng)

文心蘭為蘭科文心蘭屬Oncidium植物，是大宗商品蘭花，在臺灣產(chǎn)業(yè)僅次于蝴蝶蘭。在臺灣企業(yè)的帶動下，福建省文心蘭產(chǎn)業(yè)迅速崛起，成為全國主要種植基地之一。盆花文心蘭適栽范圍廣，種質(zhì)資源豐富，花色、花型多樣，觀賞期長、部分種質(zhì)更具香味，開發(fā)利用前景良好。文心蘭同其他蘭科植物一樣，按照傳統(tǒng)的分株繁殖法進行繁殖，繁殖系數(shù)較低，難以滿足生產(chǎn)需要。因此其種苗繁殖可以通過組織培養(yǎng)技術(shù)來實現(xiàn)種苗工廠化生產(chǎn)[1-4]。

目前，國內(nèi)關(guān)于文心蘭組織培養(yǎng)研究報道，主要采用2種誘導途徑，較多研究是選擇原球莖誘導途徑，即通過原球莖誘導、增殖及苗分化達到快速繁殖的目的，雖然繁殖系數(shù)比較高，但由于原球莖途徑要經(jīng)歷脫分化再分化培養(yǎng)過程，仍存在歷時較長、成苗率較低等問題，且還可能存在再生植株易出現(xiàn)變異的風險。而叢生芽誘導途徑的優(yōu)點是通過芽生芽達到快速繁殖的目的，可大大降低后代變異的可能性。近年來，本課題組在文心蘭‘蜜糖’、‘小櫻桃’等品種的種苗繁育方面實踐證實了叢生芽途徑的可行性[5-7]。目前，有關(guān)文心蘭采用叢生芽誘導途徑建立組培快繁技術(shù)的系統(tǒng)研究報道較少[5-8]，且由于存在外植體部位、基因型等因素的差異, 其組培快繁關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)中依然存在較多值得進一步研究的問題，包括如何通過基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)條件等誘導增殖與生根移栽關(guān)鍵因子的優(yōu)化，構(gòu)建一套適用于文心蘭種苗繁育的生產(chǎn)技術(shù)，來滿足市場對優(yōu)質(zhì)種苗的需求。

文心蘭‘豹斑寶石’系Cochlioda×Odontoglossum×Zelenkoa三屬雜交而來的紅花豹斑大花型新品種，花朵艷麗，開放整齊；葉片濃綠挺立，假鱗莖飽滿，盆花商品價值高。目前，有關(guān)文心蘭‘豹斑寶石’叢生芽組培快繁技術(shù)研究未見報道。本研究采用叢生芽誘導途徑，探討基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑等對‘豹斑寶石’叢生芽誘導、增殖與生根培養(yǎng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，旨在探索文心蘭優(yōu)質(zhì)種苗工廠化快繁技術(shù)，為提高其種苗商業(yè)化生產(chǎn)效率提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

文心蘭‘豹斑寶石’ZelglossodaCalicoGem‘Green Valley #1’，臺灣引進的盆花品種，選擇健壯植株抽長的幼嫩花梗作為培養(yǎng)的外植體。試驗在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉育種實驗室進行。

培養(yǎng)基花寶1號產(chǎn)地美國，其N、P、K質(zhì)量比7∶6∶19；改良1、2、3號基本培養(yǎng)基參照MS調(diào)整N、P、K含量，其他元素含量不變，其中改良1、2號中大量元素KNO3、NH4NO3、KH2PO4、 MgSO4·7H2O調(diào)整為MS的1/2、 1/3， 并附加花寶1號1.5 g·L-1，改良3號大量元素NH4NO3、KH2PO4、 MgSO4·7H2O及CaCl2·2H2O調(diào)整為MS的1/2，并附加花寶1號0.8 g·L-1。所用試劑均為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)的分析純；白糖為廈門古龍牌優(yōu)質(zhì)白砂糖；瓊脂粉、卡拉膠產(chǎn)地日本，強度1 400 g·cm-2。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒滅菌處理 從健康母株上選取幼嫩帶腋芽的花梗，用自來水沖洗干凈，然后分段并剝?nèi)ヒ秆垦壳?，在超凈工作臺上將外植體放入無菌容器中，先用75%的酒精浸泡30 s，隨后轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡消毒6 min，更換升汞溶液，進行二次消毒5 min，取出用無菌水沖洗4～5次，再用無菌濾紙吸干水分，備用。

