文/ Koen Sandra

自動化的液體分餾

文/ Koen Sandra

利用SPE實現(xiàn)液體分餾的自動化

在對新陳代謝學(xué)的研究中，常常要面對大量檢測樣本，以便能從樣本集中找出統(tǒng)計學(xué)差異?，F(xiàn)如今，樣本制備的自動化給我們帶來了很多驚喜，也許能夠幫助您降低檢測波動的幅度。

新陳代謝學(xué)的典型研究過程中，包含了大量的不同工作步驟，例如提取、分餾或純化、衍生化、分析物的濃縮，尤其是生物樣本分子（MG＜2000）的濃縮，例如微生物、植物、動物和人類分子樣本的濃縮。這些工作步驟需要采用氣體或液體色譜分離系統(tǒng)（GC/LC）和質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）聯(lián)用。為了能夠區(qū)分所采集樣本的類型就需要相對較大的樣本集，在進行樣本的檢測分析時最重要的就是分析波動范圍應(yīng)盡可能小，小于自然狀態(tài)下生物變異的差異。現(xiàn)如今，樣本制備過程的自動化能夠幫助您提高檢測分析方法的重復(fù)精度。就超聲波支持的液體自動萃取和Gestel公司研發(fā)生產(chǎn)的MPS型多功能樣本前處理工作站的過濾問題本文暫不討論。本文主要介紹基于SPE的自動化分餾工藝，一種在脂類組學(xué)研究框架內(nèi)使用的分餾工藝技術(shù)。

在所考察的脂類組學(xué)中，所研究的是植物材料的特性以及它們所含有的類脂質(zhì)，包括中性脂（NL）、游離脂肪酸（FF）和極性脂（PL）。同樣令人感興趣的是其組成成分之間基本的定量比例關(guān)系。上述的植物材料中，同類化合物中有著明顯的濃度差異。在前面所述的檢測試驗中，不同脂類在前期LC/MC過程中的分餾和濃縮富集對最終結(jié)果的判定發(fā)揮了積極的作用。

首先，在所謂的福爾奇方法（Folch法）通過液-液萃?。‵FE）裝置獲取濃縮的脂類組萃取物。這一步在使用氨丙基色譜柱（NH2）獲得固相萃取物（SPE）后結(jié)束；在這一檢測分析步驟中，我們獲得了三種不同的極性脂質(zhì)分餾物。所有的萃取物自動富集到合適的濃度，并利用LC-QTOF四極桿飛行時間液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行分析。

圖1.按照SPE固相萃取分餾技術(shù)和MVAP多點蒸發(fā)濃縮重組植物萃取液（A、B、C為三種不同的植物種類）。

多功能樣本前處理工作站

上面介紹的所有操作步驟都是在MPS型多功能樣本前處理工作站以及在計算機的支持下全自動完成。我們都知道，實驗中，很容易因為更換所需工具而延誤時間，或者因?qū)嶒炇夜ぷ魅藛T沒有注意到一些細(xì)節(jié)而影響試驗進度。本文介紹的系統(tǒng)中，MPS工作站有兩根可以在三維方向上運動的機械臂，這一工作站可以配用不同規(guī)格型號的注射器，以及有目的地處理不同液體和不同容積的樣本。

工作站的這一套裝備配置再加上一些相關(guān)的技術(shù)功能，可大大擴展工作站的用途，使其更高效地完成檢測分析任務(wù)。MPS多功能樣本前處理工作站還有一個特殊的專用模塊MVAP多點蒸發(fā)站，它能自動將萃取物在真空環(huán)境下干燥，從而保證了在其恢復(fù)時仍能保持較小的的溶劑體積。

脂類的提取是按照下述方式進行的：1 g的植物材料置入氯仿和甲醇（2：1）的混合液中進行萃取。在溶液定量中加入4 ml水，取出1.5 ml的氯仿過濾、灌入小瓶中，然后在MVAP多點蒸發(fā)站中蒸發(fā)溶液的水分。將萃取物放入300 μl氯仿中，在NH2相中調(diào)出SPE固相萃取物、以便在LC/MS分析中測定出其所含有的類脂質(zhì)。

加入由氯仿和異丙醇按2∶1的比例混合而成的3 ml溶液，從NH2相中洗脫出中性脂NL。在分餾游離脂肪酸（FF）時使用的是含有2%乙酸的二乙醚溶液；而極性脂質(zhì)的萃取使用了3 ml的甲醇。若不同脂類組萃取物的所有SPE固相萃取都是手動進行的，則整個萃取工作需要耗費很長時間才能完成。但如果是在全自動化系統(tǒng)下進行，就能夠大大提高檢測效率。據(jù)悉，它允許無人值守的工作過程，包括在夜間和周末的時間里自動完成。

