文/ Paula Clarke

藥物分析蒸發(fā)法的評估

文/ Paula Clarke

取證實驗室溶劑蒸發(fā)法的替代解決方案

所有在取證實驗室檢測的藥物和代謝物，都要先得到聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室規(guī)定的MRPL最低執(zhí)法限量值，本文中，愛爾蘭科學家們對藥物分析中所使用的蒸發(fā)法適用性進行了考察。

愛爾蘭某高級別取證實驗室（FSI）開發(fā)了一項從尿樣中提取藥物成分的方法。此法是利用固相萃?。⊿PE）和高效液相色譜-質譜微量元素分析法進行篩選分析的。在固相萃取過程中，含有提取分析物的洗脫液必須全部被蒸發(fā)、干燥。

在取證、驗證的框架內(nèi)，F(xiàn)SI取證實驗室對Genevac EZ2臺式蒸發(fā)器系統(tǒng)作為溶劑蒸發(fā)的替代解決方案進行了測試。之所以選擇這種蒸發(fā)法是因為它不同于傳統(tǒng)的吹掃蒸發(fā)法，無需使用氣體材料（比如說氮氣）。另外，它的使用操作和樣本的重建也比較簡單。

圖1.這些樣本在經(jīng)過前處理后，將在LC-MS/MS微量元素分析儀中進行檢測分析。

如何制備檢驗樣本？

向1 ml尿液樣本中加入500 μl的β-葡糖醛酸糖苷酶（在0.1M的醋酸緩沖液中），60℃溫度環(huán)境中培育1.5～2 h。然后加入100 μl氘化的標準溶液。離心機以13000 r/min離心2 min后取出上清液，通過加入1 ml的硼酸鹽緩沖劑將溶液的酸堿度調(diào)整到PH值約為9。

利用固相萃取柱（3 ml，60 mg）按照下述步驟進行SPE固相萃?。?/p>

■正常化處理：3 ml甲醇；

■平衡作用：3 ml水；

■加載：加入被測樣本；

■洗滌：5%的甲醇3 ml；

■50 PSI高壓，吸附床干燥5 min；

■中斷溶劑供給；

■提?。? ml甲醇；

■提?。杭状?、異丙醇（比例為3：1）的混合液1 ml；

■用最高壓力去除殘留的洗脫液。

按照這種方法可以獲得6 ml的洗脫液。這些洗脫液完全烘干，放入200 μl的稀釋劑中，在高效液相色譜-質譜微量元素分析儀中進行分析。

與傳統(tǒng)蒸發(fā)法的比較

傳統(tǒng)的蒸發(fā)方法是氮氣吹掃系統(tǒng)。氮氣吹掃蒸發(fā)后SPE固相萃取的洗脫液在收集管的管壁上。由于提取物的重建容積只有200 μl，因此總分析物的再懸浮是非常困難的。為了最大程度提高提取量，蒸發(fā)也應在質譜分析柱中進行；為此，需要將6 ml洗脫液以2 ml等分注入到質譜分析柱中，在三相狀態(tài)下完全干燥。

EZ-2就是一種能夠在真空低溫狀態(tài)下使溶劑沸騰蒸發(fā)的離心蒸發(fā)器。蒸發(fā)過程中，樣本受到的離心力大約500G，從而有效的避免了突然沸騰，也避免了突然沸騰帶來的交叉污染可能性，因為不同的樣本在同一時間被同時干燥了。由于分離是利用離心力進行的，因此干燥的分析物會留在分析柱的底部，這就使得用量少的分析物進行重構成為可能。這種EZ2型蒸發(fā)器允許共計6 ml的洗脫液干燥，以及后來200 μl稀釋劑的重建也是直接在固相萃取柱中完成。EZ2蒸發(fā)器的性能要從所要求的最低執(zhí)法極限、樣本完整性和交叉污染的風險等方面進行評估。

