龔夢(mèng)鵑，巫圣乾，岳賀，王淑美，梁生旺，鄒忠杰#（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州510006）

基于血清和肝代謝組學(xué)研究護(hù)肝片的保肝作用Δ

龔夢(mèng)鵑1，2，3＊，巫圣乾1，2，3，岳賀1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3，鄒忠杰1，2，3#（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣州510006）

目的：從代謝通路角度闡明護(hù)肝片保肝作用的藥效及作用機(jī)制。方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、模型組（0.5%羧甲基纖維素鈉）和護(hù)肝片組（1.7 g/kg），每組12只，每天ig給藥1次，連續(xù)給藥9 d。末次給藥后1 h，模型組和護(hù)肝片組大鼠ip 50%四氯化碳（CCl4）花生油溶液1 mL/kg誘導(dǎo)肝損傷。造模24 h后，檢測(cè)大鼠肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平；利用核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)建立大鼠血清和肝代謝物譜，分析護(hù)肝片對(duì)CCl4致急性肝損傷大鼠血清和肝代謝輪廓變化和潛在生物標(biāo)志物的影響。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平顯著降低（P＜0.05）；大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝均發(fā)生了明顯的改變，11種血清代謝潛在生物標(biāo)志物和14種肝代謝潛在生物標(biāo)志物水平均顯著升高/降低（P＜0.05）。與模型組比較，護(hù)肝片組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05）。大鼠血清和肝代謝趨于正常，6種血清代謝潛在生物標(biāo)志物（異亮氨酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙酰乙酸、膽堿）和8種肝代謝潛在生物標(biāo)志物（3-羥基丁酸、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸、琥珀酸、膽堿、乳酸、葡萄糖）得到顯著回調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論：護(hù)肝片保肝的機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激及調(diào)控脂質(zhì)代謝、糖代謝和氨基酸代謝有關(guān)。

護(hù)肝片；急性肝損傷；代謝組學(xué)；核磁共振；潛在生物標(biāo)志物；大鼠

護(hù)肝片是保肝降酶的中成藥，臨床主要用于治療慢性肝炎及早期肝硬化，并可預(yù)防及治療脂肪肝、酒精肝、藥物性肝損傷等癥[1-2]，療效確切、顯著。其處方來源于東漢張仲景所著《傷寒論》中的小柴胡湯和茵陳蒿湯，由柴胡、五味子、茵陳、板藍(lán)根、豬膽粉、綠豆等6味藥材組成。藥理實(shí)驗(yàn)表明，護(hù)肝片有防治酒精性肝損傷、抗四氯化碳（CCl4）所致肝損傷、抗肝纖維化[3-5]等作用。

代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，是通過考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后（如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后）其代謝產(chǎn)物的變化或隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)[6]。代謝組學(xué)的研究通過對(duì)某一病癥相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷，能夠幫助人們更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況；同時(shí)代謝組學(xué)還有助于發(fā)現(xiàn)疾病的潛在生物標(biāo)志物而達(dá)到輔助臨床診斷的目的，其在中醫(yī)藥領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用[7]。本研究采用核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)探討CCl4致大鼠急性肝損傷后其血清和肝代謝輪廓變化及護(hù)肝片對(duì)相關(guān)代謝通路和潛在生物標(biāo)志物的影響，從代謝通路角度闡明護(hù)肝片保肝作用的藥效及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

AVANCEⅢ500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)NMR儀（瑞士Bruker公司）；UV-2401-PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；1-14低溫離心機(jī)（德國Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

護(hù)肝片（黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：201609128，規(guī)格：0.35 g/片）；CCl4（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170102）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、考馬斯亮藍(lán)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20170330、20170410、20170411、20170410）；蛋白酶抑制劑Cocktail（美國Biotool公司，批號(hào)：NJ177437）；氘水（D2O）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Sigma公司，批號(hào)分別為1001484275、K40104）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠36只，♂，體質(zhì)量180～200 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（粵）2013-0034。

