鄧　莉，孫　文，侯　毅，劉銅華（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽7000；.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京0009）

自身免疫性甲狀腺炎實驗動物模型的研究進展*

鄧莉1，孫文2，侯毅2，劉銅華2
（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽712000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029）

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）是一種常見的器官特異性自身免疫疾病。目前，AIT發(fā)病機制還不明確，阻礙了新的有效治療方法的研發(fā)，AIT動物模型的開發(fā)應(yīng)用是AIT研究的重要手段。AIT的動物模型方法主要有異源性甲狀腺抗原免疫法、脾細胞體外活化移植誘導(dǎo)法、重組促甲狀腺素受體（TSHR）多肽免疫法、cDNA疫苗免疫法、高碘誘發(fā)法及自發(fā)性模型。通過對其動物模型研究進展進行討論，旨在建立一個經(jīng)濟、有效的動物模型，以求進一步系統(tǒng)研究自身免疫甲狀腺?。ˋITD）的發(fā)病機制及防治。

自身免疫性甲狀腺炎；動物模型；綜述

自身免疫性甲狀腺炎（AIT）是一種常見的器官特異性自身免疫疾病，是自身免疫甲狀腺?。ˋITD）的一種，在臨床上主要分為：橋本甲狀腺炎（HT）、萎縮性甲狀腺炎和產(chǎn)后甲狀腺炎（PPT）等。這類疾病最顯著的特點是甲狀腺被浸潤性單核細胞逐漸破壞，最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退。臨床檢查可見甲狀腺過氧化酶抗體（TPOAb）和甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）水平明顯升高，同時伴有甲狀腺功能改變，早期可表現(xiàn)為甲狀腺功能亢進、正?；驕p退，后期發(fā)展為甲狀腺功能減退。近年來隨著人們對碘攝入增多，生活方式和環(huán)境等多種易感因素的改變，本病發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳因素、細胞因子、細胞凋亡及微量元素等有關(guān)［1］。越來越多的學(xué)者為進一步探討其確切的發(fā)病機制，尋求更合理有效的防治措施，利用實驗動物建立了實驗性AIT動物模型，筆者就近年來的研究情況進行簡要論述。

1　實驗性自身免疫甲狀腺炎（EAT）

AIT模型的成功標(biāo)準(zhǔn)為兩部分：EAT模型中動物血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)高水平的甲狀腺自身抗體和病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)甲狀腺組織不同程度的淋巴細胞浸潤，并按其浸潤的嚴重程度分級量化評判［2］。

1.1異源性甲狀腺抗原免疫法研究表明，在AIT中甲狀腺球蛋白（Tg）是重要的自身抗原，占甲狀腺總蛋白的75%～80%，并與EAT的發(fā)生密切相關(guān)［3］。實驗動物，無論是對Tg或Tg肽高應(yīng)答的H-2k，H-2s種系，還是低應(yīng)答的H-2b、H-2d、H-2v種系鼠類，經(jīng)Tg或Tg肽免疫后，發(fā)生抗原決定簇的擴散現(xiàn)象，產(chǎn)生如TgAb、TPOAb、TmAb等甲狀腺自身抗體，激活免疫反應(yīng)，進而使甲狀腺組織呈現(xiàn)不同程度淋巴細胞浸潤，破壞甲狀腺濾泡細胞，最終導(dǎo)致AIT的發(fā)生［4-5］。因此，研究中通常用Tg配合佐劑聯(lián)合進行多點皮下注射誘導(dǎo)動物（小鼠、大鼠、雞、犬等）自身產(chǎn)生免疫應(yīng)答而誘發(fā)AIT。

異源性甲狀腺球蛋白方面，主要有豬Tg（pTg）、鼠Tg（mTg）、牛Tg（bTg）。國內(nèi)主要選用pTg聯(lián)合弗氏佐劑，而國外常用鼠Tg免疫誘導(dǎo)動物產(chǎn)生EAT。郭丹等［6］分別利用pTg和mTg聯(lián)合弗氏佐劑誘導(dǎo)CBA/J小鼠建立EAT，比較了相同基因背景下、相同劑量pTg、和mTg免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生EAT的效果。結(jié)果顯示利用CBA/J小鼠建立模型時，mTg為適宜抗原。此外，Si-lu Cui等［7］利用4周齡雌性Lewis大鼠bTg聯(lián)合弗氏佐劑免疫成功的建立了EAT模型，探索碘攝入升高了血清中白介素-10的水平，對EIT的發(fā)展起到了促進作用。另外，可用重組鼠甲狀腺過氧化物酶（rmTPO）和豚鼠促甲狀腺素受體（TSHR）等免疫誘導(dǎo)EAT的發(fā)生［8-9］，但目前少用。

