文陶文靖 王瑩 劉磊 王覃

新型噬菌體的實(shí)驗(yàn)研究

文/陶文靖 王瑩 劉磊 王覃

針對兩種噬菌體所對應(yīng)的致病菌進(jìn)行特異性檢測和研究

本文實(shí)驗(yàn)表明，豬葡萄球菌和乙型副傷寒沙門氏菌對應(yīng)的噬菌體能夠特異性感染豬葡萄球菌和乙型副傷寒沙門氏菌，并且在有效抑制濃度下對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的生長沒有影響。

尋找更加專一、高效的選擇性增菌方法是微生物快速檢測行業(yè)亟待解決的問題。噬菌體作為細(xì)菌病毒，具有非常強(qiáng)的特異性，并且其安全性得到美國FDA的GRAS認(rèn)證。目前，噬菌體在生物殺菌和超級細(xì)菌感染治療中已經(jīng)有大量的應(yīng)用，但在致病菌選擇性增菌、快速培養(yǎng)中少有應(yīng)用。本文利用噬菌體開發(fā)一種新型選擇性培養(yǎng)基，為致病菌的選擇性增菌提供一種高效專一的培養(yǎng)方法。

實(shí)驗(yàn)部分

材料

菌種及海水：金黃色葡萄菌、豬葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌本公司實(shí)驗(yàn)室分離；海水采集自青島石老人海域；

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨），0.5%酵母提取物，1%NaCl；LB固體平板培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入終濃度2%的瓊脂。

試劑和儀器

金黃色葡萄球測試片、鼠傷寒沙門氏菌金標(biāo)檢測卡（北京良潤生物科技）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)；QYC-200恒溫培養(yǎng)搖床；SW-CJ-1F超凈臺。

實(shí)驗(yàn)方法

噬菌體的篩選：將采集的海水樣品用5倍體積去離子水稀釋，再用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.8，在5000 r/min離心15 min后并用0.45 μm的超濾膜過濾。將豬葡萄球菌（或乙型副傷寒沙門氏菌）均勻接種于LB固體平板，使菌體濃度為1.0×108 CFU/ml，將上述過濾后樣品涂布于LB固體平板上，待表面干燥后，37℃倒置培養(yǎng)過夜。如果出現(xiàn)噬菌體斑即篩選到相應(yīng)菌株的噬菌體。

挑取噬菌斑，加入到對數(shù)期的豬葡萄球菌（或乙型副傷寒沙門氏菌）中，于37℃震蕩培養(yǎng)4～6 h，待澄清后，在5000 r/min離心20 min，然后用0.45 μm的濾膜過濾，得噬菌體。

致病菌的培養(yǎng)：將金黃色葡萄球菌、豬葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌保存菌種活化，進(jìn)行三線純化，分別將單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，計數(shù)備用。

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的檢測：分別使用良潤生物科技提供的金黃色葡萄球測試片、鼠傷寒沙門氏菌金標(biāo)檢測卡進(jìn)行檢測，計數(shù)。

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，組間比較采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，分析方法為單因素方差分析和鄧肯（Duncan）多重比較分析，顯著性水平p=0.05。

實(shí)驗(yàn)與分析

噬菌體的篩選結(jié)果

按照1.2.1所述方法分別進(jìn)行豬葡萄球菌和乙型副傷寒沙門氏菌的篩選，結(jié)果均在培養(yǎng)過程出現(xiàn)噬菌斑，證明噬菌體篩選成功，分別命名為噬菌體I（豬葡萄球菌噬菌體）和噬菌體II（乙型副傷寒沙門氏菌）。進(jìn)行噬菌斑的擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)過測定豬葡萄球菌噬菌體的噬菌斑形成單位為5×1010 PFU/ml，乙型副傷寒沙門氏菌噬菌體的噬菌斑形成單位為3×1010 PFU/ml。

對豬葡萄球菌檢測結(jié)果的影響

將按照1.2.2方法培養(yǎng)的豬葡萄球菌和金黃色葡萄球菌稀釋至100 CFU/ ml，并將其分成4份，分別添加不同濃度的豬葡萄球菌噬菌體，使其終濃度分別為1.0×104 PFU/ml、1.0×105 PFU/ ml、1.0×106 PFU/ml、1.0×107 PFU/ ml，使用北京良潤生物科技提供的金黃色葡萄球測試片進(jìn)行檢測，計數(shù)，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在豬葡萄球菌培養(yǎng)體系中加入噬菌體I，顯著抑制了豬葡萄球菌的生長，并且隨著噬菌體濃度的增大抑制效果增強(qiáng)，當(dāng)添加濃度為1.0×106 PFU/ml時，豬葡萄球菌被完全抑制。而噬菌體I添加到金黃色葡萄球菌培養(yǎng)體系時并沒有對該菌生長產(chǎn)生影響，即使增加濃度也不會對金黃色葡萄球菌的生長產(chǎn)生影響。這個結(jié)果說明，利用1.2.1篩選的噬菌體I能夠特異性的感染豬葡萄球菌，對金黃色葡萄球菌不敏感。

