李永平，林 琿，康建坂,溫慶放*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013)

辣椒EST-SSR 標記的開發(fā)與驗證

李永平1，2，林 琿1，2，康建坂1，2,溫慶放1，2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福建 福州 350013)

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載118 900條辣椒相關(guān)EST，對其進行SSR位點搜索，共搜索出3 343條SSR，分布密度為1/17.20 kb，共有287種重復(fù)基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476個SSR)和六核苷酸(1 128個SSR)占主導(dǎo)地位，所占比例分別為44.15%和33.74%；出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是GA/TC，占總數(shù)的14.30%，其次為CT/AG(94 個，占8.11%)。針對3 343條含有SSR的EST 設(shè)計合成了200對引物。用17份辣椒種質(zhì)對200對引物進行篩選，196對引物有擴增產(chǎn)物，71對引物表現(xiàn)出多態(tài)性，共有220個多態(tài)性位點。利用71對多態(tài)性引物，對特定親本P181-2-6和P230-2-5及其雜種一代F1的親緣關(guān)系進行檢測，結(jié)果說明從辣椒相關(guān)EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)的SSR引物有較好的可用性。

辣椒；EST-SSR；標記開發(fā)；指紋圖譜

簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)標記技術(shù)因多態(tài)性高、靈敏度高、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、分析簡便、共顯性和特異性等特點[1]，自1989年建立以來，已被廣泛用于遺傳圖譜繪制[2]、重要農(nóng)藝性狀的基因定位[3-4]、生物遺傳多樣性[5]、品種鑒定[6]等諸多方面。

近年來，測序技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，各種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)迅速增加。EST-SSR 因來自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)與功能基因有緊密的連鎖，且在物種間有較高的通用性，其開發(fā)與應(yīng)用已在小麥[7]、棉花[8]、大豆[9]、花生[10]等大田作物中均有報道，EST-SSR標記在一些主要蔬菜作物中也有一定的開發(fā)與應(yīng)用，如番茄[11]、黃瓜[12]、油菜[13]、大白菜[14]、甘藍[15]和蘿卜[16]。辣椒的EST-SSR標記也有研究，但已公開報道可利用的SSR標記僅有500多個[17-23]，開發(fā)標記數(shù)量明顯偏少，遠不能滿足辣椒分子育種研究的需要。本研究利用NCBI公共數(shù)據(jù)庫公開報道的近12萬條辣椒相關(guān)EST，開發(fā)EST-SSR 標記并分析其多態(tài)性，為辣椒的種質(zhì)資源分析、指紋圖譜、遺傳作圖和分子標記輔助育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和模板DNA 的提取

以17份辣椒種質(zhì)、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5兩份辣椒自交系及其雜交后代F1(表1)為引物篩選材料，檢測引物的擴增與多態(tài)性。所有試驗材料均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心所提供，于2015年春季種植于本所試驗田，在定植緩苗后苗期取幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。

1.2 辣椒EST 來源、EST-SSR 的發(fā)掘及分析

辣椒相關(guān)EST 來自NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)，共計118 900條(截至2015年8月)。利用SSRHumter分析軟件對下載的EST序列進行SSR搜索。SSR篩選標準為：二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為9、7、5、4、3次以上，所有重復(fù)類型的總核苷酸數(shù)不能少于18個。

EST-SSR的出現(xiàn)頻率(%)=(檢出的SSR個數(shù)/EST 總數(shù))×100%；EST-SSR平均分布距離 = EST 總長度/SSR個數(shù)。優(yōu)勢基元中SSR出現(xiàn)頻率(%)=(優(yōu)勢重復(fù)基元SSR數(shù)量/優(yōu)勢重復(fù)基元SSR總數(shù)量)×100%。

1.3 EST-SSR的引物設(shè)計與合成

利用primer premier 5.0軟件對含有SSR的EST設(shè)計引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物設(shè)計的主要參數(shù)：引物長度控制在15～30 bp，預(yù)期產(chǎn)物長度控制在150～350 bp；引物3′端不出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，引物的3′端避免使用堿基A；引物序列的GC含量選擇在40%～60%；Tm值50～60℃；引物分值90以上。選擇以不同主導(dǎo)重復(fù)基元類型設(shè)計的EST-SSR引物200對，由福州博尚生物技術(shù)有限合成。