1.2.2 叢生芽誘導與增殖 切取帶腋芽的節(jié)間部分接種到1/2MS+噻重氮苯基脲(TDZ)0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+白糖30 g·L-1+瓊脂粉5.0 g·L-1培養(yǎng)基中進行叢生芽誘導培養(yǎng)。獲得的叢生芽作為增殖培養(yǎng)試驗材料。

叢生芽增殖采用4因素4水平L16(44)正交設(shè)計，選擇基本培養(yǎng)基(MS、花寶1號、改良1號、改良2號)、6-BA、NAA、水解酪蛋白(CH)為試驗因素，代號分別為A、B、C、D，各設(shè)置4個水平，詳見表1。各處理培養(yǎng)基均附加白糖30 g·L-1、瓊脂粉5.0 g·L-1。16個處理，每處理接種5瓶，每瓶接種10團(每團帶2～3個小芽)，3 次重復。增殖培養(yǎng)45～50 d時統(tǒng)計叢生芽增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng) 以改良3號為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA(0.2、0.5 m g·L-1)和IBA(0.2、0.5 m g·L-1)以及活性碳0.5 g·L-1，白糖20 g·L-1，瓊脂粉3.6 g·L-1，卡拉膠3.6 g·L-1。6個處理，每處理接種6瓶，每瓶接種25株，3 次重復。生根培養(yǎng)75 d時統(tǒng)計生根情況。

1.2.4 煉苗移栽 當苗高8.0～11.0 cm、具5～7片葉時，將瓶苗放置于遮光率70%～80%的溫室中煉苗，并進行移栽種植，定期觀測移栽成活率及生長表現(xiàn)。

1.2.5 培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件 以650 mL的組培瓶為培養(yǎng)容器，采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式， pH值5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光強為2 000～2 500 lx，光照時間為12 h·d-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用正交設(shè)計助手V3.1軟件進行分析[9]。

表1 L16 (44 ) 因素及水平Table 1 L16 (44) factors and levels of orthogonal experimentation

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽誘導與增殖

帶腋芽的花梗切段接種在誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21 d 時，花梗芽逐漸萌動膨大，基部逐漸脫分化出生長點，逐漸形成突起，分化出叢生小芽，經(jīng)3～5次繼代轉(zhuǎn)接，獲得一定量的叢生芽作為下一步增殖培養(yǎng)試驗材料。

芽的增殖是文心蘭組培快繁的重要環(huán)節(jié)，增殖率影響繁殖效率。利用正交設(shè)計法[L16(44) ]研究了基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、水解酪蛋白(CH) 4 種因素對文心蘭叢生芽增殖的影響，從而優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件以篩選出適宜的培養(yǎng)基配方。叢芽團接種21 d時，芽基部切口部位開始膨大，35 d時不同處理組陸續(xù)長出叢生芽。增殖培養(yǎng)50 d時統(tǒng)計叢生芽增殖系數(shù)(增殖系數(shù)= 增殖芽數(shù)/接種芽數(shù))，試驗統(tǒng)計分析結(jié)果見表2、3。

表2結(jié)果表明，從k值大小可以看出, 在文心蘭叢生芽增殖培養(yǎng)過程中, 以改良1號為基本培養(yǎng)基較好，6-BA濃度需求量較高, 適宜濃度為3.0 mg·L-1，NAA適宜濃度為0.1 mg·L-1，CH為0.5 g·L-1；從極差R值大小可以看出，不同因素對叢芽增殖影響的主次關(guān)系為B>A>C>D，這說明對文心蘭叢芽增殖起主要作用是6-BA，其次是基本培養(yǎng)基，NAA、CH對增殖的影響較小。文心蘭叢芽增殖最佳處理組合是A3B4C2D3，即改良1號 + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+CH 0.5 g·L-1，50 d增殖系數(shù)達5.8。實現(xiàn)了種苗大量繁殖，為工廠化育苗提供了技術(shù)保障(圖1)。

從表3可知，基本培養(yǎng)基、6-BA這2個因素均顯著影響文心蘭叢生芽增殖系數(shù)，但其影響程度的大小有較大差異，表現(xiàn)為6-BA>基本培養(yǎng)基， NAA和CH這2個因素無顯著影響，與極差分析結(jié)果一致。

