張杰偉，丁莉萍，陳亞娟，王宏芝*，魏建華*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；2.農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

楊樹磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族鑒定與分析

張杰偉1，2，丁莉萍1，2，陳亞娟1，2，王宏芝1，2*，魏建華1，2*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100097；2.農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097)

為了對已測序楊樹PopulustrichocarpaTorr.& Gray中磷酸肌醇特異性磷脂酶C (phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)家族基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，利用楊樹基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)手段，鑒定楊樹PI-PLC 家族基因的基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和編碼蛋白，通過蛋白序列比對進(jìn)行進(jìn)化和分類分析。結(jié)果表明，楊樹中含有7 個PI-PLC 家族基因，含有8～10個外顯子，分布于楊樹的4 條染色體上。MEME和Pfam保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，楊樹PI-PLC 蛋白均含有4個保守的EF、X、Y和C2結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明PI-PLC 可分為2 個亞家族。

磷酸肌醇特異性磷脂酶C; 楊樹; 進(jìn)化分析; 基因家族

磷酸肌醇特異性磷脂酶C(phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)是一類水解磷脂的酶類，其水解4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和1,2-二酰甘油(DAG)[1]。植物細(xì)胞中，水溶性IP3進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后在一系列磷酸激酶的作用下可以迅速轉(zhuǎn)化為IP6, 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫中Ca2+內(nèi)流，從而調(diào)節(jié)Ca2+濃度及Ca2+依賴的酶類或Ca2+依賴的通道[2]；而脂溶性DAG停留在細(xì)胞膜上，在二酰甘油激酶的作用下生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)，PA通過與一些蛋白激酶、脂激酶和NADPH氧化酶等蛋白相互作用, 從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長、非生物脅迫和細(xì)胞死亡等生理過程[3]。

高等植物中，擬南芥PI-PLC(AtPLC)的生物功能解析較為完整。擬南芥PI-PLC家族共有9個成員。其中AtPLC1(曾用名AtPLC1S)參與不依賴ABA的高滲脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]；AtPLC2參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應(yīng)和生長素調(diào)節(jié)的生長發(fā)育[5-6]；AtPLC3和AtPLC9在耐熱性方面起著重要作用[7-8]，過量表達(dá)AtPLC5引起擬南芥和煙草葉片早衰[9]。

2006 年楊樹基因組草圖測序完成[10]，為后續(xù)通過生物信息學(xué)挖掘、鑒定和分析楊樹基因組奠定了相關(guān)基礎(chǔ)。本研究從楊樹基因組數(shù)據(jù)庫出發(fā)，重點分析楊樹PI-PLC家族基因進(jìn)化關(guān)系及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，為克隆楊樹PI-PLC基因(PtPLC)提供有價值的信息，以期為進(jìn)一步研究PtPLC基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 楊樹PI-PLC家族基因全基因組、cDNA和蛋白序列的獲得

擬南芥PI-PLC基因及蛋白序列下載自TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)，楊樹PI-PLC基因及蛋白序列均下載自JGI數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa)。

1.2 PI-PLC家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)

通過Clustal X(2.0)[11]軟件對擬南芥和楊樹的PI-PLC蛋白進(jìn)行多序列比對分析，將序列比對結(jié)果使用MEGA 6.0[12]軟件，采用Neighborjoining法(Bootstrap值設(shè)為1000)生成PI-PLC家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。應(yīng)用在線軟件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)和Pfam 數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/search)對擬南芥和楊樹的PI-PLC蛋白保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹PI-PLC 家族基因的鑒定和命名