對葡萄球菌混合樣品檢測結(jié)果的影響

將培養(yǎng)好的豬葡萄球菌和金黃色葡萄球菌混合，適當(dāng)稀釋使其終濃度均達(dá)到100 CFU/ml。并將樣品分成5份，分別添加不同濃度的豬葡萄球菌噬菌體，使其終濃度分別為2.0×105 PFU/ml、4.0×105 PFU/ml、6.0×105 PFU/ml、8.0×105 PFU/ml、1.0×106 PFU/ml，并使用北京良潤生物科技有限公司提供的金黃色葡萄球測試片進(jìn)行檢測，計數(shù)，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

結(jié)果已經(jīng)表明當(dāng)噬菌體I濃度達(dá)到1.0×106 PFU/ml時能夠有效抑制豬葡萄球菌。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步縮小了抑制劑濃度，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)噬菌體I的終濃度達(dá)到6.0×105 PFU/ml以上時，就能夠有效抑制豬葡萄球菌的生長，使測試片對金黃色葡萄球菌具有特異性。

對乙型副傷寒沙門氏菌檢測結(jié)果的影響

將培養(yǎng)好的乙型副傷寒沙門氏菌待檢品稀釋至100 CFU/ml，并將其分成4份，分別添加不同濃度的乙型副傷寒沙門氏菌噬菌體，使其終濃度分別為1.0×103 PFU/ml、1.0×105 PFU/ml、1.0×107 PFU/ml、1.0×109 PFU/ml，并使用北京良潤生物科技有限公司提供的鼠傷寒沙門氏菌金標(biāo)檢測卡進(jìn)行檢測，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加噬菌體II的濃度超過1.0×103 PFU/ ml時均可以有效抑制乙型副傷寒沙門氏菌的生長，證明篩選出來的噬菌體II能夠有效感染乙型副傷寒沙門氏菌。

對沙門氏菌混合樣品檢測結(jié)果的影響

將培養(yǎng)好的乙型副傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合，適當(dāng)稀釋使二者終濃度分別達(dá)到100 CFU/ml。并將樣品分成若干份，分別添加不同濃度的豬葡萄球菌噬菌體，使其終濃度分別為1.0×103 PFU/ml、1.0×105 PFU/ml、 1.0×107 PFU/ml、1.0×109 PFU/ml，并使用良潤提供的鼠傷寒沙門氏菌金標(biāo)檢測卡進(jìn)行檢測，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

本實(shí)驗(yàn)使用的微生物是乙型副傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌混合培養(yǎng)物，當(dāng)噬菌體II的濃度為1.0×103 PFU/ ml時有菌檢出，而2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在同樣濃度下沒有乙型副傷寒沙門氏菌檢出，說明本實(shí)驗(yàn)檢出的微生物僅有鼠傷寒沙門氏菌。證明噬菌體II能夠特異性的感染乙型副傷寒沙門氏菌，對鼠傷寒沙門氏菌不敏感。

表1.噬菌體I濃度對豬葡萄球菌檢測結(jié)果的影響

表2. 噬菌體I濃度對葡萄球菌混合樣品檢測結(jié)果的影響

表3. 噬菌體II濃度對乙型副傷寒沙門氏菌結(jié)果的影響

表4.噬菌體II濃度對混合沙門氏菌結(jié)果的影響

結(jié)果與討論

本文針對目前致病菌（金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌）檢測過程中兩種重要的干擾菌株（豬葡萄球菌和乙型副傷寒沙門氏菌）的現(xiàn)狀，利用類似的方法篩選出這兩菌株對應(yīng)的噬菌體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩種噬菌體能夠特異性感染豬葡萄球菌和乙型副傷寒沙門氏菌，同時在有效抑制濃度下對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的生長沒有影響。因此可以將這兩種噬菌體進(jìn)行金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的選擇性增菌，從而實(shí)現(xiàn)這兩種致病菌的特異性檢測。 LP

本文作者陶、劉來自北京良潤公司；王瑩來自青島農(nóng)大食品科學(xué)工程院；王覃來自北京智云達(dá)公司。