表2 ‘豹斑寶石’叢生芽增殖L16 (44 )正交試驗設(shè)計與極差分析結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

表3 ‘豹斑寶石’叢生芽增殖系數(shù)方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance on propagation rate

2.2 生根培養(yǎng)

叢生芽增殖獲得大部分芽可直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，少量小芽可繼續(xù)增殖或先轉(zhuǎn)接到改良1號 +白糖30 g·L-1+ 瓊脂粉3.0 g·L-1+ 卡拉膠3.0 g·L-1的培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)30～35 d，待苗長至2.0～3.0 cm時，再進行生根培養(yǎng)。

試管苗生長表現(xiàn)見表4，綜合考慮生根率、發(fā)根數(shù)及根的質(zhì)量，篩選出適宜生根的培養(yǎng)基配方為改良3號+ IBA 0.5 mg·L-1+活性碳0.5 g·L-1+白糖20 g·L-1+瓊脂粉3.6 g·L-1+ 卡拉膠3.6 g·L-1，生根率為100.0%，平均生根數(shù)8.5條，平均根長3.6 cm(圖2)。

表4 不同濃度的NAA和IBA對試管苗生根培養(yǎng)的影響Table 4 Effect of NAA and IBA concentrations on plantlet rooting in test tube

2.3 煉苗及移栽

當文心蘭苗高8.0～11.0 cm，具5～7片葉時，將瓶苗放置于遮光率70%～80%的溫室中煉苗約15 d(閉口10 d、半敞口3 d、全敞口3 d)，以提高瓶苗適應(yīng)力(圖3)。

煉苗后進行清水洗苗，洗凈根部粘連的培養(yǎng)基，然后將苗置于1.0 g·L-1多菌靈或百菌清殺菌劑溶液浸泡消毒5 min，撈出晾干，及時剔除畸形、弱小植株，采用水苔(水苔需用清水浸泡8 h以上，瀝干水分后，用清水沖洗一遍再擠干水分備用)包住根部植入直徑5.0 cm育苗杯中，放置四槽托盤整齊擺放在溫室層架上進行常規(guī)栽培管理(圖4)。

移栽種植過程生長表現(xiàn)如表5所示，移栽6個月成活率達96.8%，且生長勢強，根系生長良好(圖5)；在移栽6個月時，進行了直徑11 cm育苗杯換盆種植，以樹皮與椰殼組合(比例2∶1)為栽培基質(zhì)，換盆后加強水肥管理，生長速度加快，形成的假鱗莖健壯、飽滿，呈扁圓形生長，換盆種植6個月成活率達100.0%，且生長勢強(圖6)。

表5 文心蘭試管苗移栽生長表現(xiàn)Table 5 Growth performance of transplanted plantlets from test tubes

3 討論與結(jié)論

文心蘭種苗繁育基本技術(shù)環(huán)節(jié)主要包括叢生芽誘導、叢生芽增殖、壯苗生根及煉苗移栽等，由于存在外植體基因型等因素的差異，其各環(huán)節(jié)關(guān)鍵技術(shù)在對特定基因型材料進行培養(yǎng)時，一定要進行反復試驗, 才能尋找最適合特定基因型材料培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基與培養(yǎng)方式。

本試驗選擇叢生芽途徑直接誘導出苗，并利用正交試驗設(shè)計方法，探索文心蘭‘豹斑寶石’叢生芽增殖培養(yǎng)體系，篩選出適宜的增殖培養(yǎng)基配方是改良1號 + 6-BA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+CH 0.5 g·L-1+白糖30 g·L-1，50 d增殖系數(shù)達5.8，有效提高了其繁殖效率，為種苗工程化育苗提供了技術(shù)保障。篩選出適宜生根的培養(yǎng)基配方為改良3號+ IBA0.5 mg·L-1+活性碳0.5 g·L-1+白糖20 g·L-1+瓊脂粉3.6 g·L-1+卡拉膠3.6 g·L-1，生根率為100.0%，平均生根數(shù)8.5條，平均根長3.6 cm，獲得健壯生長的生根苗為移栽成活提供了基礎(chǔ)保障，移栽6個月成活率可達96.8%，換盆種植6個月成活率達100.0%。可見其組培快繁的各個環(huán)節(jié)是緊密相扣的，保持一定增殖率的同時，誘導生根、煉苗移栽等環(huán)節(jié)也至關(guān)重要。