根據(jù)擬南芥中已經(jīng)鑒別出來的9個PI-PLC蛋白序列，分別利用phytozome 數(shù)據(jù)庫(http://www.phytozome.net/search.php)提供的Blast 程序中進(jìn)行BlastP，得到了21個楊樹候選PI-PLC基因。利用保守域在線預(yù)測軟件Pfam 和MEME進(jìn)行驗證EF、X、Y和C2保守域的存在，初步確定了7個楊樹PI-PLC基因。其中楊樹PI-PLC 基因分布在第1、8、9和10等4條染色體上，根據(jù)其在染色體上的定位分別命名為PtPLC1-7，每個成員的基因長度、氨基酸長度、染色體定位、外顯子個數(shù)等詳細(xì)信息見表1。楊樹PtPLC基因均含有8～10個外顯子(圖1)。

表1 楊樹PI-PLC家族基因的基本特征Table 1 Characteristics of PI-PLC genes of poplar

2.2 楊樹PI-PLC 家族蛋白相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

擬南芥AtPLC1～7含有561～584個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為64～67 kD，擬南芥AtPLC8和AtPLC9 均含有530個氨基酸殘基，預(yù)測分子量均為61 kD，而楊樹PtPLC1～7含有582～614個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為66～69 kD。利用進(jìn)化樹分析軟件MEGA 6.0 對9個擬南芥和7個楊樹PI-PLC蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：這16個PI-PLC分為2個亞家族(按照催化結(jié)構(gòu)域(X和Y結(jié)構(gòu)域)的完成性)，分別含有14和2個成員(圖2)。第Ⅰ亞家族(具有完整催化結(jié)構(gòu)域)由擬南芥AtPLC1～7和楊樹PtPLC1～7組成，第Ⅱ亞家族(不具有完整催化結(jié)構(gòu)域)由擬南芥AtPLC8和AtPLC9 組成。7個楊樹PI-PLC蛋白的氨基酸序列相似性在51.67%～92.67%，其中PtPLC3 和PtPLC7氨基酸序列的相似性高達(dá)92.67%(表2)。

表2 楊樹基因組中PI-PLC 蛋白氨基酸相似性分析Table 2 Amino acid seque nce similarity analysis of the OtPLC proteins

2.3 楊樹PI-PLC 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

使用在線軟件MEME和Pfam 對PtPLC 基因家族保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明：擬南芥和楊樹PI-PLC 基因家族均包含4個保守結(jié)構(gòu)域。其中，元件1是EF結(jié)構(gòu)域，2(X) 和3 (Y)組成PI-PLC催化結(jié)構(gòu)域，元件4是C2結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，楊樹PtPLC1～7和擬南芥AtPLC1～7均聚類到第Ⅰ亞家族、擬南芥AtPLC8和AtPLC9聚類到第Ⅱ亞家族(圖2)。他們均含有EF、X、Y、C2等4個結(jié)構(gòu)域，這表明PI-PLC蛋白在進(jìn)化過程中含有相似的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。

表3 楊樹PtPLC1、4、6和7不同轉(zhuǎn)錄本的基本特征Table 3 Characteristics of PtPLC1, 4, 6, and 7 genes

3 討論與結(jié)論

PI-PLC是磷酸肌醇信號途徑中的一個關(guān)鍵酶，在許多植物中已經(jīng)被證明參與非生物脅迫、調(diào)節(jié)骨架系統(tǒng)、C4作物的呼吸作用等多個生理過程[1,5-9,15-18]。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PI-PLC基因家族已經(jīng)在擬南芥、水稻等多種高等植物中鑒定[19]，但楊樹PI-PLC基因家族尚未鑒定。本研究鑒定已測序的楊樹PI-PLC基因家族含有7個成員，而已鑒定的擬南芥和水稻PI-PLC基因家族分別含有9個和4個成員，這說明在進(jìn)化過程中，PI-PLC基因可能經(jīng)歷了不斷發(fā)生譜系的特異擴(kuò)張和拷貝丟失。楊樹PI-PLC基因家族的7個成員含有8～10個外顯子，均含有EF、X、Y和C2結(jié)構(gòu)域，這表明PI-PLC基因家族的高度保守性。研究表明，雖然擬南芥AtPLC8和At PLC9 的Y 結(jié)構(gòu)域缺失了一部分片段，但是擬南芥plc9 突變體較野生型植株對熱脅迫更加敏感，同時AtPLC9過量表達(dá)植株表現(xiàn)出比野生型植株對熱脅迫更加耐受[7]。推測這些酶所參與的磷脂信號在植物諸多生理過程中起著類似作用。而不同的物種中含有的成員數(shù)目不同，暗示不同物種的各成員在特定的組織響應(yīng)不同的外界刺激從而精細(xì)調(diào)節(jié)各生理過程。

