欒玉靜，覃華開，王瑞花，董 穎，杜鴻雁

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物證鑒定所，廣西 柳州 545001）

液相色譜-質譜法檢驗人血漿中的沙丁胺醇

欒玉靜1，覃華開2，王瑞花1，董 穎1，杜鴻雁1

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.柳州市公安局物證鑒定所，廣西 柳州 545001）

目的建立人血漿中沙丁胺醇的液相色譜-質譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）檢驗方法。方法采用HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm, 1.7 μm），流動相為甲醇-0.1 %甲酸水，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，采用UPLCMS/MS方法測定血漿中沙丁胺醇。結果人血漿中沙丁胺醇在1～1000 ng/mL范圍內與峰面積比呈良好線性關系，最低檢測限為0.1 ng/mL，方法回收率大于70 %，日內及日間精密度均小于10 %。結論經過多起案件的驗證，所建立的方法簡便、易于操作，且靈敏度高，能用于血漿中沙丁胺醇的檢驗。

液相色譜-質譜；人血漿；沙丁胺醇

沙丁胺醇（salbutamol）是一種選擇性β2-腎上腺素能受體興奮劑，對支氣管平滑肌有特異性的擴張作用，臨床上用于治療支氣管哮喘，具有抗炎、抗過敏及免疫作用。大劑量服用此藥會產生中樞神經系統(tǒng)興奮，被用作運動員的刺激劑。因而，國際奧委會對運動員尿液中的沙丁胺醇檢出量作了規(guī)定。同時，該藥由于與鹽酸克倫特羅結構相似，且其在體內的半衰期較短，毒性作用較弱，因而逐步被用到養(yǎng)殖業(yè)以提高飼料轉化率和瘦肉率。雖然很多國家包括我國已經將沙丁胺醇列為禁用品種，但是仍有很多不法商販在飼料中添加沙丁胺醇。國內外均發(fā)生過因過量食用含沙丁胺醇的畜產品而導致的群體性中毒事件。中毒者會出現(xiàn)震顫、心悸等反應，還可能出現(xiàn)肌肉痙攣、過敏等癥狀，尤其對心臟和肝腎毒性較大。沙丁胺醇容易蓄積于眼角膜，尿液、血液、肝、腎、肺、肌肉中也容易殘留。

目前，國內常見的檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、熒光光度法[1]、電化學方法[2]、薄層色譜法、液相色譜法[3-5]和氣相色譜法等。由于沙丁胺醇親水性較強[6]，血漿藥濃度低，因而需要建立靈敏度高的檢測方法。液相色譜-質譜法具有靈敏度高、檢出限低等特點，適用于人血中沙丁胺醇的檢測。本研究建立了快速沉淀蛋白結合液相色譜-質譜測定人血漿中沙丁胺醇的方法，為沙丁胺醇在臨床應用以及非法使用中的檢驗鑒定提供有效的方法。

1 儀器與試劑

Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)及化學工作站，Xevo TQ質譜檢測器；沙丁胺醇標準品（中國藥品生物制品檢驗所）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，F(xiàn)isher）；去離子水（Millipore）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm× 50 mm，1.8 μm）（Waters）；流動相A：0.1 %甲酸水；流動相B：甲醇；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫方式見表1所示；柱溫30 ℃；進樣體積2 μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 the conditions of gradient elution

2.2 質譜條件

電噴霧電離源（ESI），正離子掃描；離子源溫度150 ℃；毛細管電壓3.4 kV；霧化氣溫度500 ℃；霧化氣流速1 000 L/h。掃描方式采用多反應監(jiān)測方式（MRM）進行掃描，離子對為239.99/221.98、239.99/147.99和239.99/165.97。

2.3 溶液的配制

精密稱取沙丁胺醇標準品10.0 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至10 mL，制成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液。溶液保存在4 ℃冰箱中。

2.4 樣品處理方法

取空白人血漿0.5 mL，加入2 mL乙腈，混勻后振蕩10 min，8 000 r/min離心20 min。取上清液過0.22 μm的濾膜后供LC-MS/MS分析。