據(jù)有關(guān)報道，原球莖月增殖率高，可達332.5%，但采用原球莖誘導途徑，其外植體經(jīng)原球莖到成苗比叢生芽途徑成苗要晚60 d以上，而且長成的苗大多纖細柔弱，必須經(jīng)過壯苗培養(yǎng)階段才能更好地生長，另外原球莖后代再生植株中有較高的變異率，難以保持母株的優(yōu)良特性[10]。而本研究選用叢生芽途徑，1個芽在50 d內(nèi)增殖系數(shù)可達5.8，雖然增殖系數(shù)比原球莖低，但長成的苗大多健壯，無須壯苗培養(yǎng)就可直接進行生根培養(yǎng)，從而簡化培養(yǎng)步驟，降低培養(yǎng)成本。因此，筆者認為采用叢生芽途徑繁殖文心蘭具有更大的應(yīng)用價值，尤其適用于文心蘭優(yōu)良品種的種苗生產(chǎn)。

關(guān)于文心蘭組培的文獻報道較多[11-15]，但不同研究者得出不盡相同的試驗結(jié)果，這可能與所使用材料的基因型不同有一定關(guān)系，對特定基因型材料進行培養(yǎng)時, 必須考慮材料的基因型，確立適合于自身材料特點的培養(yǎng)條件與培養(yǎng)方案。本研究初步建立了文心蘭‘豹斑寶石’叢生芽組培快繁技術(shù)，其中更優(yōu)化的技術(shù)培養(yǎng)方案有待進一步試驗探討。

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(責任編輯：柯文輝)

Bud Tissue Culture and Rapid Propagation of Potted Flower,Oncidium

YE Xiu-xian1,2,3， HUANG Min-ling1,2,3*， LUO Yuan-hua1,2,3, LIN Rong-yan1,2,3, ZHONG Huai-qin1,2,3

(1.InstituteofCropSciences,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013，China; 2.FlowersResearchCenter，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China;

3.FujianEngineeringResearchCenterforCharacteristicFloriculture，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China)

The peduncle axillary buds of Zelglossoda Calico Gem, Green Valley #1, were used as explants for the study. The bud clumps induction pathway was experimented with orthogonal design to study the effects of the key factors, such as culture medium (i.e., MS, Hyponex #1, Improvement #1, Improvement #2, and Improvement #3)， phytohormone (i.e., 6-BA, NAA, and IBA), and CH, on the plant growth during the induction, propagation, and rooting stages. The results showed that the main factors affecting the bud multiplication included 6-BA, basic medium, NAA, and CH. The optimal growth was observed under the use of the combination of Improvement #1 medium, 6-BA 3.0 mg·L-1, NAA 0.1 mg·L-1, CH 0.5 g·L-1and agar powder 5.0 g·L-1to result in an averaged propagation coefficient of 5.8 in 50 days. For the rooting, Improvement #3 with added IBA 0.5 mg·L-1,AC 0.5 g·L-1, sugar 20 g·L-1,agar 3.6 g·L-1and carrageenan 3.6 g·L-1was the best with a 100.0% rooting rate. The survival rate of the plantlets in 6 months after transplanting from the test tubes was 96.8%.

Oncidium; bud clumps; orthogonal design; tissue culture

2016-07-02初稿；2016-08-14修改稿

葉秀仙(1977-)，女，副研究員, 主要從事花卉組織培養(yǎng)技術(shù)研究 (E-mail:yxx7861@163.com) *通訊作者：黃敏玲(1960-)，女， 研究員，主要從事花卉品種選育與生物技術(shù)研究(E-mail: huangml618@163.com)

福建省財政專項——福建省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新團隊PI項目(2016PI-39)；福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目(2014S1477-14) ；福建省花卉苗木品種引進與研發(fā)創(chuàng)新項目(閩林種站[2013]42號)

S 68

：A

：1008-0384(2016)11-1198-06

葉秀仙，黃敏玲，羅遠華,等.盆花文心蘭叢生芽組培快繁技術(shù)研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31(11)：1198-1203.

YE X-X，HUANG M-L，LUO Y-H，et al.Bud Tissue Culture and Rapid Propagation of Potted Flower,Oncidium[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1198-1203.