王 荻,劉紅柏

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

施氏鱘抗熱應(yīng)激中草藥免疫制劑的篩選

王 荻,劉紅柏

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江哈爾濱150070)

為篩選適用于鱘使用的抗熱應(yīng)激中草藥免疫制劑,研究了中草藥方劑對(duì)常溫及高溫應(yīng)激情況下施氏鱘AcipenserschrenckiiBrandt免疫性能的影響。在22℃養(yǎng)殖水溫下,將1+齡施氏鱘分為4個(gè)受試組,每組設(shè)兩個(gè)平行,每個(gè)平行放30尾鱘,選取當(dāng)歸、魚腥草和一種自組中草藥復(fù)方(方四),分別以0.30、0.54、0.80 g/kg(體質(zhì)量)的給藥劑量對(duì)試驗(yàn)鱘口灌給藥,每日1次,連續(xù)給藥14 d,同時(shí)設(shè)立口灌蒸餾水的對(duì)照組;停藥24 h后,每組取半數(shù)試驗(yàn)鱘于高溫30℃下熱刺激2 h后,與常溫試驗(yàn)組共同采樣,對(duì)試驗(yàn)鱘血清中蛋白含量、細(xì)胞吞噬和不同組織中溶菌酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:方四和魚腥草能有效抑制機(jī)體高溫應(yīng)激后血清中蛋白含量的異常增高;常溫情況下,當(dāng)歸具有提高試驗(yàn)鱘細(xì)胞吞噬功能的作用;而方四不僅可以有效提高高溫應(yīng)激后機(jī)體的細(xì)胞吞噬作用,還可有效提高肝、血清、鰓和胃組織中的溶菌酶活性,并能在高溫應(yīng)激后保持其效果。研究表明,高溫應(yīng)激情況下,方四能有效保持施氏鱘機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡,并促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞的吞噬作用和溶菌酶活性,可作為鱘抗熱應(yīng)激中草藥免疫制劑進(jìn)行深入研究。

施氏鱘;中草藥;抗熱應(yīng)激

作為變溫低等脊椎動(dòng)物的魚類極易受水溫變化的影響,喜低溫的魚類對(duì)高溫尤其敏感[1]。溫度作為控制因子,對(duì)魚類代謝反應(yīng)速率起著控制作用,并影響其生理生化進(jìn)程[2]。有報(bào)道指出,鱘最高生存溫度為30℃,水溫高于28℃時(shí)其攝食與生長(zhǎng)均會(huì)減緩或停止[3]。而施氏鱘Acipenser schrenckiiBrandt適宜生長(zhǎng)水溫為15～27℃[4],屬亞冷性魚類,高溫會(huì)使其產(chǎn)生消化酶活性降低[5]、非特異性免疫受抑制[6]等負(fù)面作用,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致鱘大量死亡。

施氏鱘俗稱七粒浮子,主要分布于中國(guó)黑龍江流域,具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快、成活率高、病害少、肉味鮮美和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn),并已開(kāi)展海水馴養(yǎng)研究,是中國(guó)現(xiàn)存鱘魚中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)珍稀品種之一[7]。20世紀(jì)90年代,鱘養(yǎng)殖技術(shù)獲得成功并迅速推廣,1998—2002年鱘養(yǎng)殖量增加了50倍[8]。但由于養(yǎng)殖條件受限、環(huán)境污染,以及運(yùn)輸脅迫造成的高溫應(yīng)激等原因,經(jīng)常會(huì)引起魚類強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng),損害魚體健康,甚至造成死亡,給鱘養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的損失和困擾。

