鐘淮欽，林榕燕，黃敏玲*，林 兵，陳南川

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；4.福建百秾生態(tài)科技有限公司，福建 詔安 363500)

雜交蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析

鐘淮欽1,2,3，林榕燕1,2,3，黃敏玲1,2,3*，林 兵1,2,3，陳南川4

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究中心，福建 福州 350013；3.福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；4.福建百秾生態(tài)科技有限公司，福建 詔安 363500)

采用SRAP 技術(shù)對24份雜交蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行分析。篩選出的11對引物組合共擴增出119條譜帶，其中102條為多態(tài)帶，多態(tài)性比率86.1%，平均每對引物組合產(chǎn)生9.3個多態(tài)性位點。各種質(zhì)之間的相似系數(shù)變化范圍為0.43～0.98，平均為0.67。UPGMA 聚類分析表明：在遺傳相似系數(shù)0.69處將24份供試材料劃分為5個類群，較好地揭示了雜交蘭種質(zhì)間的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，可為雜交蘭種質(zhì)資源利用、雜交育種親本選擇及雜種后代鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

雜交蘭；SRAP；遺傳多樣性；聚類分析

雜交蘭Cymbidiumhybrid是蘭屬CymbidiumSw.地生蘭和附生蘭種間雜交培育而成的蘭花新種類，集地生蘭的植株小巧、幽香、典雅和附生蘭的花大、色純靚麗等優(yōu)異特性，花期長，有花觀花、無花觀葉，觀賞價值和經(jīng)濟價值高，逐漸成為消費市場的新寵，開發(fā)潛力巨大[1-2]。目前，國內(nèi)雜交蘭品種的選育研究尚處于起步階段，親本及商業(yè)應(yīng)用品種主要來源于韓國、日本、美國等國家和我國臺灣地區(qū)。且隨著產(chǎn)業(yè)的不斷開發(fā)，不同地域間相互引種，出現(xiàn)了“同物異名”和“同名異物”的現(xiàn)象。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定評價方法，對雜交蘭種質(zhì)資源保存、種質(zhì)創(chuàng)新、品種規(guī)范管理、知識產(chǎn)權(quán)保護及推廣應(yīng)用等具有重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價值。

SRAP(sequence-related amplified polymor-phism，相關(guān)序列擴增多態(tài)性)是一種新型的PCR 分子標(biāo)記技術(shù)[3]。該標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和AFLP 的優(yōu)點，具有操作簡單、穩(wěn)定、可重復(fù)、高共顯性、譜帶易分離及測序、在基因組中分布均勻等特點[4-5]，已應(yīng)用于國蘭[6-8]、大花蕙蘭[9]、文心蘭[10]、矮牽牛[11]、苦瓜[12]、花椰菜[13]、油菜[14]、荔枝[15]、棉花[16]和紅麻[17]等多種植物種質(zhì)遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、重要性狀標(biāo)記及比較基因組學(xué)研究等。目前，國內(nèi)對雜交蘭的研究主要集中在種子無菌播種與組培快繁[18-21]、種苗培育[22]、栽培生理[23]和染色體研究[24]等方面，而應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的文章未見報道。因此，本研究通過對收集、保存的24份不同類型的雜交蘭種質(zhì)進行SRAP分析，探究其種質(zhì)資源遺傳多樣性水平，以期為品種鑒定、雜交育種中的親本選配和種質(zhì)資源的科學(xué)合理利用提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種的試樣采集于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所蘭花種質(zhì)資源圃，共24份，其編號及品種名等詳見表1。試驗在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉分子育種實驗室完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 取不同種質(zhì)同一生長期幼嫩葉片，采用改良的CTAB法[25]提取基因組DNA。提取的DNA 原液經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度后，稀釋至100 ng·μL-1，于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 雜交蘭供試材料Table 1 Cymbidium hybrids examined

1.2.2 SRAP-PCR擴增 參考Budak 等[26]的引物，由8 條正向引物和10條反向引物，隨機組成80對引物組合；SRAP-PCR 反應(yīng)體系25.0 μL，其中10×Buffer 溶液(含Mg2+)2.5 μL、dNTPs 溶液(2.5 mmol·L-1)2.0 μL、Taq DNA 聚合酶0.25 μL、正反引物(10 mmol·L-1)各1.0μL、模板DNA (100 ng) 1.0 μL、超純水17.25 μL；采用變溫復(fù)性反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，前5個循環(huán)35℃復(fù)性，后30個循環(huán)50℃復(fù)性；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)在ABI-9700 PCR 儀上進行。擴增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠、120 V 恒壓電泳，以DL2000 DNA marker為對照，溴化乙啶染色后紫外凝膠成像儀觀察照相。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳結(jié)果，每個樣品中存在的穩(wěn)定條帶記作1，缺失的記作0，強帶和可重復(fù)弱帶均記作1，采用Excel 統(tǒng)計軟件建立原始二元數(shù)據(jù)矩陣。采用DPS統(tǒng)計軟件對原始數(shù)據(jù)矩陣進行分析，按類平均法(UPGMA)進行聚類分析構(gòu)建聚類圖，并計算遺傳相似性系數(shù)(GS)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物多態(tài)性分析