2 方法

2.1 分組與給藥

將36只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和護(hù)肝片組，每組12只。護(hù)肝片組大鼠ig護(hù)肝片混懸液（0.5%羧甲基纖維素鈉溶解），劑量為1.7 g/kg[4]；正常組和模型組大鼠ig等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天給藥1次，連續(xù)9 d。末次給藥后1 h，模型組和護(hù)肝片組大鼠ip 50%CCl4花生油溶液1 mL/kg，正常組大鼠ip等體積不含CCl4的花生油溶液。每組隨機(jī)選取6只大鼠用于測(cè)量肝組織生化指標(biāo)水平，另外6只大鼠用于血清和肝代謝組學(xué)分析。

2.2 肝組織中生化指標(biāo)水平檢測(cè)

CCl4誘導(dǎo)肝損傷24 h后，處死大鼠，冰上分離出肝組織。取部分肝組織制成肝勻漿，然后以離心半徑為5 cm、3 500 r/min低溫離心15 min，取上清液。按相應(yīng)試劑盒說明書操作，進(jìn)行MDA、SOD、GSH-Px水平檢測(cè)，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定肝組織樣品中蛋白含量。

2.3 血清和肝代謝組學(xué)分析

2.3.1 樣本采集與處理CCl4誘導(dǎo)肝損傷24 h后，大鼠眼眶后靜脈叢取血至離心管中，以離心半徑為5 cm、3 500 r/min低溫離心15 min，收集血清。取400 μL血清、50 μL磷酸緩沖液（Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.4）和50 μL氘水（D2O）加入到核磁管中，待測(cè)。處死大鼠，取肝組織勻漿，以離心半徑為5 cm、12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液（750μL），凍干。凍干物用450μL磷酸緩沖液（Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.4）和450μL含有0.05%3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-d4鈉鹽（TSP-d4）的D2O溶解，然后以離心半徑為5 cm、12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液（550μL），加入到核磁管中，待測(cè)。

2.3.21H-NMR測(cè)定血清樣本采用弛豫編輯脈沖序列（Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG）進(jìn)行測(cè)定，采用預(yù)飽和方式抑制水峰；肝組織樣本則采用預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列抑制水峰。

2.3.31H-NMR圖譜處理分析對(duì)血清和肝1H-NMR圖譜采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換，進(jìn)行基線校正后，分別參照乳酸的甲基共振雙重峰（δ1.33）和TSP-d4（δ0.0）對(duì)1H-NMR譜的化學(xué)位移進(jìn)行定標(biāo)。在δ 0.5～9.5區(qū)域按δ0.01等間隔分段積分，將剩余積分值進(jìn)行歸一化處理后，所得數(shù)據(jù)乘以10 000導(dǎo)入SIMCAP 12.0軟件，然后進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）。質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)包括R2X（表示X的變異百分比）、R2Y（表示Y的變異百分比）、Q2（表示累計(jì)預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性，大于0.4時(shí)認(rèn)為預(yù)測(cè)結(jié)果可接受，大于0.9時(shí)認(rèn)為預(yù)測(cè)結(jié)果更可靠）。最后，通過使用OPLS-DA模型中變量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)內(nèi)源性代謝物相對(duì)峰面積在正常組和模型組間的差異。只有同時(shí)滿足VIP＞1和P＜0.05的代謝物才被認(rèn)為是潛在生物標(biāo)志物。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px水平

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，護(hù)肝片組大鼠肝組織中MDA水平顯著降低（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1Determination results of MDA，SOD，GSHPxlevelsinlivertissueofratsin each group（±s，n＝6）

表1 各組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1Determination results of MDA，SOD，GSHPxlevelsinlivertissueofratsin each group（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

GSH-Px，U/mg prot 278.79±20.79 223.97±19.41＊256.68±21.54#組別正常組模型組護(hù)肝片組MDA，nmol/mg prot 1.21±0.23 2.34±0.25＊1.64±0.33#SOD，U/mg prot 190.07±31.86 156.70±44.44＊179.79±36.05#