中草藥不僅可單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合使用以提高水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體免疫力,還具有種類多、價(jià)格廉、副作用小、無(wú)殘留等諸多優(yōu)點(diǎn),已成為替代抗生素、激素等化學(xué)藥物的無(wú)公害免疫添加劑的研發(fā)熱點(diǎn)。中國(guó)中草藥品種居世界之首,多達(dá)5767種[9],現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)200余種中草藥具有良好的免疫活性,可影響和調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能[10]。目前,有關(guān)中草藥添加劑對(duì)畜[11-12]、禽[13-14]等抗熱應(yīng)激研究較多,并已在實(shí)際應(yīng)用中取得了良好效果,但在水產(chǎn)動(dòng)物方面的研究[15]極少,且仍停留在初始基礎(chǔ)性研究階段。本研究中,擬探討高溫應(yīng)激情況下,兩種中草藥單方及一種自組中草藥復(fù)方免疫添加劑對(duì)施氏鱘非特異性免疫能力的影響,以篩選適用于養(yǎng)殖鱘使用的抗熱應(yīng)激中草藥免疫添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用健康非免疫狀態(tài)下1+齡施氏鱘體質(zhì)量為(92±4.73)g,購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院鱘魚繁育技術(shù)工程中心。試驗(yàn)用中草藥均購(gòu)自哈藥集團(tuán)世一堂藥店,烘干粉碎后備用;溶菌酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;嗜水氣單胞菌Aeromonashy drophila(Ah)菌株為黑龍江水產(chǎn)研究所鑒定保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 中草藥水煎劑的制備 將所選魚腥草、當(dāng)歸和方四(以黨參、白術(shù)為主藥,茯苓、當(dāng)歸等為輔藥)準(zhǔn)確稱取,放入砂鍋中,加水浸泡30 min,分別以30、45 min熬制兩次,合并所得藥汁后再濃縮成100 mL[其中1 mL藥液相當(dāng)于1 g藥方(干物質(zhì))的水煎劑],高壓滅菌后于冰箱(4℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中每組設(shè)兩個(gè)平行,每個(gè)平行放30尾試驗(yàn)鱘,于室內(nèi)循環(huán)水族箱(22℃)中暫養(yǎng)兩周,每天按魚體質(zhì)量的2.0％投喂全價(jià)基礎(chǔ)飼料。

暫養(yǎng)結(jié)束后,按照魚腥草、當(dāng)歸、方四分別為0.54、0.30、0.80 g/kg(體質(zhì)量)的給藥劑量對(duì)試驗(yàn)鱘進(jìn)行口灌給藥,每日1次,連續(xù)14 d。停藥24 h后,從各組分別取半數(shù)試驗(yàn)鱘于30℃控溫水族箱中熱刺激2 h。自試驗(yàn)鱘尾動(dòng)(靜)脈采血,并解剖取其鰓、肝、幽門盲囊、胃、腸等組織樣品,立即于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算 試驗(yàn)鱘血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量均采用Beckman公司生產(chǎn)的CYNCHRON CH4PRO全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。參照王樹(shù)芹等[16]的方法測(cè)定白細(xì)胞吞噬率,計(jì)算公式為

吞噬率=參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)/100個(gè)白細(xì)胞×100％,

吞噬指數(shù)=白細(xì)胞吞噬的嗜水氣單胞菌數(shù)/參與吞噬的白細(xì)胞數(shù)。

準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)鱘各組織樣品與預(yù)冷的生理鹽水按質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9稀釋,充分勻漿后,離心,取上清液,將血清在37℃下水浴融化后,參照劉紅柏等[17]的方法檢測(cè)溶菌酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行組間比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘血清中蛋白含量的變化

分別檢測(cè)各試驗(yàn)組常溫及高溫應(yīng)激后血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLU)含量的變化,并計(jì)算白蛋白與球蛋白比例(ALB/ GLU),結(jié)果如表1所示。從表1可見(jiàn):高溫應(yīng)激組鱘血清中TP、ALB、GLU含量和ALB/GLU均高于相對(duì)應(yīng)的常溫組;高溫應(yīng)激后,TP、ALB、GLU含量的最大值均出現(xiàn)在對(duì)照組,而最小值均出現(xiàn)在魚腥草組。多重比較結(jié)果表明:方四和魚腥草組試驗(yàn)鱘高溫應(yīng)激后ALB、GLU含量和ALB/GLU均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);當(dāng)歸組常溫下TP和GLU含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而ALB/ GLU和高溫下ALB含量則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表1 各組試驗(yàn)鱘TP、ALB、GLU含量及ALB/GLU值的變化Tab.1 Changes in content of TP,ALB,GLU and ALB/GLU value in Amur sturgeonAcipenser schrenckiiin the experim ent

2.2 鱘白細(xì)胞吞噬作用的變化

從表2可見(jiàn):高溫應(yīng)激后,對(duì)照組和方四組試驗(yàn)鱘白細(xì)胞吞噬率、吞噬細(xì)菌數(shù)和吞噬指數(shù)均高于常溫組,而當(dāng)歸、魚腥草組則相反,均低于相對(duì)應(yīng)的常溫組;3個(gè)測(cè)定指標(biāo)常溫組的最大值均出現(xiàn)在當(dāng)歸組,最小值均出現(xiàn)在方四組,而高溫應(yīng)激組的最大值均出現(xiàn)在方四組,最小值均出現(xiàn)在魚腥草組;4個(gè)試驗(yàn)組常溫及高溫應(yīng)激后白細(xì)胞吞噬率均未形成顯著性差異(P＞0.05),但當(dāng)歸和魚腥草組常溫情況下,吞噬細(xì)菌個(gè)數(shù)和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照組和方四組(P＜0.05),而高溫應(yīng)激后則顯著低于對(duì)照組和方四組(P＜0.05)。