進(jìn)化分析表明，已測序的楊樹PI-PLC基因家族中不含有第Ⅱ亞家族的成員，PtPLC1-7與擬南芥AtPLC1-7聚類于第Ⅰ亞家族。到目前為止，擬南芥AtPLC1-5、AtPLC9已經(jīng)被證明具有典型的PI-PLC生物學(xué)功能[7]。Hirayama等[20]從擬南芥中克隆到第一個PI-PLC基因AtPLC1，AtPLC1在正常條件下表達(dá)量很低，當(dāng)在干旱、鹽脅迫和低溫脅迫時表達(dá)量急劇升高。后續(xù)的研究證實AtPLC1響應(yīng)了ABA的次級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[21]。AtPLC3(曾用名AtPLC1F)不僅在開花期誘導(dǎo)表達(dá)，而且參與了植株的耐熱反應(yīng)[8]。推測PtPLC2和PtPLC5可能響應(yīng)干旱、高鹽、低溫等各種非生物脅迫以及參與到生長素調(diào)節(jié)的生長發(fā)育過程。AtPLC2參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應(yīng)和生長素調(diào)節(jié)的生長發(fā)育過程[5-6]。推測PtPLC4和PtPLC6可能在楊樹中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫和生長素調(diào)節(jié)的生長發(fā)育過程。截至目前，AtPLC6和AtPLC7的生物學(xué)功能還未見報道。推測PtPLC3、PtPLC4、PtPLC6和PtPLC7可能在特定時期木本植物中發(fā)揮重要功能。AtPLC5(曾用名AtPLC6)存在著典型的鈣依賴的PI-PLC酶活性，Northern結(jié)果顯示AtPLC5能夠在冷脅迫下被強(qiáng)烈誘導(dǎo)[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，AtPLC5超量表達(dá)后能都引起煙草和擬南芥的葉片早衰，同時在超量表達(dá)的AtPLC5轉(zhuǎn)基因植株中能檢測到PI-PLC酶活性[9]。與AtPLC5同源性最高的毛白楊PtoPLC1已經(jīng)證明具有PI-PLC酶活性，并且其響應(yīng)高鹽、ABA等各種非生物脅迫[23]。表明聚類在一起的不同物種的同源基因可能具有不同的生物學(xué)功能，因此不能簡單推測楊樹PtPLC基因家族各成員的生物學(xué)功能，其各成員的生物學(xué)功能還需要從楊樹中分離后逐一解析其功能。

楊樹PtPLC家族不同基因有不同的轉(zhuǎn)錄本個數(shù)，其中：PtPLC2、PtPLC3和PtPLC5均只有一個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本(表1)，PtPLC1、PtPLC4、PtPLC6和PtPLC7分別含有4、2、6和3個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本，每個預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本的長度、氨基酸長度、染色體定位、外顯子個數(shù)等詳細(xì)信息見表3。因為植物PI-PLC基因家族含有EF、X、Y和C2等4個保守的結(jié)構(gòu)域，故在轉(zhuǎn)錄本選擇上均選取最大表達(dá)框。在未來的研究中要從楊樹不同組織、不同發(fā)育階段以及在不同逆境脅迫中克隆不同的轉(zhuǎn)錄本，驗證是否存在其他預(yù)測PtPLC的轉(zhuǎn)錄本，并研究其生物學(xué)功能，以期完善對植物PI-PLC結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的認(rèn)識。

[1]RUPWATE S D,RAJASEKHARAN R.Plant phosphoinositide-specific phospholipase C: an insight [J]. Plant Signa Behav， 2012, 7 (10):1281-1283.