3.2 大鼠血清和肝組織的1H-NMR代謝物譜分析

代謝物譜峰的歸屬主要依據(jù)化學(xué)位移值、峰的裂分情況、耦合常數(shù)及參考文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]。血清和肝組織中的代謝物主要是與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和糖代謝有關(guān)的酮體、氨基酸、有機(jī)酸和糖等物質(zhì)。大鼠血清和肝組織的1H-NMR圖譜見圖1。

圖1 各組大鼠血清和肝組織的1H-NMR圖Fig 11H-NMR spectra of serum and liver tissue of rats in each group

3.3 大鼠代謝表型的變化

正常組和模型組大鼠血清和肝組織的樣本點(diǎn)在PC1維可以完全區(qū)分開，說明CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷后大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝狀況發(fā)生了明顯的改變（見圖2A和圖2B）。本研究采用7倍交叉驗(yàn)證法對(duì)OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，得到了OPLS-DA模型的主要參數(shù)，血清：R2X（cum）＝0.81，R2Y（cum）＝0.97，Q2（cum）＝0.87；肝：R2X（cum）＝0.86，R2Y（cum）＝0.99，Q2（cum）＝0.96。從上述參數(shù)可以看出，本研究建立的模型具有較高的可靠性。護(hù)肝片組大鼠血清和肝組織的樣本點(diǎn)與模型組樣本點(diǎn)可以完全分離，且與正常組樣本點(diǎn)接近，表明護(hù)肝片能對(duì)CCl4致急性肝損傷的大鼠血清和肝代謝紊亂進(jìn)行有效的干預(yù)，并使之逐步恢復(fù)到正常狀態(tài)（見圖2C和圖2D）。各組大鼠血清和肝組織的OPLS-DA得分結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠血清和肝組織的OPLS-DA得分Fig2OPLS-DAscoringofserumandliver tissue of rats in each group

3.4 潛在生物標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果

按“2.3.3”方法，最終在大鼠血清和肝組織中分別篩選得到11、14種與急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，其水平較正常組均顯著上調(diào)/下調(diào)（P＜0.05）。護(hù)肝片能使急性肝損傷大鼠血清中6種和肝組織中8種潛在生物標(biāo)志物顯著回調(diào)：護(hù)肝片組大鼠血清中異亮氨酸、亮氨酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙酰乙酸、膽堿水平顯著下調(diào)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；護(hù)肝片組大鼠肝組織中3-羥基丁酸、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸、琥珀酸、膽堿、乳酸水平顯著下調(diào)，葡萄糖水平顯著上調(diào)，與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該結(jié)果與圖2結(jié)果相一致，同樣表明護(hù)肝片能對(duì)CCl4致急性肝損傷的大鼠血清和肝組織代謝紊亂進(jìn)行有效的干預(yù)。與CCl4急性肝損傷相關(guān)的大鼠血清、肝組織代謝潛在生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果見表2、表3。

4 討論

CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型是目前被廣泛接受的用來研究肝損傷機(jī)制和藥效評(píng)價(jià)的模型之一。CCl4在肝內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生毒性自由基代謝產(chǎn)物三氯甲基和過氧三氯甲基自由基，二者誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以造成DNA斷裂、蛋白質(zhì)變性降解和脂質(zhì)過氧化等多種細(xì)胞損傷[10]。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其含量高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD和GSH-Px是組成生物體體內(nèi)酶促防御體系重要的抗氧化酶，其能有效地清除活性氧自由基并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在本研究中，與模型組比較，護(hù)肝片組大鼠肝組織中SOD和GSH-Px水平顯著升高，MDA水平顯著降低。該結(jié)果說明護(hù)肝片能提高大鼠肝組織的抗氧化能力，對(duì)CCl4所致的大鼠肝損傷具有預(yù)防作用。