動物選擇方面，以雌性鼠科動物誘導(dǎo)為主，一種為免疫易感鼠，主要是擁有MHC、H-2k和H-2s基因遺傳背景的鼠類［10-11］，包括：Lewis、BB大鼠；TA-1、NOD、CBA/J、BALB/C等小鼠品系均為EAT易感品系。Yu Z等［12］利用H-2遺傳背景的BALB/c和C57BL/6雌性小鼠，通過mTg免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生EAT，以研究白介素-10是否通過H-2起作用及其可能作用機制，此法成功率高，且對遺傳因素作用機制研究有明顯優(yōu)勢，但成本高、飼養(yǎng)環(huán)境要求嚴格；另一種為正常小鼠或大鼠，此方法經(jīng)濟、簡單，且用普通鼠的最大優(yōu)勢是在以后的研究中可以觀察各種致病因素對其基因型的影響，即環(huán)境、免疫等因素是否可以誘導(dǎo)基因的異常表達［13-14］。

1.2脾細胞體外活化移植誘導(dǎo)法易感系供體小鼠經(jīng)mTg聯(lián)合弗氏佐劑或脂多糖誘導(dǎo)后處死，收集活化的脾細胞，經(jīng)含mTg的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移到同源受體小鼠，誘導(dǎo)EAT［15］。經(jīng)mTg活化T細胞的受體發(fā)展為淋巴細胞性EAT，而采用易感CAB/J小鼠誘導(dǎo)后的受體，發(fā)展為嚴重的組織學(xué)截然不同肉芽腫性EAT［16］，是研究肉芽腫性甲狀腺炎的重要方法。此法誘導(dǎo)肉芽腫性EAT，其炎癥浸潤程度約在受體接收活化脾細胞第20天后達到最大，此階段甲狀腺損害程度決定其在第60天后的轉(zhuǎn)歸——緩解或進展為纖維化［17］。

1.3重組TSHR多肽免疫法TSHR是一種膜受體，此方法是指用細菌培養(yǎng)產(chǎn)生重組TSHR的融合蛋白的細胞外部分與麥芽糖結(jié)合蛋白連結(jié)形成的活性多肽免疫同源小鼠，使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生甲狀腺刺激抗體，誘導(dǎo)小鼠AIT發(fā)生的方法。將重組TSHR活性片段注入BALB/C小鼠體內(nèi)，可以誘導(dǎo)EAT的發(fā)生［18］。但是此法操作過程比較復(fù)雜，成功率較低，故應(yīng)用比較少。

1.4cDNA疫苗免疫法cDNA疫苗可以對傳染病和實驗性癌癥產(chǎn)生保護性免疫，或作為可提供治療劑量的基因產(chǎn)品。該法一般適用于Th1型的免疫疾病，Eric M等利用RT-PCR和Pfu酶產(chǎn)生人Tg（hTg）編碼序列的幾個重疊片段，其參與重疊擴增PCR，以及在Tg編碼序列中使用特異的限制性位點，加載上質(zhì)粒，得到hTg cDNA，聯(lián)合電穿孔法，將其接種于C3H/Hen小鼠特定肌群中［19-20］。該疫苗可長期、內(nèi)源性的抗原表達，產(chǎn)生長期的體液和細胞免疫，從而維持和促進甲狀腺自身抗原的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)EAT的發(fā)生。該法在研究外周免疫耐受方面與上述異源性甲狀腺抗原免疫法相比更為準(zhǔn)確［19］。但此法處于初步研究階段，尚未成熟，成功率較低，需進一步探索。

1.5高碘誘發(fā)法碘是誘發(fā)AIT的重要致病因素，流行病學(xué)顯示：高碘地區(qū)AIT的發(fā)病率明顯高于非高碘地區(qū)，患者尿碘與血清APO-Ab和Tg-Ab呈正相關(guān)［21］。過量碘攝入可誘發(fā)和加重易感動物AIT的發(fā)生和發(fā)展，且過度碘化得甲狀腺自身抗體其抗原性有所增強［22］。研究不同劑量慢性碘過量誘導(dǎo)易感型小鼠時，可見碘過量引起的甲狀腺腫，其質(zhì)量與用碘量成正相關(guān)，與甲狀腺上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的損害存在劑量依賴的方式，甲狀腺炎的發(fā)生率，以及甲狀腺的淋巴細胞浸潤程度隨著劑量的增加逐漸增加，且隨攝入時間的延長，損傷的程度加重，引起小鼠的甲狀腺的功能改變，最終導(dǎo)致小鼠甲狀腺功能減退［7，23］。此法簡單易單易于施行，但單純高碘飲食誘發(fā)AIT的成功率較低，需與其他條件配合進行。相關(guān)研究表明高碘與Tg免疫對于自身抗水平的升高具有協(xié)同作用，高碘攝入使Th1/Th2的平衡向Th1偏移，可加劇Tg免疫EAT模型的炎癥反應(yīng)［24］。現(xiàn)多采取高碘聯(lián)合Tg誘導(dǎo)EAT易感或非易感株鼠系作為EAT的理想模型［25-26］。

2　自發(fā)性自身免疫甲狀腺炎（SAIT）

一些動物在沒有任何外界因素干預(yù)的情況下也會自發(fā)出現(xiàn)AIT，這種自發(fā)產(chǎn)生的甲狀腺炎稱為自發(fā)性自身免疫甲狀腺炎。