[2]MUNNIK T, TESTERINK C. Plant phospholipid signaling:“in a nutshell” [J]. Lipid Res，2009, 50(S1): S260-S265.

[3]WANG X, DEVAIAH S P, ZHANG W, et al. Signaling functions of phosphatidic acid [J]. Prog Lipid Res， 2006, 45 (3): 250-278.

[4]TAKAHASHI S, KATAGIRI T, HIRAYAMA T, et al. Hyperosmotic stress induces a rapid and transient increase in inositol 1, 4, 5-trisphosphate independent of abscisic acid inArabidopsiscell culture [J]. Plant Cell Physiol， 2001,42(2): 214-222.

[5]KANEHARA K, YU C Y, CHO Y, et al.ArabidopsisAtPLC2 is a primary phosphoinositide-specific phospholipase C in phosphoinositide metabolism and the endoplasmic reticulum stress response [J]. PLoS Genet， 2015,11(9): e1005511.

[6]LI L, HE Y, WANG Y, et al.ArabidopsisPLC2 is involved in auxin-modulated reproductive development [J]. Plant J， 2015, 84(3): 504-515.

[7]ZHENG S Z, LIU Y L, LI B, et al. Phosphoinositide-specific phospholipase C9 is involved in the thermotolerance inArabidopsis[J]. Plant J， 2012, 69(4): 689-700.

[8]GAO K, LIU Y L, LI B, et al.Arabidopsisthalianaphosphoinositide-specific phospholipase C isoform 3 (AtPLC3) and AtPLC9 have an additive effect on thermotolerance [J]. Plant Cell Physiol， 2014, 55(11): 1873-1883.

[9]ZHANG J, XIA K, YANG Y, et al. Overexpression ofArabidopsisphosphoinositide-specific phospholipase C5 induces leaf senescence [J]. Plant Cell Tiss Organ Cult， 2015, 120(2): 585-595.

[10]TUSKAN G A, DIFAZIO S, JANSSON S, et al. The genome of black cottonwood,Populustrichocarpa(Torr. & Gray) [J]. Science， 2006，313(5793): 1596-1604.

[11]LARKIN M A, BLACKSHIELDS G, BROWN N P, et al. Clustal W and clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 2007, 23(21): 2947-2948.

[12]TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Mol Biol Evol， 2013, 30(12): 2725-2729.

[13]BAILEY T L, BODEN M, BUSKE F A, et al. MEME SUITE: Tools for motif discovery and searching [J]. Nucleic Acids Res， 2009, 37(Web Server issue): W202-208.

[14]FINN R D, COGGILL P, EBERHARDT R Y, et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future [J]. Nucleic Acids Res， 2016, 44(Database issue): D279-D285.

[15]TRIPATHY M K, TYAGI W, GOSWAMI M, et al. Characterization and functional validation of tobacco PLCδ for abiotic stress tolerance [J]. Plant Mol Biol Rep， 2012,30(2): 488-497.

[16]WANG C R, YANG A F, YUE G D, et al. Enhanced expression of phospholipase C 1 (ZmPLC1) improves drought tolerance in transgenic maize [J]. Planta， 2008, 227(5): 1127-1140.

[17]PAOLO G D, CAMILLI P D. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics [J]. Nature， 2006, 443(7112): 651-657.

[18]COURSOL S, GIGLIOLI-GUIVARC'H N, VIDAL J, et al. An increase in phosphoinositide-specific phospholipase C activity precedes induction of C4 phosphoenolpyruvate carboxylase phosphorylation in illuminated and NH4Cl-treated protoplasts fromDigitariasanguinalis[J]. Plant J， 2000, 23(4): 497-506.