2.5 線性關系考察

精密稱取標準品儲備液加入空白人血漿中使待測樣品濃度分別為1、5、50、100、200、500、1000 ng/mL，分別進行測定。以峰面積（y）為縱坐標，以濃度（x，ng/mL）為橫坐標作線性回歸?；貧w方程為：y=312.21x-128.15；r2=0.9991。結果表明，沙丁胺醇在濃度為1～1000 ng/mL范圍內峰面積與濃度呈線性相關，最低檢測濃度為0.1 ng/mL。

2.6 回收率和精密度實驗

取空白人血漿0.5 mL，加入一定量的沙丁胺醇，制備成沙丁胺醇濃度為5.0、50.0 、500.0 ng/mL的樣品，利用相同的方法處理后供LC-MS/MS檢驗，結果三種濃度下沙丁胺醇的回收率分別為76.8 %、85.2 %和93.7 %，RSD分別為1.1 %、2.7 %和7.1 %。利用相同的方法進行測定，得到三種濃度的日內RSD分別為2.8 %、5.1 %和6.9 %，日間RSD分別為3.6 %、5.8 %和1.2 %。

2.7 穩(wěn)定性實驗

將上述制備樣品分別于0、1、5、10、24 h進行測定，以沙丁胺醇峰面積進行計算，RSD為0.52 %。結果表明，樣品在24 h內基本穩(wěn)定。

3 討論

3.1 沉淀劑的選擇

沉淀蛋白是一種快速簡單且成本較低的前處理方法，可以使用鹽溶液、重金屬、酸試劑及有機溶劑等作為沉淀劑，但是對于質譜檢驗而言，前三種會引入新的物質，影響質譜的檢驗。本實驗中選擇利用有機溶劑對水的親和力來破壞蛋白質外的水鍵，使蛋白質在等電點使產生沉淀，從而達到凈化生物檢材的目的。本實驗考察了乙腈和甲醇兩種沉淀劑，結果表明用乙腈作為沉淀劑的回收率高于甲醇，且甲醇形成沉淀較為松散，為絮狀型，易與上清液混合，從而降低了提取的回收率。乙腈形成的沉淀較為堅實，為塊狀型，附在試管底部。因而本研究選用乙腈作為沉淀劑，可以有效去除雜質，使響應靈敏，干擾變小。

3.2 色譜柱的選擇

沙丁胺醇是一種極性較強的物質，使用反相色譜柱可能會導致保留較弱。本文考察了BEH C18、HSS T3、Shield RP18以及HILIC等多種色譜柱，實驗結果表明，適用HSS T3柱色譜峰型較好，無拖尾現(xiàn)象，分離效果好。HSS T3色譜柱特別適用于反相色譜分離中增強對極性化合物和代謝物的保留。這個低配體密度C18色譜柱使分析物能更容易進入顆粒材料的孔結構中，為極性和疏水性分子提供均衡的保留性能而無需使用離子對試劑，適用于實驗中沙丁胺醇的分離檢驗。

3.3 流動相的選擇

反相作用色譜一般選用的有機溶劑為乙腈、甲醇和異丙醇，但在實驗具體的操作溫度下，異丙醇的粘度大，會使柱壓過高，因此實驗考察了甲醇和乙腈兩種流動相。在水相中，緩沖鹽的種類、濃度及水相的pH值都會影響待測物質的離子化效果，影響待測物質的保留時間和峰型，從而影響待測物質檢測的靈敏度。

本實驗考察了乙腈-水/甲醇、乙腈-水/甲酸胺、乙腈-水/甲酸/甲酸胺、甲醇-水/甲酸、甲醇-水/甲酸胺、甲醇-水/甲酸/甲酸胺體系作為流動相，緩沖鹽甲酸胺濃度為5 mmoL/L，甲酸的濃度為0.1 %。實驗結果表明，乙腈的分離度和穩(wěn)定性不如甲醇，甲醇的峰型較好，靈敏度較高，因此選用甲醇作為最終的有機相。通過對比各流動相體系的峰型、出峰時間、分離度及穩(wěn)定性，最終選擇甲醇-水/ 0.1 %甲酸作為流動相。

3.4 質譜條件的優(yōu)化

質譜條件是利用儀器的自動優(yōu)化程序進行參數(shù)的自動優(yōu)化，檢測的離子源選擇電噴霧電離源（ESI），在上述的色譜條件和質譜條件下，選擇多反應離子檢測模式（MRM），將標準品溶液進樣分析，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能，選擇三對信號強、干擾小的離子對作為定性離子對，在其中選擇響應較高的作為定量離子對。