代謝組學(xué)研究中，CCl4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的肝細(xì)胞損傷表現(xiàn)為模型大鼠血清和肝組織中膽堿、磷酸膽堿、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷胱甘肽水平升高。氧化應(yīng)激可以造成肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，膽堿是細(xì)胞膜和脂蛋白磷脂的重要組分，在維持細(xì)胞膜完整性和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞膜的損傷可能造成了膽堿和磷酸膽堿水平的升高[11]；氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸和谷氨酸）水平升高可能體現(xiàn)了氧化應(yīng)激造成蛋白質(zhì)變性降解[12]及氨基酸代謝紊亂[13]；谷胱甘肽水平升高可能是機(jī)體為拮抗過氧化的應(yīng)激性反應(yīng)。上述研究結(jié)果與文獻(xiàn)[13]報(bào)道相一致。模型組大鼠血清和肝組織中葡萄糖水平下降，而琥珀酸、丙酮酸和乳酸水平升高，說明CCl4致肝損傷后機(jī)體能量需求增加，同時(shí)無氧糖酵解活動(dòng)顯著增強(qiáng)，這與CCl4導(dǎo)致的肝細(xì)胞缺氧狀態(tài)相一致[14]。酮體是脂肪酸在肝中β-氧化后的中間代謝產(chǎn)物，是肝輸出能源的一種形式。CCl4誘導(dǎo)的大鼠機(jī)體脂質(zhì)代謝異常表現(xiàn)為血清極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白升高，同時(shí)血清和肝中酮體（3-羥基丁酸、丙酮和乙酰乙酸）含量增加。此外，文獻(xiàn)報(bào)道CCl4導(dǎo)致機(jī)體三磷酸腺苷（ATP）水平降低[14]。本研究中模型組大鼠肝組織腺苷水平升高，表明機(jī)體能量?jī)?chǔ)備失衡[13]。護(hù)肝片能分別使大鼠血清中6種和肝組織中8種與急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物顯著性回調(diào)，表明護(hù)肝片能通過干預(yù)部分糖代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝通路來改善CCl4引起的急性肝損傷。

綜上所述，護(hù)肝片可以有效地調(diào)節(jié)模型組大鼠肝組織中MDA、SOD、GSH-Px水平，并逆轉(zhuǎn)CCl4致肝損傷模型大鼠機(jī)體的脂質(zhì)代謝、糖代謝和氨基酸代謝紊亂。本研究從整體代謝表型和相關(guān)代謝標(biāo)志物的角度闡釋了護(hù)肝片的藥效和作用機(jī)制，為護(hù)肝片的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

表2 與CCl4急性肝損傷相關(guān)的大鼠血清代謝潛在生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2Determination results of potential biomarkers in serum of rats with CCl4-induced acute liver injury（±s，n＝6）

表2 與CCl4急性肝損傷相關(guān)的大鼠血清代謝潛在生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2Determination results of potential biomarkers in serum of rats with CCl4-induced acute liver injury（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；“s”為單峰，“d”為雙重峰，“t”為三重峰，“m”為多重峰Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；“s”was single peak，“d”was double peak，“t”was triple peak，“m”was multiple peak

護(hù)肝片組62.33±12.35 12.41±1.52#16.09±1.99#12.12±1.02 20.97±2.93#95.22±10.34 10.58±2.34#7.53±1.75#20.12±5.46 37.70±3.31#67.74±9.35代謝產(chǎn)物極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白異亮氨酸亮氨酸纈氨酸3-羥基丁酸N-乙酰糖蛋白丙酮乙酰乙酸丙酮酸膽堿葡萄糖δ1H VIP 2.9 1.3 1.8 1.2 1.8 3.9 2.1 1.4 2.0 1.8 2.1歸一化后峰面積0.88（m）0.94（t）0.96（t）0.99（d）1.20（d）2.04（s）2.23（s）2.28（s）2.37（s）3.20（s）4.65（d）正常組46.81±7.42 11.01±1.06 13.31±2.06 9.43±1.84 18.47±4.68 66.12±6.29 9.01±3.06 5.81±0.46 11.12±3.68 36.26±4.96 80.22±9.88模型組62.64±5.89＊14.61±2.15＊19.58±3.21＊12.76±2.64＊25.64±3.40＊91.49±8.24＊17.29±4.09＊9.64±2.02＊19.90±6.63＊43.82±5.36＊68.51±6.79＊