1.4 引物有效性檢測

利用17 份辣椒種質(zhì)、早熟牛角椒P181-2-6和抗TY的P230-2-5兩份辣椒自交系及其雜交后代F1 對設(shè)計的引物進行檢驗。PCR反應(yīng)體系為20 μL，50 ng模板DNA，0.3 μmol·L-1引物，0.5 mmol·L-1dNTP，1.0 UTaqDNA聚合酶，2.0 mmol·L-1MgCl2，2.0 μL10×PCR緩沖液，加入滅菌的超純水至20 μL。所用試劑均購自上海生工生物工程有限公司。PCR 擴增反應(yīng)條件是：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性45 s，50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min，40 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用20 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，90 V穩(wěn)壓電泳1 h，EB染色，在UVP公司的GDS8000凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。為保證數(shù)據(jù)準確、可靠，每塊膠板均由2人獨立記錄，然后比對，有爭議的數(shù)據(jù)作缺失處理。

表1 17 份辣椒種質(zhì)及特定親本和后代Table 1 Seventeen typical C. annuum germplasms and specific parents and F1 hybrids

1.5 種質(zhì)親緣關(guān)系分析

基于17份辣椒種質(zhì)DNA 擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，有帶擴增記為1，無帶記為0，利用NTSYSpc2.0對統(tǒng)計結(jié)果進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒EST-SSR信息分析

2.1.1 辣椒EST的基本信息及EST-SSR 頻率和密度 從NCBI下載118 900 條辣椒EST，經(jīng)搜索共挖掘到3 343 個SSR，發(fā)生頻率2.82%，平均分布距離為17.2 kb。結(jié)果(表2)表明，辣椒具有豐富的EST-SSR 類型，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)類型都有出現(xiàn)，但不同核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)的頻率相差較多。核苷酸重復(fù)類型以二核苷酸重復(fù)與六核苷酸重復(fù)為主，二者占總SSR 比例的77.89%，其中二核苷酸重復(fù)中的SSR 數(shù)量最多，占總SSR比例的44.15%，其次是六核苷酸重復(fù)重復(fù)較多，比例為33.74%。

搜索共觀察到287種重復(fù)基元，六核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)最多的重復(fù)基元達182 種，占基元種數(shù)的63.41%。二核苷酸10 種，三核苷酸36 種，四核苷酸22 種，五核苷酸37 種。

辣椒EST中平均每17.2 kb 出現(xiàn)一個SSR，不同重復(fù)類型的SSR覆蓋的平均距離差異較大，SSR數(shù)越多其覆蓋的平均距離越小(表2)。

表2 辣椒 EST 中SSR 出現(xiàn)頻率Table 2 Occurrence of SSRs in ESTs of C. annuum

2.1.2 辣椒EST-SSR 重復(fù)基元類型和比例 各種不同重復(fù)基元中出現(xiàn)最多的是二核苷酸重復(fù)類型GA/TC，占總SSR 的比例為18.37%，其次是AG/CT，比例為12.83%。二核苷酸中，以GA/TC重復(fù)基元占優(yōu)，占41.60%，GA/TC、AG/CT、AT/TA三者占93.03%，但CG/GC 重復(fù)基元沒有出現(xiàn)；三核苷酸中，各重復(fù)基元分布較為均衡；四核苷酸中，以TAAT/ATTA重復(fù)基元為主，占36.08%；五核苷酸中，重復(fù)基元主要為ATATA/TATAT，比例為49.69%；六核苷酸中，以TCATGG/CCATGA重復(fù)基元類型為主，占比例10.28%。

2.1.3 辣椒EST-SSR重復(fù)基元長度 辣椒辣椒EST-SSR二至六核苷酸平均基元長度變化范圍差異很大，二核苷酸的長度變化范圍最大，為18～152 bp，五核苷酸長度范圍最小為20～30 bp；從平均長度看，二核苷酸最長達43.82 bp，其次是三核苷酸25.09 bp、四核苷酸21.86 bp、五核苷酸的20.57 bp、六核苷酸18.10 bp(表4)。