表2 試驗(yàn)鱘白細(xì)胞吞噬作用變化情況Tab.2 Changes in cell phagocytosis in Amur sturgeonAcipenser schrenckiiin the experiment

2.3 鱘各組織中溶菌酶活性的變化

從表3可見(jiàn):對(duì)照組鱘各組織中溶菌酶活性表現(xiàn)為肝＞血清＞鰓,高溫應(yīng)激后,各試驗(yàn)組鱘的血清、肝和鰓中溶菌酶活性均低于相應(yīng)的常溫組;常溫及高溫應(yīng)激后,3種組織中溶菌酶活性最大值均出現(xiàn)在方四組,血清和肝中最小值出現(xiàn)在當(dāng)歸組,而鰓中最小值則出現(xiàn)在對(duì)照組。多重比較結(jié)果表明:常溫及高溫應(yīng)激后,方四和魚腥草組的血清和鰓中溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);而當(dāng)歸組血清和肝中溶解酶活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),鰓中溶菌酶活性則顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

從表4可見(jiàn),對(duì)照組鱘消化道組織中溶菌酶活性表現(xiàn)為腸＞幽門盲囊＞胃,高溫應(yīng)激后,各試驗(yàn)組鱘3種組織中溶菌酶活性均低于相應(yīng)的常溫組。多重比較結(jié)果表明:常溫及高溫應(yīng)激后,方四組胃溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而腸中則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);當(dāng)歸組幽門盲囊和腸中溶菌酶活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),而胃中則顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);魚腥草組幽門盲囊中溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而腸中則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表3 試驗(yàn)鱘血清、肝和鰓中溶菌酶活性變化情況Tab.3 Changes in lysozyme activities in serum,liver and gill of Amur sturgeonAcipenser schrenckiiin the experiment

表4 試驗(yàn)鱘幽門盲囊、胃和腸中溶菌酶活性變化情況Tab.4 Changes of lysozyme activities in pyloric caecum,stomach and intestine of Amur sturgeonAcipenser schrenckiiin the experiment

3 討論

有研究表明,影響魚體免疫功能的因素很多,其中影響最大的是環(huán)境因素中的溫度[18-20]。適度的應(yīng)激對(duì)機(jī)體有利,但過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的應(yīng)激對(duì)機(jī)體有害,會(huì)打破魚類與環(huán)境間的平衡,引起生理和免疫反應(yīng)的變化[21]。高水溫可導(dǎo)致鱘機(jī)體白細(xì)胞吞噬能力下降,產(chǎn)生抗體“無(wú)效免疫”,從而顯著抑制鱘的非特異性免疫[7]。

3.1 中草藥免疫制劑對(duì)血清蛋白含量的影響

總蛋白是血清的重要組成部分,在機(jī)體免疫反應(yīng)中起著重要作用[22],血清中總蛋白、白蛋白和球蛋白水平的變化可作為反映魚體應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激時(shí)自身免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,高溫?zé)釕?yīng)激后,試驗(yàn)鱘血清內(nèi)總蛋白、白蛋白、球蛋白含量和白蛋白/球蛋白值均有所上升,此結(jié)果可能與魚體應(yīng)激時(shí)需要大量分解組織中儲(chǔ)存的能量來(lái)滿足生理需要有關(guān)[24],表明機(jī)體對(duì)高溫應(yīng)激做出了應(yīng)激反應(yīng),促使血液中作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體、機(jī)體蛋白質(zhì)來(lái)源的白蛋白[25]和具有免疫功能的球蛋白[26]含量升高。本試驗(yàn)中,3個(gè)給藥組試驗(yàn)鱘高溫應(yīng)激后血清中蛋白含量的上升幅度均小于對(duì)照組,表明中草藥制劑有效抑制了機(jī)體的異常激烈反應(yīng),降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的異常消耗,維持了機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡,其中方四和魚腥草效果尤其明顯。