表3 與CCl4急性肝損傷相關(guān)的大鼠肝代謝潛在生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3Determination results of potential biomarkers in liver of rats with CCl4-induced acute liver injury（±s，n＝6）

表3 與CCl4急性肝損傷相關(guān)的大鼠肝代謝潛在生物標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3Determination results of potential biomarkers in liver of rats with CCl4-induced acute liver injury（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；“s”為單峰，“d”為雙重峰，“t”為三重峰，“q”為四重峰，“m”為多重峰Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；“s”was single peak，“d”was double peak，“t”was triple peak，“q”was quadruple peak，“m”was multiple peak

護(hù)肝片組23.24±5.49 26.67±4.12 15.62±7.91 6.76±0.77#47.10±6.54#18.24±4.05#10.83±1.90#29.47±6.77#32.56±7.65 7.79±0.79#195.69±23.88 14.44±2.01#109.25±12.17#114.57±14.17#12.91±1.97代謝產(chǎn)物異亮氨酸亮氨酸纈氨酸3-羥基丁酸丙氨酸谷氨酸丙酮酸琥珀酸谷胱甘肽膽堿磷酸膽堿乳酸葡萄糖葡萄糖腺苷δ1H 歸一化后峰面積0.94（t）0.97（t）0.99（d）1.20（d）1.48（d）2.35（m）2.37（s）2.41（s）2.55（m）3.21（s）3.22（s）4.12（q）4.65（d）5.24（d）8.35（s）VIP 1.9 1.8 1.2 1.1 1.8 2.0 1.5 2.2 2.5 3.1 4.6 1.2 3.5 4.1 1.1正常組13.18±1.99 19.09±2.52 8.98±2.39 6.48±1.17 44.68±7.45 11.92±2.34 7.77±1.82 24.59±5.76 14.95±2.06 5.75±2.61 148.80±13.02 12.65±1.25 123.91±11.06 136.06±6.21 9.19±2.32模型組23.65±4.96＊29.30±6.63＊13.72±3.36＊8.37±1.62＊58.33±12.32＊23.20±4.49＊13.92±1.99＊41.07±12.26＊30.93±5.65＊10.09±1.71＊214.64±43.01＊17.82±3.93＊89.56±12.61＊95.97±4.66＊13.50±3.18＊

[1]朱小玉，于東，孟志剛，等.護(hù)肝片治療非酒精性脂肪肝42例臨床觀察[J].北京醫(yī)學(xué)，2006，28（8）：489-490.

[2]劉啟榮.護(hù)肝片在防治抗結(jié)核藥物所致肝損傷的臨床應(yīng)用[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2011，11（12）：1520-1521.

[3]白霜，金玲.護(hù)肝片預(yù)防小鼠酒精性肝損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（6）：64-66.

[4]楊琳，梁雪琰，趙洪海，等.護(hù)肝片降低CCl4肝損傷模型大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用及其機(jī)制[J].中醫(yī)藥信息，2014，31（3）：114-117.

[5]吳義春，吳強(qiáng)，楊雁，等.護(hù)肝片對(duì)纖維化肝組織TGF-β1Ⅰ型受體表達(dá)的抑制作用[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，24（3）：28-31.

[6]Nicholson，JK，Connelly J，Lindon JC，et al.Metabonomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J].Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）：153-161.

[7]鄭敏霞，沈潔.代謝組學(xué)方法及其在中醫(yī)藥中的應(yīng)用[J].中國藥房，2011，22（23）：2201-2203.

[8]Wei L，Liao P，Wu H，et al.Metabolic profiling studies on the toxicological effects of realgar in rats by1H NMR spectroscopy[J].Toxicol Appl Pharmacol，2009，234（3）：314-325.