從80對引物組合中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物11對，對24份雜交蘭種質(zhì)進行SRAP-PCR擴增(圖1為引物組合Me3+Em3和Me6+Em2的擴增圖譜)。11對引物共擴增出119條清晰條帶，DAN 片段大小為200～2 000 bp，平均每對引物獲得DNA 條帶10.8條；其中多態(tài)性譜帶102條，多態(tài)性比率為86.1%(表2)。表明SRAP 標(biāo)記在雜交蘭種質(zhì)中具有較為豐富的遺傳多態(tài)性。

2.2 遺傳相似性分析

根據(jù)SRAP 標(biāo)記的分析結(jié)果，24份供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS 為0.43～0.98，平均為0.67。表明雜交蘭種質(zhì)間有著豐富的遺傳多樣性?！G翡翠’與‘立葉大鳳’、‘韓國小姐’與‘爪藝韓國小姐’、‘櫻花’與‘K40-2櫻花’之間的遺傳相似系數(shù)GS 很高，分別達到0.96和0.98，遺傳距離很近；‘櫻花’與‘綠翡翠’、‘黃金龍’的遺傳相似系數(shù)GS 最低為0.43，遺傳距離最遠；而大部分種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.50～0.90。結(jié)果表明，多數(shù)雜交蘭品種間表現(xiàn)出一定的遺傳相似性，少數(shù)品種間存在中等程度的遺傳差異。

表2 SRAP 引物組合的擴增結(jié)果Table 2 Results and polymorphism of SRAP primer combinations

2.3 聚類分析

利用UPGMA法對24份雜交蘭種質(zhì)的SRAP 擴增結(jié)果進行聚類分析，建立親緣關(guān)系聚類圖(圖2)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.69時，供試材料可劃分為5個類群：第Ⅰ類群主要由5個黃色系和3個紅色系種質(zhì)組成，春節(jié)前后開花；第Ⅱ類群由6個紅色系和1黃色系中花種質(zhì)組成；第Ⅲ類群由2個花瓣暗紅色、唇瓣黃喉的單株組成；第Ⅳ類群由4個黃色系種質(zhì)組成；第Ⅴ類群由3個粉紅色系種質(zhì)組成。

當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.78時：第Ⅰ類群種質(zhì)可分為4個亞類，第1亞類為品種‘金龍爪’，花朵深黃色，葉片爪藝；第2亞類由‘立葉大鳳’、‘綠翡翠’、‘玉鳳’和‘黃金龍’等4個種質(zhì)組成，黃色素花，微香；‘韓國桃花’單獨為第3亞類，花瓣銅紅色帶暗紅斑紋；第4亞類由來源于同一親本的品種‘華韻丹霞’和‘華韻紅霞’組成，花瓣紅色帶胭脂紅斑。第Ⅱ類群種質(zhì)可分為3個亞類，第1亞類包括‘爪藝韓國小姐’、‘韓國小姐’、‘紫元素’和‘西施’等4個紅花系品種；第2亞類由‘醉美人’和‘金玉滿堂’組成，橘紅或橙紅花瓣帶胭脂紅斑紋；第3亞類為‘黃金美人’，金黃色素花，花大，香氣濃。第Ⅳ類群可分為3個亞類，第1亞類為品種‘十八格格’，青黃色花瓣，白色唇瓣帶淡粉色虎斑；第2亞類由‘夏日香水’和‘東方快車’組成，花瓣青黃或米黃色，唇瓣帶深紅斑塊，秋季花；第3亞類為‘黃金小神童’，金黃色素花，濃香。第Ⅴ類群‘臺北小姐’與‘櫻花’花型、葉型完全不同，為什么會聚為一類，還有待進一步確認。

3 討論與結(jié)論

雜交蘭已成為消費市場的新寵，具有很高的觀賞和經(jīng)濟價值。掌握種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可以減少新品種選育中親本選配的盲目性，提高育種效率；同時也可以對一些‘同物異名’或‘同名異物’的品種進行準(zhǔn)確鑒定。因此，開展雜交蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析具有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

