色譜分析中的樣品前處理

制約分析效率和準確度提升的關鍵環(huán)節(jié)

色譜分析常常用于各種復雜的基體以及低含量組分的測定，消除基體干擾、提高分析靈敏度、延長儀器壽命一直以來都是需要解決的普遍性問題，因此，樣品進行色譜分析前的前處理變得非常重要。

使用色譜對復雜基體進行分析時，樣品前處理步驟往往繁瑣耗時、易引起誤差,但在發(fā)展分析方法的同時，人們或多或少忽視了樣品的預處理問題。如果前處理不當，往往會使全過程的回收率降低，會導致定性定量錯誤和色譜柱壽命縮短等問題。因此，提高和掌握樣品的前處理技術是完善檢測全過程的重要環(huán)節(jié)。迄今為止，樣品前處理的方法很多，本質上可分為兩大類：一類是對檢測器響應弱(或無信號)的樣品，通過衍生技術改變其物理和化學性質，使之成為可被檢測的化合物；另一類是通過對復雜基體樣品中低含量組分進行分離、純化和富集以獲得同樣效果。

樣品前處理的意義

1.去除基體中干擾樣品分析的雜質，提高分析精度和分離效果；2．提高被測定化合物檢測靈敏度；3．提高樣品與流動相的兼容性，從而改善定性定量分析的重復性；4.增加選擇性；5.減少停機概率。

樣品前處理的要求

過程簡單，處理速度快速，使用裝置要小，引進誤差要小，對目標物有高選擇性有較高回收率，且綠色環(huán)保。

圖1.溶劑萃取中的索氏提取器。

常用樣品前處理技術

溶劑萃取、固相萃取、超臨界萃取、衍生化、膜分離、蒸餾、吸附。

常規(guī)萃取

兩種模式：1.液液萃?。悍至髀┒罚?.液氣萃取（溶液吸收）：對氣態(tài)、樣品蒸汽及氣溶膠等中的樣品進行吸附。

蒸餾

分類：水蒸汽蒸餾、減壓蒸餾、分餾。

應用：草藥中植物油、奶產品中有機體氯污染物、環(huán)境樣品中揮發(fā)性有機物。

關于固相萃取

1.步驟：活化吸附劑→反相萃取柱用水溶性有機溶劑→正相萃取柱用目標化合物溶劑。

2.分類

正相：萃取極性化合物；

反相：萃取中等極性到非極性化合物；

離子交換萃?。何綆в须姾傻幕衔?；

3.萃取柱的選擇

盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑；樣品溶劑的強度相對該吸附劑應該較弱。

4.上樣

通過抽真空、加壓或離心的方法使樣品進入吸附劑。

5.洗滌和洗脫

先用弱溶劑洗干擾物，再用較強的溶劑洗目標化合物；也有的將干擾物吸附在柱上而目標物直接流出進行收集。

6.固相萃取主要應用

復雜樣品中微量或痕量化合物的分離和富集。如：生物體液，中藥及其代謝產物，食品有效成分或有害成分分析，環(huán)保水樣中各種污染物的分析。

固相微萃?。⊿PE）

優(yōu)點：操作時間短、樣品量小、無需萃取溶劑、適用于揮發(fā)及非揮發(fā)性物質、重現性好。

關鍵：萃取頭涂層選擇，其原則是極性涂層適合于極性化合物，非極性涂層適合于非極性化合物。

氣體萃取（頂空技術）

分類：靜態(tài)頂空和動態(tài)頂空；

優(yōu)點：操作簡單、可自動化、可變條件多、靈敏度高；

衍生化技術優(yōu)點：能夠將一些物質通過衍生轉化為可進入色譜測定的物質；提高檢測靈敏度；改變化合物色譜性能，改善分離度；可以幫助進行化合結構的鑒定。

衍生化技術

柱前衍生應滿足的條件：

1）反應能迅速、定量的進行，反應重復性好，反應條件不苛刻，易操作；

2）反應的選擇性高，最好只與目標化合物反應，即反應的專一性；

3）衍生化反應產物只有一種，反應副產物和過量的衍生化試劑應不干擾目標化合物的分離與檢測；

4）衍生化試劑應方便易得，通用性好。

氣相色譜中常用的衍生方法

1.硅烷化衍生方法

該方法是氣相色譜樣品中應用最多的方法，它是利用含有活性氫的化合物（如醇、酚、酸、胺、硫醇等）與硅烷化試劑反應，形成硅烷衍生物：

R3Si-X+H-R’→R3Si-R’+ HX

能進行硅烷化的化合物反應活性一般為：醇〉酚〉羧酸〉胺〉酰胺，反應活性還受空間位阻的影響，其醇的反應活性為伯醇〉仲醇〉叔醇，胺的反應活性為：伯胺〉仲胺。

2. 酯化衍生方法

一般該法用于將熱穩(wěn)定差，揮發(fā)弱的有機酸轉化為酯。

1）三氟化硼催化

RCOOH+CH3OH=RCOOCH3+H2O

2）重氮甲烷法

RCOOH + CH2N2= RCOOCH3+ N2（非水介質完成）

3）三氟乙酸酐法

RCOOH+R’OH=RCOOR’+H2O

本法適合于空間位阻較大，有機酸、醇或酚的酯化。

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該法能降低羥基、氨基、巰基的極性，改善它們的色譜拖尾，并能提高這些化合物的揮發(fā)性，且能增加某些易氧化化合物（兒茶酚胺）的穩(wěn)定性。