[19]SINGH A, KANWAR P, PANDEY A，et al. Comprehensive genomic analysis and expression profiling of phospholipase C gene family during abiotic stresses and development in rice [J]. PLoS ONE， 2013, 8 (4): e62494.

[20]HIRAYAMA T, OHTO C, MIZOGUCHI T, et al. A gene encoding a phosphatidylinositol-specific phospholipase C is induced by dehydration and salt stress inArabidopsisthaliana[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 92(1): 3903-3907.

[21]SANCHEZ J P, CHUA N H.ArabidopsisPLC1 is required for secondary responses to abscisic acid signals [J]. Plant Cell， 2001,13(5): 1143-1154.

[22]XU X, CAO Z, LIU G, et al. Cloning and expression of AtPLC6, a gene encoding a phosphatidylinositol-specificArabidopsisthaliana[J]. Chinese Sci Bull， 2004, 49(6): 567-573.

[23]ZHANG J, ZHANG Z, ZHU D, et al. Expression and initial characterization of a Phosphoinositide-specific phospholipase C fromPopulustomentosa[J]. J Plant Biochem Biotech， 2015, 24(3): 338-346.

(責(zé)任編輯：黃愛萍)

Genome-wide Analysis and Identification of Phosphoinositide-specific Phospholipase C Gene Family in Poplar (Populustrichocarpa)

ZHANG Jie-wei1，2, DING Li-ping1，2, CHEN Ya-juan1，2, WANG Hong-zhi1，2*, WEI Jian-hua1，2*

(1.BeijingAgro-BiotechnologyResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097,China;2.BeijingKeyLaboratoryofAgriculturalGeneticResourcesandBiotechnology,Beijing100097,China)

Phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) is a conserved key enzyme in phosphoinositide signaling for animals and plants. It plays an important role in growth and development, as well as various abiotic and biotic stresses in the organisms. Based upon the existing database and bioinformatics methodologies, PI-PLC family gene structures and their positions on chromosome and duplication for poplar (PopulustrichocarpaTorr.&Gray) (Pt) were obtained. PI-PLC proteins were classified according to their phylogenetic relationship. The results showed that 7 PtPLC genes existed in the poplar genome on 4 chromosomes. Their multiple alignments and motif displays indicated that all of the PtPLC proteins contained 4 conserved domains (i.e., EF, X, Y, and C2). Phylogenetic analysis on the PtPLC family classified them into two groups. The information would be the basis for a study on the functions of PtPI-PLC gene family.

PI-PLC;Populustrichocarpa; phylogeny analysis;gene family

2016-07-07初稿，2016-10-24修改稿

張杰偉(1982-)，男，博士，副研究員，研究方向：林木分子生物學(xué)(E-mail:jwzhang919@163.com) 共同第一作者：丁莉萍(1979-)，女，助理研究員，研究方向：林木分子生物學(xué)(E-mail:dingluo2011@126.com)； *通訊作者：王宏芝(1970-)，副研究員，研究方向：林木分子生物學(xué)(E-mail:wanghongzhi@baafs.net.cn)； 魏建華(1971-)，研究員，研究方向：林木分子生物學(xué)(E-mail:weijianhua@baafs.net.cn)

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(2013AA102702)；國家自然科學(xué)基金(31270593)；北京市自然科學(xué)基金(6163028)；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金(QNJJ201416)

Q 945.78; S 601

：A

：1008-0384(2016)11-1181-06

張杰偉，丁莉萍，陳亞娟，等.楊樹磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族鑒定與分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(11)：1181-1186.

ZHANG J-W，DING L-P，CHEN Y-J，et al.Genome-wide Analysis and Identification of Phosphoinositide-specific Phospholipase C Gene Family in Poplar (Populustrichocarpa)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1181-1186.