SRAP分子標(biāo)記主要針對基因的開放閱讀框(ORF)進行擴增，因物種以及個體不同，內(nèi)含子、啟動子與間隔長度不等而產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，不但集中了RAPD、SSR、AFLP 等常用分子標(biāo)記的優(yōu)點，還彌補了這些標(biāo)記各自的缺點，已在多種植物上廣泛應(yīng)用[27-29]。應(yīng)用DNA 分子標(biāo)記研究蘭屬植物遺傳多樣性的文獻也顯示了SRAP 標(biāo)記的多態(tài)率高且穩(wěn)定[5-9,30]。本研究利用SRAP 標(biāo)記對24份雜交蘭種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示11對多態(tài)性引物共擴增出DNA條帶119條，其中多態(tài)性條帶102 條，多態(tài)性百分率達86.1%，說明SRAP 標(biāo)記在國蘭雜交蘭的遺傳多樣性研究中有較高的檢出率。種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.43～0.98，表明種質(zhì)間具有豐富的遺傳多樣性。

SRAP 標(biāo)記的UPGMA 聚類分析結(jié)果表明，供試的24份種質(zhì)可以較為清楚地區(qū)分開來。在遺傳相似系數(shù)0.78時，種質(zhì)間的親緣關(guān)系與來源、花色、花型等有一定的相關(guān)性。如第Ⅰ類群第2亞類的‘立葉大鳳’、‘綠翡翠’、‘玉鳳’和‘黃金龍’均為小黃花素心品種，‘玉鳳’是從‘綠翡翠’群體中的變異單株選育而來；第Ⅰ類群第4亞類的‘華韻丹霞’和‘華韻紅霞’是同一父母本的姐妹品系。第Ⅱ類群第1亞類的‘韓國小姐’、‘紫元素’和‘西施’等3個紅色系品種來源于韓國，而‘爪藝韓國小姐’是‘韓國小姐’的葉片突變品系。第Ⅲ類群的‘紅美人’和‘K33a紅美人’是來源于不同的母株組培快繁獲得的2個群體，DNA水平上存在的遺傳差異可能與植株的抽芽及開花性相關(guān)。同一個國家或地區(qū)的不同品種因親本重復(fù)利用、種間雜交，基因交換頻繁，品種遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，品種間遺傳相似性相對較高。聚類結(jié)果中也有不同來源地或不同花色、花型等類型的品種聚在一起，如第Ⅴ類群的‘臺北小姐’與‘櫻花’來源地不同，在花型、葉型等形態(tài)上也完全不同，這有待于今后研究中進行更多的驗證。

對雜交蘭品種間親緣關(guān)系的SRAP 多態(tài)性分析還未見報道，關(guān)于其結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性還需要進一步結(jié)合形態(tài)評價、增加樣本量深入的研究。從本研究的結(jié)果來看，效果較好，可將SRAP分子標(biāo)記技術(shù)運用到雜交蘭種質(zhì)遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定等，為雜交蘭品種改良、分類命名及雜種后代鑒定等提供依據(jù)。

[1]朱根發(fā). 國際蘭屬植物雜交育種進展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，(4)： 25-27.

[2]陸然. 雜交蘭：生產(chǎn)漸成規(guī)模 產(chǎn)銷優(yōu)勢明顯[J]. 中國花卉園藝，2013，(1)：23-24.

[3]LI G,QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP), a newmarker system based on a simple PCR reaction:Itsapplication to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor ApplGenet,2011,103(2):455-461.

[4]鐘淮欽，鐘海豐，林兵，等. 中小花型蝴蝶蘭種質(zhì)遺傳多樣性的形態(tài)與SRAP分析[J]. 分子植物育種，2013，11(1)：119-125.

[5]牛田，張林，王厚新，等. 利用SRAP 標(biāo)記分析春蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2014，4(8)：53-58.

[6]蹇黎，朱利泉. 寒蘭品種類型的SRAP 分子鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010，43(15)：3184-3190.

[7]唐源江，曹雯靜，吳坤林. 基于SRAP 標(biāo)記的國蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(9)：1795-1806.

[8]蔣彧，何俊蓉，劉菲，等. 中國蘭遺傳多樣性的SRAP 分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，26(4)：1645-1648.

[9]馬紅勃，賴鋆英，許旭明，等. 基于SRAP 標(biāo)記的大花蕙蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2011，12(4)：551-556.

[10]周艷霞，尹俊梅，任羽，等. 文心蘭種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP 分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29(7)：43-46.

[11]徐進，張西西，董愛香. 部分矮牽牛品種親緣關(guān)系的SRAP 分析[J]. 園藝學(xué)報，2008，35(12)：1837-1842.

[12]趙秀娟，宋建文，胡開林. 苦瓜種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP 標(biāo)記分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2013，14(1)：78-84.

[13]馬二磊，王燕，劉莉，等. 松花型花椰菜主要品種鑒定的分子標(biāo)記分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2010，11(5)：621-624.

[14]徐愛遐，馬朝芝，肖恩時，等. 中國西部芥菜型油菜遺傳多樣性研究[J]. 作物學(xué)報，2008， 34(5)：754-763.

[15]昝逢剛，吳轉(zhuǎn)娣，曾淇. 荔枝種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP 分析[J]. 分子植物育種， 2009，7(3)：562-568.