ROH(-NH2，SH)+ R’COX = ROCOR’ + HX

衍生化應注意的問題

1）衍生化完成后，應用干燥氮氣吹走揮發(fā)性溶劑。

2）在使用一些對水敏感的衍生化試劑時，一定要對樣品和使用的溶劑進行脫水，并在反應過程中避免水汽干擾。

3）所用反應容器特別是密封墊片的材料絕對不含目標化合物。

4）當生成的衍生產物是易揮發(fā)化合物時，應采用密封的衍生化容器或低溫冷凍裝置。

5）衍生化完成后應及時進行色譜分析。

中藥樣品中的前處理技術

1.常壓蒸餾技術

樣品前處理：將樣品直接切碎，常壓水蒸汽蒸餾，無水乙醚萃取，旋轉揮發(fā)除去乙醚，用無水硫酸鈉除去水分。

色譜條件：非極性柱，小于10℃/ min升溫至250℃，進樣口溫度：250℃。

2.微波萃取技術

優(yōu)點：常溫強化萃取，不破壞中藥材中某些具有熱不穩(wěn)定、易水解或氧化特征的藥效成分；時間短，一般10～30 min即可獲得最佳提取率；適用性廣，絕大多數的中藥樣品均可超聲萃?。慌c溶劑和目標物的性質（極性）關系不大。

樣品前處理：樣品粉碎、蒸餾水浸泡、微波加熱、水蒸汽蒸餾法提取、經無水硫酸鈉干燥后檢測。

色譜條件：弱極性柱，小于10 ℃/ min升溫速率，終止溫度250℃。

3.超臨界液體萃取技術（SFE）

優(yōu)勢：傳質速度快、滲透能力強、溶解萃取效率高、可在室溫提取熱敏性成分、綠色環(huán)保。

適用范圍：揮發(fā)油、小分子萜類、部分生物堿；通過添加夾帶劑如甲醇、丙酮等增加壓力，可改善流體性質，對中藥生物堿、黃酮類、皂甙類等非揮發(fā)性有效成分的提取也日趨普遍。

4.固相微萃取技術（SPE）

優(yōu)點：無需有機溶劑，操作簡便；易于自動操作；有很好的方法準確度和重現性。

類型：直接萃取法：萃取纖維直接暴露在樣品中，適用于分析氣體樣品；頂空萃取法：纖維暴露于樣品頂空中，適用于固體樣品中的揮發(fā)性以及半揮發(fā)性樣品。

原理：利用殘留農藥與樣品基質的物理化學特性差異，使其從樣品基質中分離出來。

理化特征：化合物極性和揮發(fā)性，其應用分別為：極性主要與化合物溶解性及兩相分配有關，如液液提取，固液提取及液固提??；揮發(fā)性主要與化合物氣相分布有關。

提取劑選擇原則：農藥的極性和水溶性，即相似相溶原理。

農藥極性的大致判斷：分子的極性與分子中的π電子及孤對電子相關。

注意：極性和分子大小是農藥和其它有機化合物水溶性的基礎。如對氧磷溶解度3640 mg/L，而對硫磷只有12.4 mg/L。

農殘分析中的樣品前處理

1.液液提取

液液提取溶劑選擇：選用非極性或弱極性溶劑（如已烷），中等極性農藥可選二氯甲烷。提取原則：少量多次（一般三到五次）。

2.固液提取

溶劑選擇：含水量大的樣品選用與水混溶的溶劑或混合溶劑；含脂肪多的樣品則用非極性或極性弱的溶劑；土壤樣品則用含水溶劑或混合溶劑。

常用方法：索氏提取法、振蕩提取法、組織搗碎法、消化提取法。

3.固相提取法（SPE）

萃取小柱類型：正相吸附劑：硅膠、弗羅里硅土、中性氧化鋁等。

4.固相萃取法

水樣殘留農藥一般是先將農藥保留在柱子上，再用溶劑洗脫；而食品、動植物樣品殘留農藥一般是讓雜質保留在柱子上而農藥通過；對含水量高的果蔬樣品，用水混溶性溶劑提取后，將提取液通過反相柱可把油脂、蠟質等非極性雜質留在柱上而去除。

在農殘分析樣品的提取凈化上，一般都是先用反相柱處理，所用的洗脫劑就是水混溶的溶劑或單獨用水，使親脂的雜質吸附在柱上，而農藥流過柱子。

5.頂空法

吹掃捕集主要用于水樣中揮發(fā)性有機物分析。靜態(tài)頂空法適用于水樣以及其它液態(tài)樣品和固態(tài)樣品分析。

主要應用范圍：EPA使用靜態(tài)頂空/GC測廢水和PVC中的氯乙烯；FDA應用靜態(tài)頂空/GC法測定植物油、合成食品、醋等樣品中的氯乙烯；美國藥典規(guī)定用靜態(tài)頂空/GC方法測藥品中揮發(fā)性有機雜質。

不同形態(tài)樣品的提取方法

1.水樣

對非極性殘留，用非極性溶劑直接萃??；對弱極性的殘留，可以按如下步驟：

1）增加提取劑的量；

2）選用極性稍強溶劑如乙酸乙酯；

3）在水中加入氯化鈉，使其鹽析出來；

4）調整溶液PH：如分析物是酸性的，調PH至3左右；如分析物是胺，用氨水調PH至10左右。

2.植物和動物樣品

一般采用溶劑提取法，如振蕩法、組織搗碎法。提取溶劑一般可用水溶性的乙腈、丙酮、甲醇等，可以減少脂類物質。

3.土壤樣品

用水將樣品濕潤（含水量約5%），然后用強極性溶劑或混合溶劑進行提取，較多使用振蕩法、索氏提取法。百草枯及其聯吡啶除草劑提取時用強酸消化處理。 LP

本文資料由《實驗與分析》編輯整理。