3.2 中草藥免疫制劑對(duì)白細(xì)胞吞噬作用的影響

吞噬作用是動(dòng)物非特異性免疫功能的重要組成部分,吞噬細(xì)胞在魚類防御外來(lái)微生物感染過(guò)程中必不可少[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,受高溫?zé)釕?yīng)激影響,試驗(yàn)鱘白細(xì)胞吞噬率、吞噬細(xì)菌數(shù)和吞噬指數(shù)升高,與已報(bào)道的水溫適當(dāng)升高可促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的吞噬作用相一致[28],但也有報(bào)道指出,溫度過(guò)高或過(guò)低會(huì)對(duì)吞噬作用產(chǎn)生抑制性影響[29]。本試驗(yàn)常溫情況下,吞噬率、吞噬細(xì)菌數(shù)和吞噬指數(shù)3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的最高值均出現(xiàn)在當(dāng)歸組,表明當(dāng)歸可有效提高試驗(yàn)鱘細(xì)胞吞噬功能,此結(jié)果與陳孝煊等[27]、林旋等[30]報(bào)道的大黃、黃芪多糖等中草藥及其有效成分能提高魚體細(xì)胞吞噬作用的結(jié)果相一致;而高溫?zé)釕?yīng)激后,當(dāng)歸促進(jìn)作用減弱,檢測(cè)指標(biāo)的最大值均出現(xiàn)在方四組。這表明常溫情況下,當(dāng)歸可促進(jìn)機(jī)體吞噬作用,而方四具有有效提高高溫?zé)釕?yīng)激后機(jī)體細(xì)胞吞噬作用的效果,能提高機(jī)體抗高溫應(yīng)激能力,并維持機(jī)體的高免疫力狀態(tài)。

3.3 中草藥免疫制劑對(duì)機(jī)體組織溶菌酶活性的影響

溶菌酶是水生動(dòng)物血淋巴細(xì)胞酶系統(tǒng)中的重要組成部分,是機(jī)體應(yīng)對(duì)細(xì)菌病原體感染的重要防御屏障,可反映機(jī)體非特異性免疫水平的變化[31]。本試驗(yàn)中,與已報(bào)道的魚體受急性應(yīng)激時(shí)肝臟受損、血清中溶菌酶活力會(huì)顯著上升[26]的結(jié)果不同,高溫?zé)釕?yīng)激后試驗(yàn)鱘組織中溶菌酶活性均低于常溫試驗(yàn)組。試驗(yàn)所選方四能有效提高肝、血清、鰓和胃組織中的溶菌酶活性,這與已報(bào)道的中草藥復(fù)方具有提高魚體溶菌酶活性[32]的結(jié)果相一致;且在高溫應(yīng)激后仍能保持其效果,對(duì)保持鱘機(jī)體抗病力,抵抗熱應(yīng)激脅迫具有較好作用。魚腥草和當(dāng)歸雖然也能提高部分鱘組織中(如血清和鰓)溶菌酶活性,但對(duì)其他組織酶活性無(wú)顯著影響,甚至有抑制作用,其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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Screening of Chinese herbalmedicines related to anti-heat stress in Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandt

WANG Di,LIU Hong-bai
(Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

Effects of several Chinese herbal medicines on immune ability of 1+old Amur sturgeonAcipenser schrenckiiBrandtwere investigated at normal and high temperature to screen anti-heat stress Chinese herbalmedicines in Amur sturgeon culture.Amur sturgeon were divided into 4 groups at a density of30 fish in one group and orally administrated by Chinese herbalmedicinesAngelica sinensis,Houttuyniacordataand prescription IV(PIV)at a dose of0(distilled water,as control group),0.30,0.54 g/kg or0.80 g/kg body weightonce a day for14 d with duplication.After the withdrawal of 24 h,half of the fish in each group were thermally stimulated at30℃for 2 h and then the bloodswere sampled together with the normal temperature groups at22℃.The protein contents,cell phagocytosis in serum and lysozyme activities in several tissues were detected.The results showed that PIV andHouttuyniacordataeffectively inhibited the increase in serum protein levels in the fish exposed to the heat stress. The phagocytosis function was improved in the fish under normal temperature byAngelica sinensis,while PIV led to effectively increase the cell phagocytosis,and to effectively improve the lysozyme activities in liver,serum,gill and stomach and homeostasis in the fish under high temperature.In summary,it is conferred that PIV effectivelymaintains homeostasis and promotes cell phagocytosis and lysozyme activity,being used as the anti-heat stress Chinese herbalmedicine for further study.

Acipenser schrenckiiBrandt;Chinese herbalmedicine;anti-heat stress

Q954.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.009

2095-1388(2016)06-0635-05

2016-03-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203085)

王荻(1980—),女,博士,助理研究員。E-mail:wangdi_2014@163.com

劉紅柏(1970—),女,博士,研究員。E-mail:liuhongbai@sina.com