[16]林忠旭，張獻龍，聶以春. 新型標(biāo)記SRAP 在棉花F2分離群體及遺傳多樣性評價中的適用性分析[J]. 遺傳學(xué)報，2004，31(6)：622-626.

[17]劉倩，戴志剛，陳基權(quán)，等. 應(yīng)用SRAP 分子標(biāo)記構(gòu)建紅麻種質(zhì)資源分子身份證[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46(10)：1974-1983.

[18]陳瑤瑤，張燕，張琛，等. 雜交蘭‘韓國桃花’×蕙蘭種間雜交種子無菌萌發(fā)特征研究[J]. 園藝學(xué)報，2009，36(3)：441-446.

[19]曾碧玉，常強，許傳俊. 雜交蘭品種‘韓國小姐’與墨蘭品種‘企劍黑墨’雜交坐果及無菌播種研究[J]. 熱帶作物學(xué)報，2015，36(3)：510-515.

[20]左利娟，李志強，鄭志勇，等. 雜交蘭根狀莖的增殖與分化成苗技術(shù)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(6)：54-55.

[21]謝利，馬曉娟，郭和蓉，等. 雜交蘭類原球莖增殖中芽分化的控制和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)報，2014，50(2)：209-213.

[22]孫瑤，趙?？?，陳一. 肥料處理對雜交蘭醉美人一年生苗生長的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56(10)：1631-1632.

[23]王園園，尹翠翠，王廣東. 高溫脅迫對二倍體和四倍體雜交蘭相關(guān)生理生化特征的影響[J]. 西北植物學(xué)報，2013，33(4)：735-740.

[24]謝佩吾，李早文，伍愛萍，等. 17個雜交蘭及3個大花蕙蘭品種的染色體研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，(8)：26-28.

[25]李永明，趙玉琪. 實用分子生物學(xué)方法手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：173-178.

[26]BUDAK H, SHEARMAN R C, PARMAKSIZ I, et al. Molecular characterization of buffalograss germplasmusing sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Theoreticaland Applied Genetics, 2004, 108(5): 328-334.

[27]趙洋，楊陽，曾貞，等. SRAP標(biāo)記在茶樹育種上的應(yīng)用前景[J]. 貴州茶葉，2007，34(2)：11-13.

[28]張彤，屈淑平，崔崇士. SRAP 標(biāo)記在蔬菜作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40(1)：119-122.

[29]孫佳琦，梁建國，石少川，等. SRAP 標(biāo)記在觀賞植物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2010，8(3)577-588.

[30]蹇黎. ISSR 和SRAP 標(biāo)記技術(shù)在蘭花植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J]. 北方園藝，2011，(23)：191-192.

(責(zé)任編輯：黃愛萍)

SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids

ZHONG Huai-qin1,2,3，LIN Rong-yan1,2,3，HUANG Min-ling1,2,3*，LIN Bing1,2,3，Chen Nan-chuan4

(I.InstituteofCropSciences,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FlowersResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou,Fujian350013,China;3.FujianEngineeringResearchCenterforCharacteristicFloriculture,Fuzhou,Fujian350013,China;

4.FujianBainongEcologicalTechnologyLimitedCompany,Zhaoan,Fujian363500,China)

SRAP was applied for the determination of the genetic diversity of 24 hybrid cultivars ofCymbidium. Eleven polymorphic primer combinations were screened to result in 119 amplified DNA bands. Of the amplified DNA, 102 were polymorphic, at a ratio of 86.1%. The average number of polymorphic loci amplified by each primer was 9.3. The genetic similarity among the 24 germplasms ranged from 0.43 to 0.98, averaging 0.67. The UPGMA cluster analysis classified the germplasms with a similarity coefficient of 0.69 into 5 groups clearly showing the genetic diversity and relationship among the hybrids.

Cymbidiumhybrid; SRAP; genetic diversity; cluster analysis

2016-05-26初稿；2016-07-30修改稿

鐘淮欽(1979-)，男，副研究員，主要從事觀賞植物種質(zhì)資源評價與創(chuàng)新利用研究(E-mail:zhqeeast@163.com) *通訊作者：黃敏玲(1960-)，女，研究員，主要從事花卉品種選育與生物技術(shù)研究(E-mail：huangm1618@163.corn)

福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項 (2014R1025-5)；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊PI項目(2016PI-39)；福建省科技計劃項目——星火計劃重點項目 (2014S0014)

S 68

：A

：1008-0384(2016)11-1193-05

鐘淮欽，林榕燕，黃敏玲，等.雜交蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(11)：1193-1197.

ZHONG H-Q，LIN R-Y，HUANG M-L，et al.SRAP-marker Based Genetic Diversity of Germplasms ofCymbidiumHybrids[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1193-1197.