沙丁胺醇100 ng/mL的標準品溶液在2.2的實驗條件下，采用多反應離子檢測模式進樣進行分析。分子式為C13H21NO3，分子量為239.31，在樣品進入質譜后，儀器在給定的參數(shù)下改變碰撞能量，通過自動檢測程序給出穩(wěn)定的基峰離子m/z239.99，基峰離子作為母離子進入二級質譜產生三個子離子碎片m/ z221.98、m/z147.99和m/z165.97，選擇其中豐度較高的m/z147.99子離子作為定量離子。

4 結論

本研究建立了利用乙腈直接提取的方法結合LC-MS/MS測定人血漿中沙丁胺醇的方法，該方法回收率高，重現(xiàn)性好，檢測限低，且操作簡單快速，適用于臨床和相關案件中沙丁胺醇的定性定量檢測。利用該方法實施了涉及沙丁胺醇非法使用案件中沙丁胺醇的檢驗鑒定，結果從受害者血漿中檢出沙丁胺醇（圖1）。

圖1 血漿中沙丁胺醇的LC-MS/MS色譜圖Fig 1 LC-MS/MS of salbutamol in plasma

［1］秦永平，鄒遠高，梁茂植，等. 反相高效液相色譜紫外檢測法測定血漿中沙丁胺醇濃度［J］. 中國藥學雜志，2000，35（7）：45-47.

［2］ Huang J D, Lin Q, Zhang X M, et al. Electrochemical immunosensor based on polyaniline／poly（acrylic acid）and Auhybrid graphene nanocomposite for sensitivity enhanced detection of salbutamol［J］. Food Res Int, 2011, 44(1): 92-97.

［3］ Zhang D J, Teng Y N, Chen K G, et al. Determination of salbutamol in human plasma and urine using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr, 2012, 26(10):1176-1182.

［4］ Yan H Y, Wang R L, Han Y H, et al. Screening, recognition and quantitation of salbutamol residues in ham sausages by molecularly imprinted solid phase extraction coupled with highperformance liquid chromatography-ultraviolet detection［J］. Journal of Chromatography B, 2012, 900:18-23.

［5］ Li C, Wu Y L, Yang T, et al. Simultaneous determination of clenbuterol, salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］. Journal of Chromatography A,2010,1217 (50):7873-7877.

［6］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部) ［Z］. 北京:化學工業(yè)出版社, 2005: 842-843.

Determination of Salbutamol in Human Plasma by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LUAN Yujing1, QIN Huakai2, WANG Ruihua1, DONG Ying1, DU Hongyan1
(1.Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing, 100038, China 2. Institute of Forensic Science of Liu Zhou Municipal Public Security Bureau, Liuzhou, 545001, China)

ObjectiveTo develop a UPLC-MS/MS method for determining salbutamol in human plasma.MethodsThe separation of salbutamol was performed on a column of HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）. The mobile phase consisted of water solution containing 0.1 % formic acid and methanol. The fow rate was 0.6 mL/min with gradient elution. Salbutamol in human plasma was determined by UPLC-MS/MS.ResultsThe standard curve was linear over the range of 1-1000 ng/mL, and the lowest detectable limit was 0.1 ng/mL. The absolute recovery was more than 70 %. Both of the intra- and interday precision was within 10 % at three concentrations.ConclusionThe procedure was fully validated in terms of sensitivity, selectivity, precision and accuracy. The method developed was applied to the determination of salbutamol in human plasma samples collected from salbutamol-poisoning cases.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; human plasma; salbutamol

DF795.1

A

1008-3650(2016)06-0467-003

2016-06-30

格式：欒玉靜，覃華開，王瑞花，等. 液相色譜-質譜法檢驗人血漿中的沙丁胺醇[J]. 刑事技術，2016,41(6): 467-469.

10.16467/j.1008-3650.2016.06.009

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項基金計劃項目（No:2013JB009）

欒玉靜（1979—），女，山東龍口人，博士，副研究員，研究方向為毒物檢驗鑒定。E-mail:18836705@qq.com