Nod小鼠是1型糖尿病自發(fā)模型之一，小部分可存在甲狀腺自發(fā)單核細胞浸潤，病變輕微。在此基礎(chǔ)上，美國Merk實驗室培育出可以在甲狀腺細胞表面表達MHC-II類分子H-2k、I-Ak及Dk，僅發(fā)生輕度胰島炎而不發(fā)生糖尿病的SAIT小鼠NOD. H-2h4［27］。在含有0.05%碘化鈉（NaI）（相當(dāng)于成人每日攝碘量的1 000倍）飲用水喂養(yǎng)7～8周齡的NOD. H-2h4小鼠8～10周后，接近100%的小鼠可以發(fā)展為SAIT，其發(fā)生發(fā)展需要CD4+T細胞和B細胞的共同參與，12～16周后其慢性炎癥的嚴重程度最高。在不給碘的條件下，28～40周齡的NOD.H-2h4小鼠，其AIT的發(fā)生率大約為60%-70%［28］。NOD.H-2h4小鼠AIT的病理學(xué)檢查與HT患者類似，都表現(xiàn)為甲狀腺中CD4～和CD8+T細胞、B細胞以及其它單核細胞的浸潤［29］。目前，大量實驗采用碘過量聯(lián)合NOD.H-2h4小鼠模型以探討AIT的可能致病機制，該模型成功率高，實驗簡便，但國內(nèi)該品種鼠類引種少，且購價昂貴。

此外，還有其他SAIT動物模型，如OS雞、Beagle犬等，但受限于經(jīng)費和飼養(yǎng)條件的要求，且缺乏相關(guān)檢測試劑盒，目前較少開展。近年來SAIT主要以NOD.H-2h4小鼠為主。

總之，經(jīng)過多年研究探索，AIT模型的建立在逐步成熟。盡管有某些種系的實驗動物由于特有的遺傳缺陷可自發(fā)產(chǎn)生AIT，但也使其應(yīng)用受到諸多限制。EAT已成為研究人類AIT的重要工具，國外學(xué)者常采用一些有免疫缺陷的易感動物來復(fù)制EAT，又以NOD.H-2h4小鼠為主，但SEAT的品系來源受嚴格的變異種系篩選條件的限制，無論是人為的破壞免疫功能、亦或者利用轉(zhuǎn)基因的方法，成本均很昂貴，技術(shù)要求較高，歷時較長，且動物可能需要特殊的飼養(yǎng)環(huán)境，目前國內(nèi)尚缺少研究推廣相關(guān)的條件。利用普通鼠免疫誘導(dǎo)EAT可探討環(huán)境、免疫等可能致病因素對基因型的影響。目前，利用甲狀腺自身抗原成分聯(lián)合佐劑免疫動物或聯(lián)用高碘誘導(dǎo)法是理想的造模途徑，國內(nèi)應(yīng)用較多。脾細胞體外活化移植誘導(dǎo)法、重組TSHR多肽免疫法、Tg致敏的樹突狀細胞誘導(dǎo)免疫法等，同時為EAT模型的構(gòu)建提供了廣闊的思路。碘過量誘導(dǎo)法尤適用于碘過量對AIT的致病機制的研究。AIT是一個綜合性疾病，由于遺傳因素、性激素、細胞因子、藥物和環(huán)境因素等多因素都對AIT的發(fā)生發(fā)展具有重要影響［30］，因此，在選擇建造EAT模型方法的同時要綜合考慮動物種系、性別的差異以及及飼料中的碘含量等問題。建立一個經(jīng)濟、有效的動物模型，對系統(tǒng)研究AIT的發(fā)病機制及防治具有重要意義。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Research progress of the autoimmune thyroiditis animal model

DENG Li1，SUN Wen2，HOU Yi3，LIU Tong-hua2
（1.Shanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712000，China；2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Autoimmune thyroiditis（AIT）is a common organ-specific autoimmune diseases.Currently，AIT pathogenesis is unclear，hindering the development of new and effective treatment methods，development and application of AIT animal model is an important means of AIT research.Animal model approach AIT mainly heterologous antigens thyroid immunoassay.Transplantation of activated spleen cells in vitro，recombinant TSHR polypeptide immunoassay，cDNA Immunization to induce an immune method，high iodine-induced and spontaneous models.Discuss research progress through the animal model，and it aims to establish an economic and effective animal model system in order to further study the pathogenesis of AITD and prevention.

autoimmune thyroiditis；animal model；review

R581.4

A

1672-1519（2016）03-0189-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.03.16

國家國際科技合作專項項目中藥干預(yù)自身免疫性甲狀腺炎活性篩選技術(shù)與組方優(yōu)化研究（2015DFA30910）。作者簡介：鄧莉（1987-），女，2013級碩士研究生，主要研究方向為內(nèi)分泌代謝疾病。

劉銅華，E-mail：thliu@vip.163.com。

（2015-08-20）