最低執(zhí)法極限試驗：取證實驗室FSI利用LC-MS/MS進行尿液檢測的方法，在藥物檢驗領域中有著非常廣泛的應用。利用EZ2蒸發(fā)器，所有在取證實驗室檢測的藥物和代謝物都能達到聯(lián)合國毒品和犯罪問題辦公室規(guī)定的MRPL最低執(zhí)法限量值。

取證實驗室FSI的研究還表明：Genevac公司的EZ2型蒸發(fā)器能夠達到比傳統(tǒng)蒸發(fā)方式更高的靈敏度。例如，利用EZ2蒸發(fā)器對氨基氟硝西泮、嗎啡、安非他明、芬納西泮和其他化合物進行檢測時能夠以比其他檢測方法很高的靈敏度實現(xiàn)聯(lián)合國禁毒辦建議的MRPL最低執(zhí)法限量。

樣本完整性試驗：在這一研究中，傳統(tǒng)的吹掃蒸發(fā)設備與EZ2型蒸發(fā)器同時工作。在傳統(tǒng)的吹掃蒸發(fā)技術中，蒸發(fā)是在45℃時開始的。在EZ2蒸發(fā)器中，蒸發(fā)在40℃時就開始了，對樣本的完整性沒有影響，另外EZ2蒸發(fā)器的蒸發(fā)時間縮短了一半。

交叉污染試驗：在這一試驗研究框架內(nèi)，要確定Genevac EZ2蒸發(fā)器在含有藥物尿液樣本與經(jīng)常性檢查的性侵犯尿液樣本，兩者在蒸發(fā)過程中是否會出現(xiàn)交叉污染。對多種不同藥物的尿液進行了固相萃取，然后在EZ2型蒸發(fā)器中完全干燥。每一個尿液樣本含有43種藥物或者代謝物，它們的濃度在500 ng/ mg左右（6種氘代物詳細內(nèi)容請登錄laborpraxis.de查閱）。含有提取的尿液樣本洗脫液的6 ml溜出物收集管插在樣品架內(nèi)，收集管的外面是只含有稀釋劑的溜出物收集管，即所謂的“空白樣本”。所有樣本（有尿液的樣本和空白樣本）在EZ2蒸發(fā)器中完全干燥，在稀釋劑中重組，進入高效液相色譜-質譜分析儀中檢測分析。有尿液的樣本中，所有的藥物和代謝物都能夠被檢查出來，結果顯示，圍繞尿液樣本的空白樣本都是陰性。這就充分證明：在EZ2蒸發(fā)器的蒸發(fā)過程中沒有交叉污染。

圖2.藥物分析用EZ2型蒸發(fā)器的性能要從最低執(zhí)法極限值、樣本完整性和避免交叉污染三個方面來考察。

作為實驗室常規(guī)檢驗方法

愛爾蘭FSI取證研究所的試驗證明：利用EZ2蒸發(fā)器進行蒸發(fā)的檢驗方法是合理的，且蒸發(fā)過程可以更快完成，能夠保持樣本的完整性。除此以外，還可以毫無交叉污染風險地提高檢測的靈敏度。因此，利用EZ2蒸發(fā)器進行蒸發(fā)法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的蒸發(fā)方式，這代表它將有可能作為實驗室常規(guī)檢驗方法，進入到實驗室日常工作之中。 LP

稀釋劑和溫度

去除稀釋劑的系統(tǒng)利用熱能來使稀釋劑蒸發(fā)。雖然熱與溫度有著密切的關系，但它們不是同義詞，并且它們之間有著重要區(qū)別。熱量的檢測單位是焦耳，檢測的是熱能；溫度則表示的是熱能的強度，也就是說：某個物體是冷還是熱。一般來講，對熱敏感的樣本對溫度也都非常敏感；大多數(shù)樣本都能加熱而不影響其質量，只要溫度在規(guī)定的極限溫度范圍內(nèi)。一個系統(tǒng)中的真空設備能夠把稀釋劑的沸點降低，降低到液體在不會對樣本質量產(chǎn)生影響的情況下就會蒸發(fā)。

本文作者來自愛爾蘭取證研究所。