表1.脂類組學(xué)檢測分析方法的精度，包括自動化樣本制備的步驟

三組分餾物匯總放入10 ml的安瓿瓶中，在MVAP工作站中進行干燥。殘留物的清理和隨后的液相色譜/質(zhì)譜分析是在氯仿和異丙醇的溶液中進行的。所需的溶液量多少根據(jù)脂類的濃度在萃取過程中進行優(yōu)化。

在萃取分析時使用的是Agilent 1290 UHPLC系統(tǒng)與6540 QTOF相連接的檢測系統(tǒng)。LC分離系統(tǒng)流動相為含有20 mM甲酸銨的甲醇水溶液，色譜柱為反相柱C18。整個檢測流程采用了液相色譜/質(zhì)譜分析方法，分別設(shè)置多種不同的溶劑梯度和質(zhì)譜條件進行分析，方法之間的不同點為：第一種方法是利用ESI POS電噴霧離子化測定陽離子；第二種是ESI NEG電噴霧負(fù)離子法；第三種則是ESI POS和ESI NEG兩種方法的組合。

成功地利用自動化

在一項植物脂類組學(xué)研究中利用上述自動化檢測分析方法對共計84份樣本進行了檢測分析。樣本組由三大類共計22種不同的植物樣本組成，每一份都一式三份的進行了樣本制備和檢驗分析。另外還分析了18個QC質(zhì)量控制樣本，以便對樣本制備以及LC/MS的重復(fù)精度進行評估。

檢測的項目為：A檢測記錄曲線顯示的是單甘酯（MGS）、甘油二酯（DGs）、甘油三酯（TGS）和植物固醇；B檢測記錄曲線顯示的是在ESI-NEG電噴霧負(fù)離子法檢測中，分餾2中存在的LCFAs長鏈游離脂肪酸；C和D檢測記錄曲線表示的是在ESI-POS電噴霧離子化和ESI-NEG電噴霧負(fù)離子檢測方法中檢測到的磷脂Pls、鞘脂和其他極性脂質(zhì)（參見圖2）。

圖2.不同SPE固相萃取在LC-QTOF四極桿飛行時間液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測中得到的離子色譜總圖。

圖3.Gestel研 發(fā)生產(chǎn)的雙機械臂MPS型多功能樣本前處理平臺,用于自動化固相萃取SPE和樣本萃取物濃縮。

為了能夠評估檢測的分析精度，選了一系列經(jīng)過鑒定的化合物作為對照組，并計算出峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。在脂類組學(xué)研究中，用于面積相對偏差值的測試值（Cut-off臨界值）一般為30%。值得注意的是，在對照組檢查的18個QC質(zhì)量控制樣本中，所有分析物的面積相對偏差都小于25%，其中半數(shù)甚至小于12%。

自動化樣本制備的實現(xiàn)

Gestel公司MPS型多功能樣本前處理平臺，非常適用于代謝組學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)以及研究，因其能夠保證實現(xiàn)樣本制備的自動化。正如上文中植物類脂質(zhì)的檢測過程一樣，一種基于SPE固相萃取的脂質(zhì)分餾技術(shù)在專用的參數(shù)配置下實現(xiàn)了完全自動化，包括利用溶劑揮發(fā)使SPE固相萃取分餾物濃縮。分餾物的LC/QTOF分析表明了檢測結(jié)果有非常好的重復(fù)性。 LP

脂類組學(xué)

脂類組學(xué)所研究的對象是細(xì)胞或者有機體中基本不溶于水（疏水性）的天然物質(zhì)，也就是脂質(zhì)，它們是細(xì)胞膜的主要組成部分。與側(cè)重于所有蛋白質(zhì)總和的蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比較，脂類組學(xué)采用分析技術(shù)方法來檢測脂質(zhì)總體中的生物體并確定它們的功能。在這一背景下，質(zhì)譜技術(shù)被認(rèn)為是最合適的檢測方法了。脂類組學(xué)的目的是：了解脂質(zhì)在代謝紊亂疾病中起著什么樣的作用，例如在如肥胖癥、動脈粥樣硬化、中風(fēng)、高血壓或糖尿病中的作用。

圖3.Gerstel公司基于MPS技術(shù)的DBS自動進樣器（左）和SPExos模塊（右）與LCMS-MS（圖中未出現(xiàn)）直接耦合。

Lerch博士表示，在采集樣本質(zhì)量為16 μg時，從質(zhì)譜柱中出來的分析物的絕對質(zhì)量有4～120 pg，適合于最小的校驗儀使用?？偠灾?，它為法醫(yī)毒理學(xué)的檢測分析提供了足夠的線性檢測范圍，其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值只有8%。據(jù)應(yīng)用技術(shù)專家介紹，目前MPS-DBSSPExos-LC/M系統(tǒng)，正在越來越多的被應(yīng)用于興奮劑檢測領(lǐng)域中。 LP

本文作者來自Kortrijk市色譜技術(shù)研究所。