2.2 辣椒EST-SSRs 引物有效性驗證

2.2.1 EST-SSRs 標記在17份辣椒種質(zhì)中的多態(tài)性 選擇了不同重復(fù)類型和重復(fù)次數(shù)的EST-SSRs 設(shè)計合成了一批引物。其中具二苷酸重復(fù)的引物50 對，三核苷酸重復(fù)引物49對，四核苷酸重復(fù)引物10 對，五核苷酸重復(fù)引物11 對，六核苷酸重復(fù)引物80對并以17 份辣椒種質(zhì)的基因組DNA為模板對合成的200 對引物進行有效性檢驗，能清晰擴增產(chǎn)物的引物有196 對，擴增有效率為98.00%；其中71 對EST-SSR引物具有多態(tài)性，共擴增出220 個多態(tài)性位點，平均每個引物產(chǎn)生3.1 個多態(tài)性位點。由表5可以初步看出，不同核苷酸重復(fù)引物的擴增有效率和多態(tài)性比例不同，以二核苷酸重復(fù)開發(fā)出的引物，多態(tài)性比例最高，為46.00%，而基于五核苷酸重復(fù)開發(fā)的引物多態(tài)性比例最低為9.10%。在基元重復(fù)數(shù)量最多(表3)的二核苷酸、六核苷酸開發(fā)引物的效率較高。

表3 辣椒EST-SSR優(yōu)勢基元重復(fù)類型Table 3 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表4 辣椒EST-SSR 基元重復(fù)長度Table 4 Predominant types of SSR motifs in ESTs of C.annuum

表5 不同核苷酸重復(fù)引物的擴增有效率和多態(tài)性比例Table 5 Proportions of effective and polymorphic primers for different types of motifs

在17份辣椒種質(zhì)擴增中不同引物擴增出的多態(tài)性位點數(shù)量不同。部分引物對17份辣椒種質(zhì)基因組DNA的擴增，顯示較豐富多態(tài)性(圖1、2)。

2.2.2 EST-SSRs標記在特定材料中的共顯性 用具有多態(tài)性的71 對引物，對親本P181-2-6 和P230-2-5 及其雜種一代F1 的基因組DNA進行擴增，在這一特定親本間仍具有多態(tài)性的引物43 對，其中在親本及其F1 中呈共顯性的標記共有27 對(圖3-A)，顯偏母型的有9 對(圖3-B)，偏父型的有7 對(圖3-C)。從多態(tài)性和顯性、共顯性來看，基于EST序列開發(fā)辣椒SSR引物是可行和有效的，這些標記可用于辣椒遺傳多樣性分析、指紋圖譜、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及分子標記輔助育種等方面。

2.3 EST-SSR 標記在辣椒種質(zhì)遺傳關(guān)系分析中的應(yīng)用

以71 對多態(tài)性引物對17 份辣椒種質(zhì)進行聚類分類(圖4)，在相似系數(shù)0.64 處可將其分為5大類。PA001、PA002、PA003、PA004聚為一類，均為黃椒類型，PA006、PA010、PA014、PA013、 PA015、PA011、PA016、PA017、PA012均為牛角椒類型，PA009為羊角椒，PA005、PA008為朝天椒，PA007為野生椒。結(jié)果表明開發(fā)的EST-SSR標記能很好地將辣椒親緣關(guān)系鑒別出來。

3 討 論

本研究基于從NCBI數(shù)據(jù)庫下載的118 900條辣椒EST，進行SSR位點搜索，共得到3 343 條SSR，發(fā)生頻率2.82%，分布密度為1/17.20 kb，包括287 種重復(fù)基元。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸(1 476 個SSR)和六核苷酸(1 128 個SSR)占主導(dǎo)地位，所占比例分別為44.15%和33.74%；出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是GA/TC，占總數(shù)的 14.30%，其次為CT/AG(94 個，占8.11%)。支莉等[23]2010年從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得116 952條辣椒ESTs序列，發(fā)現(xiàn)1 736個微衛(wèi)星，EST-SSRs序列出現(xiàn)頻率為1.92%。在辣椒EST-SSRs中，二核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最高，占總SSR的56.4%，其次是三核苷酸重復(fù)類型，占總SSR的23.3%。共檢測到149種基序重復(fù)類型，重復(fù)基序出現(xiàn)頻率最高的為GA/TC，AG/CT次之。吳智明等[24]2012年通過對數(shù)據(jù)庫中32 295 條非冗余的辣椒EST序列進行搜索，發(fā)現(xiàn)3 396 個SSR位點，EST-SSR頻率為10.52%，平均分布距離為4.46 kb。在辣椒EST-SSR中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元占主導(dǎo)地位，分別占總SSR的43.02% 和37.84%。優(yōu)勢重復(fù)基元為GA/TC、AG/CT和AT，分別占15.99%、11.98%和l1.37%。不同研究者研究的結(jié)果不盡相同，可能搜索軟件、搜索的核苷酸重復(fù)類型的長度標準設(shè)定不同有關(guān)。現(xiàn)行的SSR搜索標準中有12、15、18 bp 3 種重復(fù)基元總長度。不同的研究者采用不同的搜索標準，導(dǎo)致結(jié)果不同。根據(jù)Schl?tterer等[25]的研究，SSR的變異頻率與基元重復(fù)數(shù)呈正相關(guān)，即重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)越多則SSR的多態(tài)性潛能越大。在本研究中采用了18 bp的標準進行SSR位點的篩選。目前EST-SSR位點搜索軟件如SSRIT、SSRhunt、MIAS、SSRfinder等，本研究用SSRhunt軟件，能準確得到EST序列中總SSR位點和重復(fù)基元的數(shù)量，重復(fù)次數(shù)及位點位置，為進一步了解辣椒EST-SSR位點信息和以后的引物設(shè)計提供了方便。