[9]Ding L，Hao F，Shi Z，et al.Systems biological responses to chronic perfluorododecanoic acid exposurebyintegratedmetabonomicandtranscriptomic studies[J].J Proteome Res，2009，8（6）：2882-2891.

[10]JiangL，HuangJ，WangY，etal.Metabonomic analysis reveals the CCl4-induced systems alterations for multiple rat organs[J].J Proteome Res，2012，11（7）：3848-3859.

[11]Griffin JL，Mann CJ，Scott J，et al.Choline containingmetabolitesduringcelltransfection：an insight into magnetic resonance spectroscopy detectable changes[J].FEBS Lett，2001，509（2）：263-266.

[12]Goldberg AL.Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins[J].Nature，2003，426（6968）：895-899.

[13]Zira A，Kostidis S，Theocharis S，et al.1H NMR-based metabonomics approach in a rat model of acute liver injury and regeneration induced by CCl4administration[J].Toxicology，2013，303（1）：115-124.

[14]HarveyPJ，GreadyJE，HickeyHM，etal.31P and1H NMR spectroscopic studies of liver extractsofcarbontetrachloride-treatedrats[J].NMR Biomed，1999，12（6）：395-401.

Study on the Hepatoprotective Effects of Hugan Tablets Based on Serum and Liver Metabonomics

GONG Mengjuan1，2，3，WU Shengqian1，2，3，YUE He1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3，ZOU Zhongjie1，2，3（1.School of TCM，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China）

OBJECTIVE：To elucidate the efficacy and mechanism of Hugan tablets in hepatoprotective effects from perspective of metabolic pathways.METHODS：36 male rats were randomly divided into normal group（0.5%sodium carboxymethyl cellulose），model group（0.5%sodium carboxymethyl cellulose）and Hugan tablets group（1.7 g/kg），12 in each group，intragastrically administrated once a day，for 9 d.After 1 h of last administration，rats in model group and Hugan tablets group were intraperitoneally injected 50%CCl4peanut oil solution 1 mL/kg to induce liver injury.After 24 h of modeling，malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSHPx）levels in liver tissue of rats were detected.Nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H-NMR）metabolomics technique was adopted to establish the serum and liver metabolite profiles of rats，and the effects of Hugan tablets on changes of metabolic profile and potential biomarkers in serum and liver of rats with CCl4-induced acute liver injury were analyzed.RESULTS：Compared with normal group，MDA level in liver tissue of rats in model group was significantly increased（P＜0.05），SOD and GSH-Px levels were significantly reduced（P＜0.05）.Both body physiology and material metabolism of rats were obviously changed，and levels of 11 metabolic potential biomarkers in serum and 14 metabolic potential biomarkers in liver were significantly increased/decreased（P＜0.05）.Compared with model group，MDA level in liver tissue in Hugan tablets group was significantly reduced（P＜0.05），SOD and GSHPx levels were significantly increased（P＜0.05）.Serum and liver metabolism tended to be normal，6 metabolic potential biomarkers（isoleucine，leucine，3-hydroxybutyrate，acetone，acetoacetate，choline）in serum and 8 metabolic potential biomarkers（3-hydroxybutyrate，alanine，glutamate，pyruvate，succinate，choline，lactate，glucose）in liver got significant callback（P＜0.05）.CONCLUSIONS：The hepatoprotective mechanism of Hugan tablets may be associated with antioxidative stress and regulation of lipid metabolism，glucose metabolism and amino acid metabolism.

Hugan tablets；Acute hepatic injury；Metabonomics；Nuclear magnetic resonance spectroscopy；Protential biomarkers；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）34-4776-05

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.06

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81603397、81403075）

＊副教授，碩士。研究方向：中藥藥理學(xué)。電話：020-39352612。E-mail：gongmengjuan@139.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、代謝組學(xué)。電話：020-39353240。E-mail：zouzhongjie@139.com

2017-06-16

2017-09-22）

（編輯：林靜）