本研究中六核苷酸重復(fù)1 128 個SSR，占33.74%，以 TCATGG/CCATGA、ACGAGA/TGCTCT和CTGCTC/GAGCAG 3種重復(fù)基元為主，占六核苷酸重復(fù)基元總比例的24.03%。與前人的研究結(jié)果不同。在大多作物中，六核苷酸重復(fù)基元類型均不常見，僅在甘薯[26]、玉米[27]和蘿卜[16]中見到報道，這些可能與物種本身的基因組或轉(zhuǎn)錄組序列差異性有關(guān)。從設(shè)計合成了引物的多態(tài)性來看，基于六核苷酸重復(fù)基元設(shè)計的引物多態(tài)性達 33.75%，有較高的開發(fā)價值。

雖然一般認為，由于基因編碼序列的保守性等原因?qū)е?EST-SSR 揭示種間多態(tài)性低于源于基因組的 SSR 標記。但是，17 份辣椒種質(zhì)對開發(fā)引物鑒定結(jié)果，多態(tài)性達35.5%，在特定組合中的共顯性標記比例為62.79%。本研究基于辣椒EST-SSR信息分析和標記開發(fā)是有效可行的，可用于辣椒遺傳多樣性分析、指紋圖譜、遺傳圖譜構(gòu)建等。

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(責(zé)任編輯：柯文輝)

Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.

LI Yong-ping1,2，LIN Hui1，2，KANG Jian-ban1,2，WEN Qing-fang1,2*

(1.VegetableResearchCenter，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China；2.CropsResearchInstitute，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian350013，China)

A total of 118,900 ESTs inCapsicumannuumL were downloaded from NCBI for identifying and developing an SSR marker. As a result, 3,343 SSRs in the ESTs with an average of one SSR per 17.20 kb were found, including 283 SSR motifs. Analysis on the SSR motifs revealed that they were mostly di-nucleotides (1,476 SSR) and hexa-nucleotides (1,128 SSR), accounting for 44.15% and 33.74% of the total, respectively. GA/TC was the most frequently found motifs (14.30% of all), which was followed by CT/AG (94 SSR, and 8.11% of all). From the 3,343 SSR-containing ESTs, 200 primer pairs were designed and validated for amplification using 17 pepper inbred lines. The results showed that 71 primer pairs yielded 220 amplification bands. Using those 71 pairs of polymorphic primers, the genetic relationship between the parents, P181-2-6 and P230-2-5, and their F1 hybrid was determined. It appeared that the SSR markers identified from the ESTs ofC.annuumwere potentially of practical applicatios.

CapsicumannuumL.; EST-SSR; marker development; fingerprinting

2016-07-11初稿；2016-09-23修改稿

李永平(1974-)，女，副研究員，研究方向：蔬菜分子育種(E-mail：248937256@qq.com) *通訊作者：溫慶放(1965-)，男，研究員，研究方向：蔬菜育種(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省自然科學(xué)基金項目(2014J01115)；福建省科技計劃重大專項(2013NZ0002-3)

S 641.3

：A

：1008-0384(2016)11-1187-06

李永平，林琿，康建坂，等.辣椒EST-SSR 標記的開發(fā)與驗證[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(11)：1187-1192.

LI Y-P，LIN H，KANG J-B，et al.Development and Utility of EST-SSR Marker inCapsicumannuumL.[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1187-1192.